Name: electrically conductive scaffold to modulate and deliver stem cells
Uploaded: 2018-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells at JoVE.com

אנו מודים Andreasson קטי ד ר (מחלקת נוירולוגיה ו נוירולוגיות המדע, אוניברסיטת סטנפורד) לשימוש של המכונה לרביעיית-PCR. העבודה נתמכה על ידי נבחרת מוסדות של בריאות מענקים K08NS098876 (ל P.M.G.) בתר של סטנפורד הספר לרפואה דין (כדי ריח רע).

כל תאי גזע והתהליכים בעלי חיים, אושרו על ידי ועדת הפיקוח מחקר תאי הגזע של סטנפורד על ידי פאנל ניהול באוניברסיטת סטנפורד על מעבדה חיה על עצמך (SCRO-616 ו APLAC-31909).
1. תחריט של זכוכית ITO
<ol><li>להכין את תחמוצת בדיל אינדיום (ITO)-שקופיות זכוכית מכוסה על ידי הנחת סוכן מיסוך בצד ואטימה של הזכוכית. הערה: מרבית הקלטות שקוף יכול לשמש כמסכה.<ol>
<li>להסיר את המסכה עודף באמצעות להב, להשאיר רק את הצורה הרצויה של העיצוב הסופי של איטו מכוסה על הזכוכית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לשלב 5% (v/v) של חומצה חנקתית 45% (v/v) של HCl ב גביע זכוכית בתוך ברדס fume להכין את הפתרון תחריט.<ol>
<li>השתמש צלחת חמה, מד חום כדי להבטיח כי הטמפרטורה של תחריט הפתרון נשמר ב- 70 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol>
</li>
	<li>מרגע שהתמיסה איכול 70 מעלות צלזיוס, למקם את השקופית רעולי פנים-ITO זכוכית בתוך תמיסת למשך 2 דקות להסיר את שכבת איטו עודף. הערה: הקלטת מיסוך מגן השכבה איטו החשיפה תמיסה חומצית.</li>
	<li>הסר את השקופית של הפתרון, לשטוף אותו עם יונים (DI) H2O.</li>
	<li>הסר בזהירות את ההתנגדות מסכת ולמדוד באמצעות multimeter על מנת להבטיח כי קריטון שנותרו ללא פגע. המפרט של חרוט באזור הרצוי צריך להיות כ 0 Ω.</li>
</ol>2. הכנת פירול פתרון
<ol><li>בבקבוק זכוכית 1000 מ ל, להמיס 70 גר' נתרן dodecylbenzenesulfonate (NaDBS) ב- 600 מ"ל של DI H2O.</li>
	<li>ברגע NaDBS מחוסלת, להוסיף 14 מ"ל של פירול 0.2 מ' ו- mL 386 DI H2O הפתרון.</li>
	<li>לכסות את הפתרון עם רדיד אלומיניום ולאחסן ב 4 º C.</li>
</ol>3. electroplating של Polypyrrole על זכוכית ITO
<ol><li>לחמם את הפתרון פירול לטמפרטורת החדר עד NaDBS הוא redissolved באופן מלא. הערה: זה לוקח בערך 15-20 דקות.</li>
	<li>שופכים 25 מ של הפתרון פירול לתוך גביע.</li>
	<li>להתחבר הזכוכית איטו חרוט multimeter ויציפו את השקופית לתוך הפתרון פירול.<ol>
<li>ודא כי הצד בהתנגדות Ω 0 פונה לכיוון האלקטרודה הפניה רשת פלטינה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>החל זרם חשמלי ליזום electroplating של PPy על פני השטח איטו באמצעות של multimeter (שוטף נשלטת על אמא/ס מ 32 למשך 4 שעות).</li>
	<li>הסר את הזכוכית איטו multimeter ואת כביסה electroplated-PPy DI H2O כדי להסיר שאריות חומרים פעילי שטח.</li>
	<li>ניתוק בעדינות את הצלחת electroplated PPy מהזכוכית איטו באמצעות סכין גילוח.<ol>
<li>אחסן את הצלחת PPy בטמפרטורת החדר.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. הכנת Polydimethylsiloxane (PDMS)
<ol><li>בעזרת מרית וקערית שוקלים, לערבב 18 גרם של סוכן הבסיס עם דור 2 של ריפוי סוכן, שופכים את התערובת לתוך תבניות זכוכית שני 10 ס"מ 8 ס"מ.</li>
	<li>הסר את הבועות התבניות באמצעות תא ואקום במשך 15-20 דקות.</li>
	<li>מניחים את התבניות בתנור 70 מעלות צלזיוס במשך 3 שעות.</li>
	<li>לאחר מקורר, להשתמש במרית שטוחה כדי להסיר את PDMS מן התבניות.</li>
</ol>5. ייצור לשכת גירוי חשמלי במבחנה
<ol><li>אוטוקלב לוחות מתכת (WxL, 2.5 ס"מ x 12.5 ס"מ) ואת זרימת שסתומים ב 120 מעלות צלזיוס במשך שעה.</li>
	<li>באמצעות שקופית קאמרית כתבנית, לחתוך שתי חתיכות של PDMS. הערה: חתיכה אחת של PDMS משמש להיקף של התא לתא עם מגזרות של שני ריבועים צמודים מ בתוך תא התא. החלק השני PDMS היא חלוקה של השטח של התא.<ol>
<li>לחתוך החוצה הבתוך תא קאמרית כך שהוא מרובע בצורת ומתאימה את הצורה של התא לתא. ודא כי הצורה הכללית של שני החלקים של PDMS הוא מלבני המתאים של השקופית קאמרית.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שכבה של החומרים כמו הבאות מלמטה למעלה: (1), לוחית מתכת (2) PDMS (ללא עמלות), (3) PPy צלחת (בניצב PDMS), (4) PDMS (עם מגזרות), ו- (5) תא קאמרית.</li>
	<li>תהדק את המנגנון ביחד ברגע שיהיה מיושר לגמרי.</li>
	<li>לחתוך שתי פיסות 60 ס מ של חוט מתכת ולהשתמש הדבק כסף לחבר חוט אחד בכל קצה של צלחת PPy המגיחה מתוך החלק החיצוני של החדר. ודא החוטים מספיק זמן כדי להאריך מן המנגנון אל מחוץ אינקובטור.</li>
	<li>לאחר ההדבקה כסף הוא נרפא, לחזק, לאטום את החיבור חוט עם אפוקסי.<ol>
<li>להקליט את ההתנגדות משתמש multimeter כדי לוודא כי השדה יישומית הוא זהה בכל אחד.</li>
		<li>להשתלה, להסיר את החוטים; unclamp התאים תא, PDMS, ולאחר מכן אותם להפריד לגרדום מוליך. המימד של פיגומים מושתל הוא בערך 1 מ מ x 3 מ"מ x 0.25 מ"מ.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. ציפוי האנושי עצבית ובתאים (hNPCs) ב- PPy
<ol><li>לעקר את התאים מורכבים תחת אור UV למשך שעתיים.<ol>
<li>לאחר שעה אחת, לסובב את שהורכב צ'יימברס 90°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר עיקור, מעיל השטח של PPy בחלק התחתון של החדר עם 800 µL של מצע ציפוי ולאפשר את המצע שבמהלכו בצלחת PPy בתוך אינקובטור ב 37 ° C-5% CO2 לשעה.</li>
	<li>לאחר שעה אחת, הסר את תגובת שיקוע של צ'יימברס, לשטוף בעדינות עם 1 מ"ל של DPBS + Ca + Mg לכל טוב. הערה: להימנע לשטוף את פני השטח של PPy בכוח כמו זה יגרום להתנתקות המצע ציפוי.</li>
	<li>באמצעות מדיה תא טריים, מכנית מביצועם בתרבית תאים לשימוש עם התאים מצלחת תרביות רקמה עם pipetting עדין. הערה: תאים צריך להיות 90-100% confluent על דיסוציאציה.</li>
