Name: electrically conductive scaffold to modulate and deliver stem cells
Uploaded: 2018-04-13T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 49 s
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Wir danken Dr. Kati Andreasson (Abteilung für Neurologie und neurologische Science, Stanford University) für den Einsatz der qRT-PCR-Maschine. Die Arbeit wurde durch nationale Institute der Gesundheit Stipendien K08NS098876 (zu P.M.G.) und der Stanford School of Medicine Dean Postdoctoral Fellowship (, b.o.) unterstützt.

Alle Stammzellen und tierischen Verfahren wurden von Stanfords Stem Cell Research Oversight Committee und von Stanford University Verwaltungs-Panel auf Laboratory Animal Care (SCRO-616 und APLAC-31909) genehmigt.
(1) Ätzen von ITO-Glas
<ol><li>Vorbereiten der Indium-Zinn-Oxid (ITO)-überdachte Objektträger indem man einen Maskierung-Agent über die leitende Seite des Glases. Hinweis: Die meisten kommerziellen transparente Bänder können als Maskierung Agent verwendet werden.<ol>
<li>Entfernen Sie die überschüssige Maske mit einer Klinge, so dass nur die gewünschte Form des endgültigen ITO Design auf dem Glas abgedeckt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Kombinieren Sie 5 % (V/V) von Salpetersäure und 45 % (V/V) von HCl in ein Becherglas in einer Dampfhaube, Radierung Lösung vorzubereiten.<ol>
<li>Verwenden Sie eine Herdplatte und ein Thermometer, um sicherzustellen, dass die Temperatur der Radierung Lösung bei 70 ° c gehalten wird</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald die Radierung Lösung 70 ° C erreicht, legen Sie die maskiert-ITO-Glas-Folie in die Lösung für 2 Minuten, um die überschüssige ITO-Schicht zu entfernen. Hinweis: Masking Tape schützt die ITO-Schicht vor der Exposition gegenüber sauren Lösung.</li>
	<li>Entfernen Sie die Folie aus der Lösung und spülen Sie ihn mit entionisiertem (DI) H2O.</li>
	<li>Entfernen Sie vorsichtig die Maske und Maßnahme Widerstand mit einem Multimeter um sicherzustellen, dass die verbleibenden ITO intakt ist. Auslesen von den gewünschten geätzten Bereich sollte ungefähr 0 Ω.</li>
</ol>2. Vorbereitung des Pyrrol-Lösung
<ol><li>Lösen Sie in einem 1000-mL-Glasflasche 70 g Natrium-Dodecylbenzenesulfonate (NaDBS auf) in 600 mL DI H2O.</li>
	<li>Wenn die NaDBS aufgelöst ist, fügen Sie 14 mL 0,2 M Pyrrol und 386 mL DI H2O der Projektmappe hinzu.</li>
	<li>Die Lösung mit Alufolie abdecken und bei 4 ° c Lagern</li>
</ol>(3) Galvanik von Polypyrrol auf ITO Glas
<ol><li>Erwärmen Sie die Pyrrol-Lösung auf Raumtemperatur, bis NaDBS voll Bodensatz ist. Hinweis: Dies dauert etwa 15 bis 20 Minuten.</li>
	<li>Gießen Sie 25 mL der Pyrrol-Lösung in ein Becherglas.</li>
	<li>Das geätzte ITO-Glas mit einem Multimeter verbinden und die Folie in die Pyrrol-Lösung eintauchen.<ol>
<li>Stellen Sie sicher, dass die Seite mit 0 Ω Widerstand gegen die Bezugselektrode Platin Netz zeigt.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Wenden Sie einen elektrischen Strom um Galvanisierung von Wiedersehen auf der ITO-Oberfläche mit einem Multimeter (aktuell bei 3 mA/cm2 für 4 Stunden kontrolliert) zu initiieren.</li>
	<li>Entfernen Sie das ITO-Glas aus der multimeter und waschen galvanisiert-Wiedersehen in DI H2O, passives Tensid zu entfernen.</li>
	<li>Lösen Sie sanft die galvanisiert PPy Platte aus dem ITO Glas mit einer Rasierklinge.<ol>
<li>Lagern Sie die PPy Platte bei Raumtemperatur.</li>
	</ol>
</li>
</ol>4. Vorbereitung der Polydimethylsiloxan (PDMS)
<ol><li>Mit einem Spatel und eine Schüssel wiegen, 18 g des Basis-Agents mit 2 g härter mischen und den Teig in zwei 10 cm x 8 cm Glasformen.</li>
	<li>Entfernen Sie die Luftblasen aus den Formen mit einer Vakuumkammer für 15-20 Minuten.</li>
	<li>Legen Sie die Formen in einem 70 ° C Backofen für 3 h.</li>
	<li>Sobald Sie abgekühlt, einem Spatel flach die PDMS aus den Formen entfernen.</li>
</ol>5. Herstellung von In-vitro- Elektrostimulation Kammer
<ol><li>Autoklaven die Metallplatten (WxL, 2,5 cm x 12,5 cm) und den Fluss Ventile bei 120 ° C für 1 Stunde.</li>
	<li>Schneiden Sie eine Kammer-Folie als Vorlage verwenden, zwei Stücke von PDMS. Hinweis: Einteiler des PDMS dient als der Rand der Zelle Kammer mit Ausschnitten von zwei angrenzenden Quadrate von innerhalb der Zelle Kammer. Das andere Stück PDMS ist eine Gliederung der Kammer Perimeter.<ol>
<li>Schneiden Sie das innere Zelle Kammer damit es quadratisch ist geformt und entspricht der Form der Zelle Kammer. Sicherstellen Sie, dass die allgemeine Form der beiden Stücke von PDMS rechteckig ist und der der Kammer-Folie entspricht.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Schicht der Materialien wie folgt von unten nach oben: (1) Metall-Platte, (2) PDMS (ohne Ausschnitte), (3) PPy Platte (senkrecht zur PDMS), (4) PDMS (mit Ausschnitten) und (5) Zelle Kammer.</li>
	<li>Klemmen Sie den Apparat zusammen, sobald sie vollständig ausgerichtet ist.</li>
	<li>Schneiden Sie zwei 60 cm Stücke aus einem Metalldraht und mit Silberpaste einen Draht an jedem Ende der PPy Platte befestigen, die von außen der Kammer ragt. Stellen Sie sicher, dass die Kabel lang genug sind, um aus der Vorrichtung an der Außenseite der Inkubator zu verlängern.</li>
	<li>Sobald die Silberpaste geheilt ist, zu verstärken und die Drahtverbindung mit Epoxidharz zu versiegeln.<ol>
<li>Notieren Sie den Widerstand mit einem Multimeter um sicherzustellen, dass das angewandte Feld das gleiche in jeder Kammer ist.</li>
		<li>Entfernen Sie für die Implantation die Kabel; muss die Zelle Kammern und PDMS und dann sie getrennt von dem leitenden Gerüst. Die Dimension der implantierten Gerüste ist ca. 1 x 3 x 0,25 mm.</li>
	</ol>
</li>
</ol>6. plating menschlichen neuronalen Vorläuferzellen (hNPCs) auf Wiedersehen
<ol><li>Sterilisieren Sie die zusammengesetzten Kammern unter UV-Licht für 2 Stunden.<ol>
<li>Nach 1 Stunde, drehen Sie den versammelten Kammern 90°.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nach Sterilisation Mantel der Oberfläche der PPy an der Unterseite der Kammer mit 800 µL eines Substrats, Beschichtung und das Substrat, auf Wiedersehen-Platte in einem Inkubator bei 37 ° C um 5 % CO2 für 1 h zu festigen.</li>
	<li>Entfernen Sie nach 1 Stunde den überstand von Kammern und sanft Spülen mit 1 mL des DPBS + Ca + Mg pro Bohrloch. Hinweis: Vermeiden Sie, waschen die Oberfläche des PPy mit Nachdruck als die Ablösung des Substrats Beschichtung dadurch.</li>
	<li>Trennen Sie mit Frischzellen-Media, mechanisch kultivierte Zellen für den Einsatz mit den Kammern aus einer Gewebekultur-Platte mit sanften pipettieren. Hinweis: Zellen sollte 90-100 % Zusammenfluss bei Dissoziation.</li>
	<li>Sammeln Sie hNPC Pellets mit Zentrifugation bei 8000 X g für 5 Minuten.</li>
	<li>Mit einer Hemocytometer, zählen und Aufschwemmen der Zellen bei einem Volumen von 100.000 Zellen/cm2.</li>
	<li>Platte 100.000 Zellen in jeder Kammer gut (100.000 Zellen/cm2 in 1 mL der Medien).</li>
	<li>Zurück Kammern zum Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2.
</li>
</ol>7. die elektrische Stimulation von hNPCs
<ol><li>Einen Tag nach der Aussaat verwenden die Zellen auf die Kammern einen Wellenform-Generator elektrischen Stimulation der Zellen anwenden.</li>
	<li>Vor Stimulation auch jede Kammer alte Medien entnehmen und mit 800 µL frische Medien ergänzen.</li>
	<li>Nachdem die Medien geändert werden, setzen Sie die Kammern wieder in den Inkubator, erweitern Sie die Drähte aus dem Inkubator und bringen Sie sie zu einem Waveform-generator</li>
	<li>Wenden Sie die Stimulation auf die Zellen mit einem Rechtecksignal bei ±400 mV mit 100 Hz für 1 h.</li>