	<li>לאסוף את כדורי hNPC באמצעות צנטריפוגה ב 8000 x g במשך 5 דקות.</li>
	<li>שימוש של hemocytometer, לספור, resuspend את התאים בווליום של תאים/ס מ 100,0002.</li>
	<li>צלחת 100,000 התאים לתא בכל טוב (100,000 תאים/cm2 ב 1 מ"ל של מדיה).</li>
	<li>לחזור צ'יימברס חממה-37 מעלות צלזיוס ב-5% CO2-
</li>
</ol>7. גירוי חשמלי של hNPCs
<ol><li>יום אחד לאחר זריעה התאים על התאים, השתמש מחולל גל כדי להחיל גירוי חשמלי לתאים.</li>
	<li>לפני גירוי, להסיר מדיה זקן אחד טוב, לחדש עם 800 µL של התקשורת טריים.</li>
	<li>לאחר שינוי בתקשורת, במקום התאים בחזרה לתוך החממה, להרחיב את החוטים מתוך החממה, לצרף אותם גנרטור גל</li>
	<li>להחיל את הגירוי התאים עם אות גל מרובע ב mV ±400 עם 100 הרץ לשעה.</li>
	<li>לאחר הגירוי, להסיר את החוטים, תקופת דגירה של התא להוצאה של עוד יום בתוך אינקובטור להגדיר ב 37 ° C עם 5% CO2.</li>
	<li>לבצע לאחר מכן ניתוח הביולוגי כולל הכדאיות התא, כמותיים בזמן אמת תגובת שרשרת פולימראזית (PCR לרביעיית) ע פ הפרוטוקול של היצרן.</li>
</ol>8. in Vivo PPy השרשה
<ol><li>מבצע דיסטלי עורק המוח התיכון (dMCA) סגר קו הדגמים תא T לקויה למבוגרים זכר עירום חולדות (NIH-RNU 230 ± 30 g) כפי שתוארה קודם לכן2. ביצוע ההשתלה שבוע אחד פוסט-dMCA סגר.</li>
	<li>יום אחד לפני הניתוח, לתת אמפיצילין (1 מ"ג/מ"ל) לעכברושים במים הכלוב שלהם.</li>
	<li>עזים ומתנגד העכברוש באמצעות לשכת אינדוקציה 0.5 - 3% מ"ג/ק"ג של איזופלוריין מנוהל באמצעות אינהלציה.</li>
	<li>לאשר ההרדמה של העכברוש על ידי חוסר תגובת רפלקס של קמצוץ הבוהן.<ol>
<li>בעוד החיה תחת הרדמה, להמשיך לפקח שלה ממברנה צבע דפוס הנשימה, טמפרטורה רקטלית כל 15 דקות.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר ההרדמה הוא אישר, החל דמעות מלאכותיות על עיני עכברוש למניעת יובש.</li>
	<li>ודא כי הטכניקה aseptic תישמר במהלך הליך זה על-ידי שימוש בכפפות סטריליות, מאסו כירורגי סטרילי13. לשמור על כלי כירורגי סטרילי בתוך שדה סטרילי.</li>
	<li>בעוד העכברוש הוא בהרדמה, תרגיל של craniectomy מעל קליפת המוח השמאלי. פתח את השכבה הקשה של המוח.<ol>
<li>הסר את הדורה המוח באמצעות מחט דק מיקרו כירורגי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>שתל פיגומים מוליך ממערכת במבחנה על גבי קליפת חולדה. הערה: לניסויים שלנו, אנחנו מושתלים פיגומים מיום במבחנה 3 לאחר ציפוי hNPC.<ol>
<li>למקם את השתל בעיקר על קליפת penumbral המדיאלי כדי הנגע שבץ.</li>
	</ol>
</li>
	<li>לאחר לגרדום מושם, הצב surgicel מעל השתל כדי למנוע תנועה עם העור סגירה.</li>
	<li>לתפור הפצע סגור, subcutaneously להחדיר את החולדות. הבופרנורפין SR במינון של 1 מ ג/ק ג כדי לנהל את הכאב קשור dMCA סגר ובבית stereotaxic.</li>
	<li>מקום העכברוש בכלוב שחזור זה להכרתו.<ol>
<li>לעולם לא תעזוב את החיה ללא התערבות כשהוא מחוסר הכרה.</li>
		<li>אין למקם את החיה עם אחרים עד מלא זכה להכרה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>יפקח חיות מדי יום עבור סימנים של כאב כולל ירידה במשקל הגוף, צריכת מזון ירידה/מים, המעיל פרוע/לטפח מופחתת, ירד/מוגברת פעילות ספונטנית, יציבה נורמלית, התייבשות/עור להקים אוהל, עיניים שקועות, מסתור, השחתה עצמית נשימה מהירה נשימה בפה פתוח, מתעוות, רועדת, רעד, הניקוד.<ol>
<li>לנטר את החיות מדי יום עד שיופיע כי הם לאכול, לשתות, טיפוח, לעלות במשקל; ואז שבועי לאחר עלייה במשקל.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Euthanization מוקדמת דרך שאיפת2 CO ואישור משני euthanization (על מנת להבטיח את החיה לא ישוב כתוצאה מהשאיפה של2 CO פוסט של חמצן נורמלית האספקה) יחולו כל חיה שמופיע כדי לא לאכול, לשתות, לעלות במשקל לאחר ההליך הכירורגי הראשוני; מופיע כאב; או מופיעה אפשרות להשלים את הבדיקות התנהגותיות עקב גדול יותר מאשר צפוי גירעון של קורטקס מוטורי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Moskowitz, M. A., Lo, E. H., Iadecola, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Science+of+Stroke:+Mechanisms+in+Search+of+Treatments.">The Science of Stroke: Mechanisms in Search of Treatments.</a> Neuron. 67 (2), 181-198 (2010).</li><li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Preconditioning+of+Stem+Cells+with+a+Conductive+Polymer+Scaffold+Enhances+Stroke+Recovery.">Electrical Preconditioning of Stem Cells with a Conductive Polymer Scaffold Enhances Stroke Recovery.</a> Biomaterials. 142, 31-40 (2017).</li><li>Steinberg, G. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+Outcomes+of+Transplanted+Modified+Bone+Marrow-Derived+Mesenchymal+Stem+Cells+in+Stroke:+A+Phase+1/2a+Study.">Clinical Outcomes of Transplanted Modified Bone Marrow-Derived Mesenchymal Stem Cells in Stroke: A Phase 1/2a Study.</a> Stroke. 47 (7), 1817-1824 (2016).</li><li>George, P. M., Steinberg, G. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+Stroke+Therapeutics:+Unraveling+Stroke+Pathophysiology+and+Its+Impact+on+Clinical+Treatments.">Novel Stroke Therapeutics: Unraveling Stroke Pathophysiology and Its Impact on Clinical Treatments.</a> Neuron. 87 (2), 297-309 (2015).</li><li>Schabitz, W. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Intravenous+Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Enhances+Poststroke+Sensorimotor+Recovery+and+Stimulates+Neurogenesis.">Intravenous Brain-Derived Neurotrophic Factor Enhances Poststroke Sensorimotor Recovery and Stimulates Neurogenesis.</a> Stroke. 38 (7), 2165-2172 (2007).</li><li>Liauw, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondins+1+and+2+Are+Necessary+For+Synaptic+Plasticity+and+Functional+Recovery+After+Stroke.">Thrombospondins 1 and 2 Are Necessary For Synaptic Plasticity and Functional Recovery After Stroke.</a> J Cereb Blood Flow Metab. 28 (10), 1722-1732 (2008).</li><li>Cantu, D. A., Hematti, P., Kao, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+Encapsulating+Biomaterial+Regulates+Mesenchymal+Stromal/Stem+Cell+Differentiation+and+Macrophage+Immunophenotype.">Cell Encapsulating Biomaterial Regulates Mesenchymal Stromal/Stem Cell Differentiation and Macrophage Immunophenotype.</a> Stem Cells Translational Medicine. 1 (10), 740-749 (2012).</li><li>Chaudhuri, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydrogels+with+Tunable+Stress+Relaxation+Regulate+Stem+Cell+Fate+and+Activity.">Hydrogels with Tunable Stress Relaxation Regulate Stem Cell Fate and Activity.</a> Nat Mater. 15 (3), 326-334 (2016).</li><li>Ballios, B. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Hyaluronan-Based+Injectable+Hydrogel+Improves+the+Survival+and+Integration+of+Stem+Cell+Progeny+following+Transplantation.">A Hyaluronan-Based Injectable Hydrogel Improves the Survival and Integration of Stem Cell Progeny following Transplantation.</a> Stem Cell Reports. 4 (6), 1031-1045 (2015).</li><li>Mothe, A. J., Tam, R. Y., Zahir, T., Tator, C. H., Shoichet, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repair+of+the+Injured+Spinal+Cord+by+Transplantation+of+Neural+Stem+Cells+in+a+hyaluronan-based+hydrogel.">Repair of the Injured Spinal Cord by Transplantation of Neural Stem Cells in a hyaluronan-based hydrogel.</a> Biomaterials. 34 (15), 3775-3783 (2013).</li><li>Saini, M., Singh, Y., Arora, P., Arora, V., Jain, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Implant+Biomaterials:+A+Comprehensive+Review.">Implant Biomaterials: A Comprehensive Review.</a> World J Clin Cases. 3 (1), 52-57 (2015).</li><li>Huang, Y., Li, Y., Chen, J., Zhou, H., Tan, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrical+Stimulation+Elicits+Neural+Stem+Cells+Activation:+New+Perspectives+in+CNS+Repair.">Electrical Stimulation Elicits Neural Stem Cells Activation: New Perspectives in CNS Repair.</a> Front Hum Neurosci. 9, (2015).</li><li>Pritchett-Corning, K. R., Mulder, G. B., Luo, Y., White, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+of+Rodent+Surgery+for+the+New+Surgeon.">Principles of Rodent Surgery for the New Surgeon.</a> J Vis Exp. (47), (2011).</li><li>Abdelwahid, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+Cell+Death+and+Survival+in+Heart+Regeneration+and+Repair.">Stem Cell Death and Survival in Heart Regeneration and Repair.</a> Apoptosis. 21 (3), 252-268 (2016).</li><li>Wang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Clinical+Status+of+Stem+Cell+Therapy+for+Ischemic+Cardiomyopathy.">The Clinical Status of Stem Cell Therapy for Ischemic Cardiomyopathy.</a> Stem Cells Int. 2015, (2015).</li><li>George, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fabrication+and+Biocompatibility+of+Polypyrrole+Implants+Suitable+for+Neural+Prosthetics.">Fabrication and Biocompatibility of Polypyrrole Implants Suitable for Neural Prosthetics.</a> Biomaterials. 26 (17), 3511-3519 (2005).</li><li>Aravamudan, B., Thompson, M., Pabelick, C., Prakash, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Induces+Proliferation+of+Human+Airway+Smooth+Muscle+Cells.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Induces Proliferation of Human Airway Smooth Muscle Cells.</a> J Cell Mol Med. 16 (4), 812-823 (2012).</li><li>Lopes, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrombospondin+2+Regulates+Cell+Proliferation+Induced+by+Rac1+Redox-Dependent+Signaling.">Thrombospondin 2 Regulates Cell Proliferation Induced by Rac1 Redox-Dependent Signaling.</a> Mol Cell Biol. 23 (15), 5401-5408 (2003).</li><li>Ploughman, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-Derived+Neurotrophic+Factor+Contributes+to+Recovery+of+Skilled+Reaching+After+Focal+Ischemia+in+Rats.">Brain-Derived Neurotrophic Factor Contributes to Recovery of Skilled Reaching After Focal Ischemia in Rats.</a> Stroke. 40 (4), 1490-1495 (2009).</li><li>Baker, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induced+Pluripotent+Stem+Cell-Derived+Neural+Stem+Cell+Therapy+Enhances+Recovery+in+an+Ischemic+Stroke+Pig+Model.">Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Neural Stem Cell Therapy Enhances Recovery in an Ischemic Stroke Pig Model.</a> Sci Rep. 7 (1), 10075 (2017).</li><li>Bacigaluppi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neural+Stem+Cell+Transplantation+Induces+Stroke+Recovery+by+Upregulating+Glutamate+Transporter+GLT-1+in+Astrocytes.">Neural Stem Cell Transplantation Induces Stroke Recovery by Upregulating Glutamate Transporter GLT-1 in Astrocytes.</a> J Neurosci. 36 (41), 10529-10544 (2016).</li></ol>