	<li>Entfernen Sie nach der Stimulation die Kabel und inkubieren Sie die Kammern für einen weiteren Tag im Inkubator bei 37 ° C mit 5 % CO2eingestellt.</li>
	<li>Führen Sie nachfolgende biologische Analyse einschließlich Zellviabilität und quantitative Real-Time Polymerase-Kettenreaktion (qRT-PCR) nach der Hersteller-Protokolls.</li>
</ol>8. in Vivo PPy Implantation
<ol><li>Führen Sie distale mittlere zerebrale Arterie (dMCA) Okklusion Schlaganfall Modelle auf T-Zell-defizienten Erwachsene männlichen nackte Ratten (NIH-RNU 230 ± 30 g) wie zuvor beschrieben2. Durchführen Sie Implantation einer Woche Post-dMCA Okklusion.</li>
	<li>Geben Sie einen Tag vor der Operation Ampicillin (1 mg/mL), die Ratten in ihrem Käfig Wasser.</li>
	<li>Betäuben Sie die Ratte in eine Induktion Kammer mit 0,5 - 3 % mg/kg Isofluran per Inhalation verabreicht.</li>
	<li>Bestätigen Sie Anesthetization der Ratte durch einen Mangel an Zehe Prise reflex Antwort.<ol>
<li>Während das Tier in Narkose ist, weiterhin seine Membran Farbe, Atmung und rektale Temperatur überwachen alle 15 Minuten.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Sobald Anesthetization bestätigt wurde, gelten Sie künstliche Tränen in Augen der Ratte um Trockenheit zu verhindern.</li>
	<li>Sicherstellen Sie, dass aseptischer Technik während dieses Verfahrens beibehalten wird, mithilfe von sterilen Handschuhen und ein steriles op-Tuch-13. Halten Sie sterile chirurgische Instrumente in einem sterilen Bereich.</li>
	<li>Während die Ratte unter Narkose ist, Bohren Sie ein kraniektomien oberhalb der linken Cortex. Öffnen Sie die Dura.<ol>
<li>Die Dura Mater aus dem Gehirn mit einer Mikro-dünne chirurgische Nadel zu entfernen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Implantat-leitfähige Gerüste aus in-vitro- System auf die Ratte Kortex. Hinweis: Für unsere Experimente implantiert wir Gerüste von in-vitro- Tag 3 nach hNPC Beschichtung.<ol>
<li>Legen Sie das Implantat in erster Linie auf der Halbschattenphase Kortex medial der Schlaganfall-Läsion.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Nachdem das Gerüst platziert ist, legen Sie Surgicel über dem Implantat, Bewegung mit Haut-Verschluss zu verhindern.</li>
	<li>Naht die Wunde geschlossen und subkutan injizieren die Ratten mit Buprenorphin SR in einer Dosierung von 1 mg/kg, die Schmerzen im Zusammenhang mit der stereotaktischen Chirurgie und dMCA Okklusion zu verwalten.</li>
	<li>Legen Sie die Ratte in einem Käfig Erholung, wie es das Bewusstsein wiedererlangt.<ol>
<li>Lassen Sie das Tier nicht unbeaufsichtigt während er bewusstlos ist.</li>
		<li>Legen Sie das Tier mit anderen nicht, bis es vollständig Bewusstsein erlangt hat.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Beobachten Sie Tiere täglich auf Anzeichen von Schmerzen einschließlich Körper Gewichtsverlust, verminderte Essen/Wasseraufnahme, reduzierte Pflege/ungepflegten Mantel, spontane Aktivität verringert/erhöht, abnorme Körperhaltung, Dehydrierung/Haut Zelten, eingefallenen Augen, versteckt, Selbstverstümmelung, schnelle Atmung, offenen Mund atmen, Zuckungen, Zittern, Tremor und Vokalisation.<ol>
<li>Beobachten Sie die Tiere täglich bis es erscheint, dass sie essen, trinken, Pflege, und Gewichtszunahme; und dann wöchentlich nach Gewicht zu gewinnen.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Frühen Euthanization über CO2 Inhalation und eine sekundäre Bestätigung des Euthanization (um sicherzustellen, das Tier wird nicht durch normale Versorgung Post CO2 Sauerstoffinhalation wieder beleben) erfolgt für jedes Tier, das scheint nicht zu essen, trinken und Gewichtszunahme nach dem ersten chirurgischen Eingriff; erscheint in Schmerz; oder erscheint nicht in der Lage, die Verhaltensstörungen Tests durch eine größer als motorische Kortex Defizit erwartet abgeschlossen.</li>
</ol>