המחברים יש שאין ניגודי אינטרסים להצהיר עם עבודה זו.

גדל ראיות הוכיחה את ההבטחה של תאי גזע כטיפול קו הרומן. הבטחה זו הובילה מאמץ גדול כדי להתקדם תאי גזע הרפוי המיטה לפחות 40 הניסויים הקליניים מתמשכים או שהושלמו. קו פתולוגיה מציע הפרעה נוירולוגית ייחודי זה הוא משאיל את עצמו טיפול בתאי גזע כי לאחר העלבון חריפה, שום תהליך ניווניות מניעת שחזור. המנגנון המדויק של התאוששות משופרת תאי גזע שבץ עדיין לא ברור. אנגיוגנזה, synaptogenesis וסינפטית שיפוץ כל הוכחו להיות חשוב. כאשר מולקולות חשוב עבור סינפסה היווצרות כגון BDNF ו- THBS-1 אינן מוסרות, קו שחזור הוא לקוי6,19. hNPCs השתפרו שחזור פונקציונלי לאחר שבץ בבעלי חיים רבים20,21. המנגנון של hNPCs אפקט שרידים לא הבנתי, שיטת המשלוח אידיאלי עבור תאים אלה אינו ידוע. על ידי פיתוח מערכת המאפשר אחד כדי לתפעל מולקולות חשוב שוחררה מבית hNPCs, אחד יכול לעזור להבדיל את מנגנוני התאוששות אינטגרלי ולמטב את טיפול בתאי גזע.
תא מוצלחת משלוח אל המוח נשאר אתגר. כיום, מספר טכנולוגיות אלו פותחו מערכות פיגומים biomaterial שונים לספק בתאי גזע כדי לשפר את ההישרדות ושילוב של תאי גזע9,10. עם זאת, בשל המאפיינים אינרטי של חומרים אלה, קשה לווסת את תאי הגזע לאחר ההשתלה שלהם.
מאמר זה מתאר שיטה באמצעות לפיגום PPy חשמלית לתפעל את transcriptome של hNPCs, כפי שמוצג על ידי קולטנים upregulation של BDNF ו- THBS-1 בהנתונים שלנו לרביעיית-PCR. המחקר הקודם שלנו גילה כי עלייה בביטוי VEGFA על hNPCs, לאחר חשיפה גירוי חשמלי פונקציונלי שחזור משופר לאחר קו2. כאן אנחנו מדגימים שאת neurotrophic נוספים גורמים כגון BDNF ו- THBS-1 גם מאופנן לאחר חשיפה גירוי חשמלי בקו תא hNPC שונים, מראה כי המערכת שלנו יכולה לשמש עם שורות תאים רבים.
במהלך ייצור לשכת גירוי חשמלי במבחנה , חיוני כי החוט מתכת לגמרי מחובר לצלחת PPy באמצעות כסף צבע אפוקסי. אם חיבור זה הוא לא קול, היא גורמת שדות חשמליים שונים אפילו עם אותם פרמטרים. יתר על כן, לעיתים התקשורת עלול לדלוף לאחר ההרכבה של מערכת פיגומים. כדי לפתור בעיה זו, ניתן להחיל משחה ואקום כדי לאטום את הרווח בין את PDMS ואת PPy לצלחת עם טיפול לא תחול פני זורעות תא. מגבלה אחת בשל אופיו שאינם שקופים של צלחת PPy הוא בדיקת confluency של תאים עם מיקרוסקופ אור רגיל הוא מוגבל.
היתרון של השיטה המתוארת ב פרוטוקול זה מאפשר אפנון של hNPCs כדי לקבוע את השינויים מכניסטית של התאים. כיום, אפנון חשמל לא היה פנה באמצעות הידרוג קונבנציונאלי או מערכות פיגומים אינרטי. לאחר גירוי חשמלי באמצעות לגרדום PPy, hNPCs יכולים להינתן ללא הסרת מהמשטח פולימר למודל ויוו . פיתוח שיטות ללמוד עוד דגמים מחלה של תאי גזע יישומים מאפשר לנו עיצוב טוב יותר translational יישומים. הגישה preconditioning חשמל, מתאפשרת על ידי מערכת פולימר מוליך, שניתן להחיל על סוגי תאים שונים ומאפשר הבנה טובה יותר של ההשפעה של גירוי חשמלי על תא. היכולת לייעל את תאי במבחנה , אז בלי עוד מניפולציה (כגון passaging או הסרת) מאפשר בדיקה של אלה מניפולציות במבחנה בויוו מצבי מחלה כגון שבץ מוחי. המטרה היא לנצל את טכניקות חדשות, כגון לגרדום פולימר מוליך המתואר, כדי לקדם קו הרפוי ולשפר את ההבנה של מנגנונים שחזור שבץ.

שבץ מוחי הוא הסיבה המובילה השניה של מוות בעולם, הגורם המוביל החמישי המוות בארצות הברית. למרות אלה שיעורי התמותה גבוהים, טיפולים להחלמה שבץ נותרו כיום אתגר עם אפשרויות רפואי קיימא זמין כעת1. כרגע יש כ 300 ניסויים קליניים העוסקים שבץ איסכמי, מהם 40 רק לנצל את תאי גזע. מחקרים קודמים הראו כי תאי הגזע טיפולים יש השפעה מיטיבה על קו-תיקון-2,-3. גורמים Paracrine כמו neurotrophic המוח-derived factor (BDNF) ו- thrombospondin-1 (THBS-1) שוחררו המושתלים האנושי עצבית ובתאים (hNPCs) הראו התאוששות פונקציונליות משופרת באמצעות מנגנונים הקשורים עם עלייה סינפסה היווצרות, אנגיוגנזה, מסעף דנדריטים, תחזיות עצב חדשים, כמו גם הכוח ויסות מערכת החיסון4,5,6. עם זאת, השיטות אספקה אופטימלים של תאי גזע נשארים חמקמקים.
משלוח מוצלח בתאי גזע המוח נשאר אתגר. כיום, הידרוג להזרקה ומערכות פיגומים פולימריים הוכנסו להעביר תאי גזע. שיטות משלוח אלה להגן על תאי גזע במהלך ההשתלה, כמו גם להציע הגנה מפני הקשים שלאחר שבץ כולל תגובה דלקתית של המחשב המארח, תנאים ובשפתיים-7,-8,-9 , 10. עם זאת, החומרים הנפוצים הם ללא ניע, אשר מגביל את השימוש אפנון רציפה (קרי, גירוי חשמלי) של תאים11. גירוי חשמלי הוא רמז המשפיע בידול, יון ערוץ צפיפות ו- neurite המוצלח תאי גזע12. לעומת פולימרים אינרטי, פולימרים מוליכים יכול לשאת הנוכחי המאפשר גירוי חשמלי ומניפולציה של תאי גזע2. עם זאת, המנגנון המדויק שבו גירוי חשמלי ממיקרו neurotrophic גורם לשחרור (קרי, BDNF ו- THBS-1) הוא חקר עדיין לא לגמרי.
ב פרוטוקול זה, אנו מתארים את השלבים כדי לבנות מערכת התרבות התא המורכב לפיגום פולימר מוליך, polypyrrole (PPy), המאפשר במבחנה גירוי חשמלי. בשל האופן שבו מערכת התרבות התא הוא מפוברק, אפשרי בהמשך השרשת לגרדום נזרע תאי גזע על גבי קליפת פרי-לאוטם. למערכת זו, אנחנו חשמלית כתנאי תאי גזע על הגרדום פרק זמן קצר לפני ההשתלה. בעקבות גירוי חשמלי, לגרדום פולימר מוליך נושא את התאים בהצלחה קטנטנים intracranially באמצעות שיטת פולשנית.