<ol>
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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte, mit dieser Arbeit zu erklären.

Immer mehr Hinweise hat das Versprechen von Stammzellen als eine neuartige Schlaganfall-Therapie gezeigt. Dieses Versprechen führte eine Hauptbemühung, Stammzell-Therapie um das Krankenbett mit mindestens 40 laufenden oder abgeschlossenen klinischen Studien zu gelangen. Schlaganfall-Pathologie bietet eine einzigartige neurologische Störung, die eignet sich für Stammzell-Therapie, weil nach der akuten Beleidigung gibt es keine Neurodegenerative Prozess, d.h. die Wiederherstellung. Der genaue Mechanismus der Stammzellen erhöht Schlaganfall Erholung bleibt unklar. Angiogenese, Synaptogenese und synaptischen Umbau nachweislich alle wichtig sein. Wenn wichtige Moleküle für Synapse Bildung wie BDNF und THBS-1 entfernt werden, ist Schlaganfall Erholung beeinträchtigt6,19. hNPCs verbesserten funktionellen Erholung nach Schlaganfall in zahlreichen Tiermodellen20,21. Die Mechanismen der hNPCs Wirkung noch nicht vollständig verstanden, und die ideale Versandart für diese Zellen ist unbekannt. Durch die Entwicklung eines Systems, das es erlaubt, wichtige Moleküle, die aus dem hNPCs entlassen zu manipulieren, kann einer helfen die integrale Wiederherstellungsmechanismen differenzieren und optimieren Stammzell-Therapie.
Erfolgreiche Zelle Lieferung an das Gehirn bleibt eine Herausforderung. Derzeit haben eine Reihe von Technologien entwickelt, mit verschiedenen Biomaterial-Gerüst-Systeme liefern Stammzellen um das Überleben und die Integration von Stammzellen9,10zu verbessern. Aufgrund der inerten Eigenschaften dieser Materialien ist es jedoch schwierig, Stammzellen nach ihrer Transplantation zu modulieren.
Dieser Artikel beschreibt eine Methode mit einem Wiedersehen Gerüst, um das Transkriptom des hNPCs elektrisch zu manipulieren, dargestellt durch die Hochregulierung des BDNF und THBS-1 in unserem qRT-PCR-Daten. Unsere früheren Studie ergab, dass eine Erhöhung VEGFA Expression auf hNPCs nach Belastung durch elektrische Stimulation funktionelle Erholung nach Schlaganfall2verbessert. Hier zeigen wir, dass dieser zusätzliche neurotrophen Faktoren wie BDNF und THBS-1 auch moduliert werden nach Belastung durch elektrische Stimulation in einer unterschiedlichen hNPC Zelllinie zeigen, dass unser System mit zahlreichen Zelllinien verwendet werden kann.
Während der Herstellung der in-vitro- Elektrostimulation Kammer ist es wichtig, dass der Metalldraht komplett mit PPy Platte mit Silberfarbe und Epoxy verbunden ist. Wenn diese Verbindung nicht gesund ist, bewirkt, dass es unterschiedliche elektrische Felder sogar mit den gleichen Parametern. Darüber hinaus können zeitweise Medien nach der Montage das Gerüstsystem austreten. Um dieses Problem zu beheben, kann Vakuum Fett angewendet werden, um den Abstand zwischen dem PDMS und PPy Platte mit Sorgfalt nicht anzuwenden auf die Zelle-säen Oberfläche zu versiegeln. Eine Einschränkung aufgrund der undurchsichtigen PPy Platte ist, dass Check-Cells Konfluenz mit standard Lichtmikroskopie begrenzt ist.
Der Vorteil der in diesem Protokoll beschriebenen Methode ermöglicht Modulation des hNPCs um die mechanistischen Änderungen der Zellen zu ermitteln. Derzeit hat elektrische Modulation nicht mit herkömmlichen Hydrogel oder inerten Gerüstsysteme genähert. Nach der elektrischen Stimulation mit dem Wiedersehen Gerüst können die hNPCs ohne Entnahme aus der Polymer-Oberfläche zu einem in-Vivo -Modell geliefert werden. Entwicklung von Methoden, Krankheitsmodelle Stammzell-Anwendungen weiter zu studieren ermöglicht es, besseres Design translationale Anwendungen. Der elektrische preconditioning Ansatz, ermöglicht durch die leitfähige Polymer-System kann auf verschiedene Zelltypen angewendet werden und ermöglicht für ein besseres Verständnis der Auswirkungen der Elektrostimulation auf eine Zelle. Die Möglichkeit, Zellen in Vitro zu optimieren und dann ohne weitere Manipulation (z. B. passagierung oder Entfernung) zur Prüfung von diesen in-vitro- Manipulationen bei in Vivo Krankheitszuständen wie Schlaganfall. Das ultimative Ziel ist, neue Techniken, wie der beschriebenen leitfähiges Polymer Gerüst, Schlaganfall-Therapie und Verbesserung des Verständnisses der Schlaganfall Wiederherstellungsmechanismen zu nutzen.