<table><tbody><tr><td>FGF-Basic</td><td>Invitrogen</td><td>CTP0261</td><td>20 ng/mL for working media</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>cb40234a</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>LIF Protein, Recom. Hum. (10 &amp;micro;g/mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>LIF1010</td><td>10 ng/mL for working media</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone 3.9 kg</td><td>Fisherbrand</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA56-4</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical</td><td>Fisherbrand</td><td>SA95</td><td></td></tr><tr><td>ITO Glass</td><td>Delta Technologies</td><td>CG-40IN-0115</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecylbenzenesulfonate</td><td>Sigma</td><td>289957-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma</td><td>131709-500ML</td><td>Protect pyrrole solution from light and room temperature</td></tr><tr><td>8 well glass slide chambers</td><td>Thermo Sci Nuc&amp;nbsp;</td><td>125658</td><td>Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions</td></tr><tr><td>Flat-Surface Bracket, 3&quot;x1&quot;</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>1030A4</td><td></td></tr><tr><td>TWO PART SILVER PAINT 14G</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>1264214</td><td>Mix two parts (1:1) in plastic plate</td></tr><tr><td>DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red</td><td>Genesse&amp;nbsp;</td><td>25-508C</td><td></td></tr><tr><td>AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit</td><td>Aruna Biomedical&amp;nbsp;</td><td>ABNS7013.2</td><td></td></tr><tr><td>hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit</td><td>Aruna Biomedical&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;hNP7013.1</td><td></td></tr><tr><td>Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32&quot; to 5/8&quot; Tube OD</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>5330K22</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Keysight&amp;nbsp;</td><td>E3641A</td><td></td></tr><tr><td>Wavefoam generator</td><td>Keysight</td><td>33210A-10MHz</td><td></td></tr><tr><td>Pt meshes</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>298107-425MG</td><td>Reference electrode with dimensions, 1x1 cm</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Hs02718934_s1</td><td></td></tr><tr><td>THBS1</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Hs00962908_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder (250)</td><td>Qiagen</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 &amp;micro;L rxns</td><td>BIORAD</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>4369510</td><td></td></tr><tr><td>7-8 Week Old, male, RNU Rats</td><td>NCI-Frederick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Ethicon Silk Suture</td><td>eSutures.com</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Surgicel Original Absorbable Hemostat</td><td>Ethicon</td><td>1952</td><td></td></tr><tr><td>Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&amp;nbsp;Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves</td><td>Fisherbrand</td><td>19-063-130</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Drape</td><td>Medline</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades</td><td>Fisherbrand</td><td>53-34</td><td></td></tr><tr><td>Walter Stern Scalpel Blade Series 300</td><td>Fisherbrand</td><td>17-654-456</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484642</td><td></td></tr><tr><td>Frazier Micro Dissecting Hook</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-2706</td><td></td></tr></tbody></table>

electrically conductive scaffold to modulate and deliver stem cells

טיפול בתאי גזע התפתחה משיכת מרגש טיפולית, אך שיטת אספקה אופטימלים נשאר לא ברור. בעוד בטכניקה של microinjection שימש במשך עשרות שנים כדי לספק תאי גזע במודלים שבץ, טכניקה זו מוגבל על ידי חוסר היכולת לתפעל את תאי הגזע לפני ההזרקה. מאמר זה מפרט שיטה של שימוש בפיגומים פולימר מוליך חשמלי של תאי גזע למסירה. גירוי חשמלי של תאי גזע באמצעות לפיגום פולימר מוליך הפיצולים של התא גזע גנים המעורבים ב הישרדות cell, תגובה דלקתית ו שיפוץ סינפטית. לאחר preconditioning חשמליים, תאי גזע על הגרדום מושתלים intracranially במודל חולדה סגר דיסטלי עורק המוח התיכון. פרוטוקול זה מתאר טכניקה חזקה לתמרן תאי גזע דרך לפיגום פולימר מוליך ויוצר כלי חדש כדי להמשיך ולפתחו טיפול המבוסס על תאי גזע.

התרשים המוצג באיור 1 מייצג את זרימת העבודה הכוללת של גירוי חשמלי של hNPCs והיישומים פוטנציאלית במורד הזרם. מגבלה הנוכחי של טיפול בתאי גזע הוא כי תאי גזע נחשפים סביבת שלאחר השתלת קשים כולל דלקת ותנאים איסכמי. אלה התנאים הקשים סביר להגביל את היעילות הטיפולית14,15. השימוש לפיגום מוליך על hNPCs מפני סביבה זו עשוי להגדיל את היתרונות הטיפוליים hNPCs דרך preconditioning חשמל. הצעד הראשון בטכניקה זו מסירה תאי גזע הוא התפתחות לפיגום מוליך באמצעות מטוס2,אלקטרוליטי הגישה16. אנו שאפיינה את הביו פיגומים, אופטימיזציה המאפיינים החשמליים preconditioning עם hNPCs. פקדים הוגדרו unstimulated תאי גזע גדל על צלחת תרביות רקמה.
המתחים השונים הוערכו כדי לקבוע את הבטיחות של גירוי חשמלי וכדי למקסם את היעילות preconditioning. כדי להבטיח כי השדה יישומית תהיה זהה בכל אחד, resistivity לשכת שהורכב נמדדה באמצעות multimeter (התנגדויות (אוהם, Ω) של צ'יימברס היו כ 10 kΩ, resistivity≈3 Ωm). לפי הספק מסחרי, הראו hNPCs בשימוש אין cytotoxicity משמעותי במערכות תרבות נורמלי. hNPCs עם או בלי חשיפה גירוי חשמלי היו מוכתמים תא הכדאיות מבחני (Live: ירוקים; המתים: אדום) (איור 2). תוצאות אלו מצביעות על כי hNPCs היו קיימא לאחר גירוי חשמלי (mV ±400, 100 הרץ לשעה). לאימות וזמינותו הכדאיות תא, ביצענו תא הכדאיות בדיקת שימוש assay resazurin. התוצאות גם להוכיח אין cytotoxicity משמעותית של גירוי חשמלי ב- hNPCs.
הנתונים שלנו אין ויוו הקודמים הוכיח כי גורמים paracrine שוחררה מבית hNPCs (SD56, NPCs שמקורם בתאי גזע עובריים) עם חשיפה גירוי חשמלי לשפר את ההתאוששות לאחר קו2. כדי לחקור יותר גורמים המועמד ידוע להיות חשוב בהחלמה שבץ משתחררים מן hNPC (ביו ארונה, NPCs שמקורם בתאי גזע עובריים), הוערכו BDNF ו- THBS-1. גורמים אלה נחקרו בהרחבה בשל התפקיד שמילאו תוצר עצביים ולהגדיל -לתא אינטראקציות17,18. כדי לחקור את היעילות של גירוי חשמלי על שינויים transcriptome BDNF ו- THBS-1, לרביעיית-PCR בוצעה כולל גנים BDNF ו- THBS-1 עם GAPDH כמו גן משק בית. µG כ 1 של RNA הכולל היה הפוך-עיבד לתוך cDNA לפי הפרוטוקול של היצרן. קיפול מנורמל-שינוי יחס חושבו בשיטה ΔΔCt השוואה בין גנים hNPCs על PPy, hNPCs על PPy עם חשיפה גירוי חשמלי. ניתוח סטטיסטי הראה upregulations משמעותית בביטוי הגנים של BDNF ו- THBS-1 בין קבוצות שהיו חשמלית גירוי מותנה (p ≤0.01) (איור 3). נתונים אלה עולה שאופטימיזציה אפשרית למקסם את יעילות hNPC ללא מוות בתא משמעותיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig1.jpg"> איור 1 . במבחנה פולימר מוליך מערכת לגרדום סטימולציה חשמלית. (א) תא שקופית מונחת על גבי צלחת PPy. (B) התרשים מראה הזיוף של התא גירוי חשמלי במבחנה עם hNPCs מצופה על פני השטח של PPy. זרימה שסתומים משמשים כדי להחזיק את התא שקופיות, PDMS, PPy, מתכת צלחת ביחד. (ג) תמונה של החדר. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig2.jpg"> איור 2 . תא assay הכדאיות ב hNPCs עם או בלי גירוי חשמלי. (א) גרף הממחיש תא חי מוכתם Calcein-am. נתונים שהוצגו הם זאת אומרת ± ש; n = 4. (B) התא assay הכדאיות באמצעות resazurin. גרף מציגה שהיה לא cytotoxicity של גירוי חשמלי-hNPCs; n = 4. (ג) תמונות של תא הכדאיות assay לפני ואחרי טיפול גירוי חשמלי. אות ירוק מציין תאים חיים (Calcein-am), ואילו האות אדום מציין תאים מתים (EtHD-1). ES מצביע על גירוי חשמלי. ES + או - מצביע על נוכחות או היעדרות של גירוי חשמלי על תאים. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig3.jpg"> איור 3 . שינויים בביטוי הגנים עם גירוי חשמלי- גרף הממחיש מקפלים שינויים ג'ין ביטויים של BDNF (א) ו- THBS1 (B) hNPCs (* * מציין משמעותי סטטיסטית בין חשמלית preconditioned וכל שאר הקבוצות, p < 0.01, שגיאה ברים הצג ש; n = 4, חד-כיווני אנובה ). שלילי מציין את הפקד שבו התאים היו תרבותי על צלחת רגילה תרביות רקמה. ES + או - מצביע על נוכחות או היעדרות של גירוי חשמלי על תאים. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells at JoVE.com

Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות מרדית

מוליכות חשמלית לגרדום לווסת ולהעביר תאי גזע

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

electrically-conductive-scaffold-to-modulate-and-deliver-stem-cells

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Views.  Stanford University School of Medicine. פרוטוקול זה מתאר פבריקציה נוספת של מערכת התרבות התא כדי לאפשר זריעה של תאי גזע על גרדום פולימר מוליך ועבור במבחנה גירוי חשמלי העוקבים ויוו השרשה של לגרדום נזרע תאי הגזע באמצעות מרדית

Video: Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

שימוש בתאי גזע לשחזור עצם Perivascular

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

הנדסת רקמות: בנייה תאית 3D פיגום למשלוח גיליונות סלולריים שכבות

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

אופטימיזציה של קובץ מצורף של תאי גזע mesenchymal האדם על פולי (ε-caprolactone) חוטים electrospun

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Electrospun nanofiber פיגומים עם דרגות בארגון סיבים

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

צבירת Cell מגנטי גזע 3D והתבגרות Bioreactor להתחדשות סחוס

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

גירויים חשמליים ומכניים בו זמנית כדי לשפר את פוטנציאל Cardiomyogenic של תאים

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

בנייה ושימוש חדר גירוי חשמלי לשיפור Osteogenic התמיינות בתאי גזע Mesenchymal/סטרומה במבחנה

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

הכנת למימדי מיקרותאי מטריצה מטריצות להערכת Schwann מפרט Cell

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

מידול אלמנט סופי של מיקרו-סביבה חשמלית תאית

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Optimizing Extracellular Vesicle Delivery Using a Core-Sheath 3D-Bioprinted Scaffold for Chronic Wound Management

This study outlines a detailed protocol for the fabrication of core-sheath 3D-bioprinted scaffolds designed to enhance chronic wound healing. The protocol involves isolating extracellular vesicles (EVs) from mesenchymal stem cells (MSCs), known for their regenerative and immunomodulatory properties. These EVs are then incorporated into a unique scaffold structure. The scaffold features a core composed of alginate loaded with EVs, surrounded by a sheath made of carboxymethyl cellulose and alginate lyase. This innovative design ensures controlled scaffold degradation while promoting efficient and controlled release of EVs at the wound site. The protocol covers key steps, including the preparation and characterization of the EVs, the formulation of bio-inks for 3D bioprinting, and the optimization of printing parameters to achieve the desired core-sheath architecture. By combining structural integrity and bioactivity, the scaffold aims to address the limitations of conventional wound dressings, offering a targeted approach to accelerate tissue regeneration and reduce inflammation in chronic wounds. This method provides a reproducible and scalable strategy for developing advanced biomaterials with potential clinical applications in chronic wound management. The protocol also highlights critical considerations for achieving consistent results, ensuring adaptability for future therapeutic applications.

This study presents a protocol for fabricating core-sheath 3D-bio-printed scaffolds for chronic wound healing. Extracellular vesicles are isolated from mesenchymal stem cells, and loaded into the core (alginate) with the sheath made from carboxymethyl cellulose and alginate lyase. This design allows controlled scaffold degradation and efficient EVs release.

אופטימיזציה של אספקת שלפוחית חוץ-תאית באמצעות פיגום מודפס בתלת-ממד במעטפת ליבה לטיפול בפצעים כרוניים

This study outlines a detailed protocol for the fabrication of core-sheath 3D-bioprinted scaffolds designed to enhance chronic wound healing. The protocol ...