Der Schlaganfall ist die zweithäufigste Ursache des Todes in der Welt und die fünfthäufigste Todesursache in den Vereinigten Staaten. Trotz dieser hohen Todesraten bleiben Behandlungen für Schlaganfall Erholung derzeit eine Herausforderung mit derzeit keine praktikable medizinische Möglichkeiten1. Derzeit gibt es über 300 klinische Studien, die der Umgang mit ischämischen Schlaganfällen, von denen nur 40 Stammzellen nutzen. Frühere Studien haben gezeigt, dass Stammzell-Therapien eine positive Wirkung auf Schlaganfall Reparatur2,3 haben. Parakrine Faktoren wie Brain-derived Neurotrophic Factor (BDNF) und Thrombospondin-1 (THBS-1) von transplantierten menschliche neurale Vorläuferzellen (hNPCs) freigegeben haben verbesserte Funktionelle Wiederherstellung durch Mechanismen verbunden mit einer Zunahme gezeigt. Synapse, Bildung, Angiogenese, dendritische Verzweigung und neue axonalen Projektionen sowie modulieren das Immunsystem4,5,6. Die optimalen Methoden der Stammzellen bleiben jedoch schwer.
Erfolgreiche Stammzell-Lieferung an das Gehirn bleibt eine Herausforderung. Derzeit, wurden injizierbaren Hydrogel und Polymere Gerüst-Systeme eingeführt, um Stammzellen zu liefern. Diese Liefermethoden schützen Stammzellen während der Transplantation sowie bieten Schutz vor der rauen nach Schlaganfall-Umgebung, einschließlich des Gastgebers Entzündungsreaktion und hypoxischen Bedingungen7,8,9 , 10. jedoch die am häufigsten verwendeten Materialien sind inert, die schränkt die Verwendung von kontinuierlichen Modulation (d.h. elektrische Stimulation) der Zellen11. Elektrostimulation ist ein Stichwort, der Differenzierung, Kanal Ionendichte und Neurit Auswuchs der Stammzellen12beeinflusst. Im Vergleich zu inerten Polymeren können leitfähige Polymeren tragen ein aktueller erlaubt für elektrische Stimulation und Manipulation von Stammzellen2. Der genaue Mechanismus, durch den elektrischer Stimulation Neurotrophic Factor Release (z.B. BDNF und THBS-1) moduliert, ist jedoch noch nicht vollständig erforscht.
In diesem Protokoll beschreiben wir die Schritte, um ein Zellkultursystem bestehend aus leski leitfähiges Polymer Polypyrrol (PPy), die für in-vitro- elektrische Stimulation ermöglicht zu konstruieren. Aufgrund der Art und Weise, in der das Zellkultursystem hergestellt wird, ist die spätere Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst auf der Peri-Infarkt Kortex möglich. Für dieses System Voraussetzung wir elektrisch Stammzellen auf dem Gerüst für einen kurzen Zeitraum vor der Implantation. Im Anschluss an elektrische Stimulation wird das leitfähige Polymer Gerüst tragen die Zellen erfolgreich implantiert intracranially mit einer minimal-invasive Methode.

<table><tbody><tr><td>FGF-Basic</td><td>Invitrogen</td><td>CTP0261</td><td>20 ng/mL for working media</td></tr><tr><td>Matrigel</td><td>Corning</td><td>cb40234a</td><td>1:200 dilution</td></tr><tr><td>LIF Protein, Recom. Hum. (10 &amp;micro;g/mL)</td><td>EMD Millipore</td><td>LIF1010</td><td>10 ng/mL for working media</td></tr><tr><td>Sylgard 184 silicone 3.9 kg</td><td>Fisherbrand</td><td>NC0162601</td><td></td></tr><tr><td>Hydrochloric acid</td><td>Fisherbrand</td><td>SA56-4</td><td></td></tr><tr><td>Nitric Acid Concentrate (Certified) ACS, Fisher Chemical</td><td>Fisherbrand</td><td>SA95</td><td></td></tr><tr><td>ITO Glass</td><td>Delta Technologies</td><td>CG-40IN-0115</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dodecylbenzenesulfonate</td><td>Sigma</td><td>289957-1KG</td><td></td></tr><tr><td>Pyrrole</td><td>Sigma</td><td>131709-500ML</td><td>Protect pyrrole solution from light and room temperature</td></tr><tr><td>8 well glass slide chambers</td><td>Thermo Sci Nuc&amp;nbsp;</td><td>125658</td><td>Detach the cell chamber and keep it under sterilized conditions</td></tr><tr><td>Flat-Surface Bracket, 3&quot;x1&quot;</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>1030A4</td><td></td></tr><tr><td>TWO PART SILVER PAINT 14G</td><td>Electron Microscopy Sciences&amp;nbsp;</td><td>1264214</td><td>Mix two parts (1:1) in plastic plate</td></tr><tr><td>DPBS, 1x, with Ca and Mg, No Phenol Red</td><td>Genesse&amp;nbsp;</td><td>25-508C</td><td></td></tr><tr><td>AB2 ArunA Neural Cell Culture Media Kit</td><td>Aruna Biomedical&amp;nbsp;</td><td>ABNS7013.2</td><td></td></tr><tr><td>hNP1 Human Neural Progenitor Expansion Kit</td><td>Aruna Biomedical&amp;nbsp;</td><td>&amp;nbsp;hNP7013.1</td><td></td></tr><tr><td>Noncontact Flow-Adjustment Valve, Nickel-Plated Brass, for 3/32&quot; to 5/8&quot; Tube OD</td><td>McMaster-Carr&amp;nbsp;</td><td>5330K22</td><td></td></tr><tr><td>Multimeter</td><td>Keysight&amp;nbsp;</td><td>E3641A</td><td></td></tr><tr><td>Wavefoam generator</td><td>Keysight</td><td>33210A-10MHz</td><td></td></tr><tr><td>Pt meshes</td><td>Sigma-Aldrich&amp;nbsp;</td><td>298107-425MG</td><td>Reference electrode with dimensions, 1x1 cm</td></tr><tr><td>LIVE/DEAD Viability/Cytotoxicity Kit, for mammalian cells</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>L3224</td><td></td></tr><tr><td>BDNF</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Hs02718934_s1</td><td></td></tr><tr><td>THBS1</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Hs00962908_m1</td><td></td></tr><tr><td>GAPDH</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>Hs02758991_g1</td><td></td></tr><tr><td>RNeasy Mini Kit (250)</td><td>Qiagen</td><td>74106</td><td></td></tr><tr><td>QIAshredder (250)</td><td>Qiagen</td><td>79656</td><td></td></tr><tr><td>RNase-Free DNase Set (50)</td><td>QIAGEN</td><td>79254</td><td></td></tr><tr><td>iScript cDNA Synthesis Kit, 100 x 20 &amp;micro;L rxns</td><td>BIORAD</td><td>1708891</td><td></td></tr><tr><td>TaqMan Gene Expression Master Mix</td><td>Thermo Fisher Scientific&amp;nbsp;</td><td>4369510</td><td></td></tr><tr><td>7-8 Week Old, male, RNU Rats</td><td>NCI-Frederick</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4-0 Ethicon Silk Suture</td><td>eSutures.com</td><td>683G</td><td></td></tr><tr><td>Isoflurane</td><td>Henry Schein</td><td>29405</td><td></td></tr><tr><td>V-1 Tabletop Laboratory Animal Anesthesia System</td><td>VetEquip</td><td>901806</td><td></td></tr><tr><td>Surgicel Original Absorbable Hemostat</td><td>Ethicon</td><td>1952</td><td></td></tr><tr><td>Lab Standard Stereotaxic Instrument, Rat</td><td>Stoelting</td><td>51600</td><td></td></tr><tr><td>Kimberly-Clark Professional&amp;nbsp;Safeskin Purple Nitrile Sterile Exam Gloves</td><td>Fisherbrand</td><td>19-063-130</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Drape</td><td>Medline</td><td>DYNJSD1092</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific&amp;nbsp;Shandon Stainless-Steel Scalpel Blade Handle, Holds No. 20-25 Blades</td><td>Fisherbrand</td><td>53-34</td><td></td></tr><tr><td>Walter Stern Scalpel Blade Series 300</td><td>Fisherbrand</td><td>17-654-456</td><td></td></tr><tr><td>QuantStudio 6 Flex Real-Time PCR System</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>4484642</td><td></td></tr><tr><td>Frazier Micro Dissecting Hook</td><td>Harvard Apparatus</td><td>52-2706</td><td></td></tr></tbody></table>

electrically conductive scaffold to modulate and deliver stem cells

Stammzell-Therapie ist als eine spannende Schlaganfall therapeutische aufgetaucht, aber die optimale Versandart bleibt unklar. Während die Technik der Mikroinjektion jahrzehntelang verwendet wurde, um Stammzellen in Takt Modelle liefern, wird diese Technik durch die mangelnde Fähigkeit der Stammzellen vor der Injektion zu manipulieren begrenzt. Dieses Dokument beschreibt eine Methode mit einem elektrisch leitfähigen Polymer Gerüst für Stammzell-Lieferung. Die elektrische Stimulation von Zellen mit einem leitfähigen Polymer Gerüst verändert die Stammzelle Gene, die in Zelle überleben, entzündliche Reaktion und synaptischen Umbau. Nach der elektrischen Vorkonditionierung, sind die Stammzellen auf dem Schafott intracranially in einem Rattenmodell distale mittlere zerebrale Arterie Okklusion transplantiert. Dieses Protokoll beschreibt eine leistungsfähige Technik um Stammzellen über ein leitfähiges Polymer Gerüst zu manipulieren und schafft ein neues Tool zur Stammzell-Therapie weiter zu entwickeln.

In Abbildung 1 gezeigten Schaltplan repräsentiert den gesamten Arbeitsablauf der elektrischen Stimulation des hNPCs und mögliche downstream-Anwendungen. Eine Strombegrenzung in Stammzell-Therapie ist, dass Stammzellen nach Transplantation Umgebungen einschließlich Entzündungen und ischämischen Bedingungen ausgesetzt sind. Diese schwierigen Bedingungen wahrscheinlich begrenzen ihre therapeutische Wirksamkeit14,15. Die Verwendung von leitfähigen leski, hNPCs aus diesem Umfeld zu schützen kann hNPCs therapeutische Vorteile durch elektrische Vorkonditionierung ergänzen. Der erste Schritt in diese Stammzellen-Lieferung-Technik ist die Entwicklung einer leitfähigen Gerüst mit einer galvanischen Ansatz2,16. Wir zeichnen sich die Gerüste Biokompatibilität und elektrische Vorkonditionierung Eigenschaften mit hNPCs optimiert. Kontrollen wurden definiert als unstimulierte Stammzellen auf einer Gewebekultur Platte gewachsen.
Verschiedene Spannungen wurden ausgewertet, um die Sicherheit der elektrischen Stimulation zu bestimmen und die preconditioning Wirksamkeit zu maximieren. Um sicherzustellen, dass das angewandte Feld gleichen in jeder Kammer, wurde der Widerstand der versammelten Kammer mit einem Multimeter gemessen (Widerstände (Ohm, Ω) der Kammern waren ca. 10 kΩ und resistivity≈3 Ωm). Nach der kommerziellen Anbieter haben die hNPCs verwendet keine signifikante Cytotoxizität in normalen Kultur Systeme gezeigt. hNPCs mit oder ohne Belastung durch elektrische Stimulation waren voller Flecken mit Zelle Lebensfähigkeit Assays (Live: grün; Dead: rot) (Abbildung 2). Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass hNPCs nach der elektrischen Stimulation (±400 mV, 100 Hz für 1 h) lebensfähig waren. Um die Zelle Lebensfähigkeit Assay zu überprüfen, haben wir die Zelle Lebensfähigkeit Tests mit einem Resazurin-Assay durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen auch keine signifikanten Zytotoxizität der elektrischen Stimulation auf hNPCs.
Unsere bisherigen in-Vivo -Daten zeigten, dass Parakrine Faktoren veröffentlicht von hNPCs (SD56, abgeleitet aus embryonalen Stammzellen NPCs) mit einer Exposition gegenüber elektrischen Stimulation die Erholung nach Schlaganfall2verbessern. Um weiter zu erforschen Kandidat Faktoren bekannt, dass Schlaganfall Erholung wichtig sein, die freigegeben werden aus hNPC (Biomedizinische Aruna, NPCs aus embryonalen Stammzellen abgeleitet), wurden BDNF und THBS-1 bewertet. Diese Faktoren wurden wegen ihrer Rolle in der neuronalen Auswuchs ausgiebig untersucht und Steigerung der Zell-Zell-Interaktionen17,18. Um die Wirksamkeit der Elektrostimulation auf Transkriptom Änderungen für BDNF und THBS-1 zu untersuchen, wurde qRT-PCR durchgeführt, einschließlich BDNF und THBS-1 Gene mit GAPDH als Zimmermädchen gen. Ca. 1 µg Gesamt-RNA wurde umgekehrt in cDNA laut Protokoll des Herstellers transkribiert. Normalisierte Falte-Änderung-Verhältnisse wurden durch ΔΔCt Methode vergleicht Genexpression in hNPCs auf Wiedersehen und hNPCs auf Wiedersehen mit einer Exposition gegenüber elektrischen Stimulation berechnet. Statistische Analyse zeigte deutliche Upregulations in der Genexpression von BDNF und THBS-1 zwischen Gruppen, die elektrisch Stimulation abhängig (p ≤0.01) waren (Abbildung 3). Diese Daten deuten darauf hin, dass Optimierung ist möglich, hNPC Wirksamkeit ohne signifikante Zelltod zu maximieren.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig1.jpg"> Abbildung 1 . In-vitro- leitfähigen Polymer Gerüst System für elektrische Stimulation. (A) eine Folie Kammer auf Wiedersehen Platte platziert ist. (B) der Schaltplan zeigt die Herstellung von in-vitro- Elektrostimulation Kammer mit hNPCs auf der Oberfläche des PPy vernickelt. Flow Ventile dienen zum halten der Folie Kammer, PDMS, Wiedersehen, und Metallplatte zusammen. (C) Bild der Kammer. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig2.jpg"> Abbildung 2 . Zelle Lebensfähigkeit in hNPCs mit oder ohne elektrische Stimulation Assay. (A) Balkendiagramm zeigt live Zelle mit Calcein-am befleckt. Daten, die dargestellt sind Mittelwert ± S.D.; n = 4. (B) Zelle Lebensfähigkeit Assay mit Resazurin. Balkendiagramm zeigt, gab es keine Zytotoxizität der elektrischen Stimulation auf hNPCs; n = 4. (C) Bilder der Zellviabilität Test vor und nach der Reizstrom Behandlung. Grünes Signal zeigt an lebenden Zellen (Calcein-am), während rotes Signal, abgestorbenen Zellen (EtHD-1 anzeigt). ES gibt elektrischen Stimulation. ES + oder - zeigt das Vorhandensein oder Fehlen der elektrischen Stimulation auf Zellen. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57367/57367fig3.jpg"> Abbildung 3 . Veränderungen der Genexpression mit elektrischer Stimulation. Balkendiagramm zeigt Falten Änderungen in gen Ausdrücken von BDNF (A) und THBS1 (B) in hNPCs (** zeigt statistisch signifikant zwischen elektrisch vorkonditionierten und alle anderen Gruppen, p < 0,01, Fehler Bars zeigen S.D.; n = 4, einfache ANOVA ). Negativer Wert gibt an das Steuerelement wo Zellen auf einem Teller regelmäßige Gewebekultur gezüchtet wurden. ES + oder - zeigt das Vorhandensein oder Fehlen der elektrischen Stimulation auf Zellen. <a href="/files/ftp_upload/57367/57367fig3large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier für eine größere Version dieser Figur.</a>

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Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von einem Zellkultursystem zu ermöglichen, Aussaat von Stammzellen auf einem leitfähigen Polymer Gerüst für in-vitro- elektrische Stimulation und anschließende in Vivo Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst mit einer minimal-invasive Technik.

Elektrisch leitfähige Gerüst zu modulieren und Stammzellen liefern

Stem cell therapy has emerged as an exciting stroke therapeutic, but the optimal delivery method remains unclear. While the technique of microinjection ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Bioengineering

12.5K Aufrufe.  Stanford University School of Medicine. Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung von einem Zellkultursystem zu ermöglichen, Aussaat von Stammzellen auf einem leitfähigen Polymer Gerüst für in-vitro- elektrische Stimulation und anschließende in Vivo Implantation von Stammzellen entkernt Gerüst mit einer minimal-invasive Technik.

Serie: Electrically Conductive Scaffold to Modulate and Deliver Stem Cells

Use of Human Perivascular Stem Cells for Bone Regeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are a FACS-sorted population of 'pericytes' (CD146+CD34-CD45-) and 'adventitial cells' (CD146-CD34+CD45-), each of which we have previously reported to have properties of mesenchymal stem cells. PSCs, like MSCs, are able to undergo osteogenic differentiation, as well as secrete pro-osteogenic cytokines1,2. In the present protocol, we demonstrate the osteogenicity of PSCs in several animal models including a muscle pouch implantation in SCID (severe combined immunodeficient) mice, a SCID mouse calvarial defect and a femoral segmental defect (FSD) in athymic rats. The thigh muscle pouch model is used to assess ectopic bone formation. Calvarial defects are centered on the parietal bone and are standardly 4 mm in diameter (critically sized)8. FSDs are bicortical and are stabilized with a polyethylene bar and K-wires4. The FSD described is also a critical size defect, which does not significantly heal on its own4. In contrast, if stem cells or growth factors are added to the defect site, significant bone regeneration can be appreciated. The overall goal of PSC xenografting is to demonstrate the osteogenic capability of this cell type in both ectopic and orthotopic bone regeneration models.

Human perivascular stem cells (PSCs) are a novel stem cell class for skeletal tissue regeneration similar to mesenchymal stem cells (MSCs). PSCs can be isolated by FACS (fluorescence activated cell sorting) from adipose tissue procured during standard liposuction procedures, then combined with an osteoinductive scaffold to achieve bone formation in vivo.

Verwenden Sie für Menschenrechte Perivaskuläre Stammzellen für die Knochenregeneration

Human perivascular stem cells (PSCs) can be isolated in sufficient numbers from multiple tissues for purposes of skeletal tissue engineering1-3. PSCs are ...

Forschung

Biotechnik

Tissue Engineering: Construction of a Multicellular 3D Scaffold for the Delivery of Layered Cell Sheets

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to assist the body in recovery and repair. For example, TE approaches may be able to attenuate heart remodeling after myocardial infarction (MI) and possibly increase total heart function to a near normal pre-MI level.4 As with any functional tissue, successful regeneration of cardiac tissue involves the proper delivery of multiple cell types with environmental cues favoring integration and survival of the implanted cell/tissue graft. Engineered tissues should address multiple parameters including: soluble signals, cell-to-cell interactions, and matrix materials evaluated as delivery vehicles, their effects on cell survival, material strength, and facilitation of cell-to-tissue organization. Studies employing the direct injection of graft cells only ignore these essential elements.2,5,6 A tissue design combining these ingredients has yet to be developed. Here, we present an example of integrated designs using layering of patterned cell sheets with two distinct types of biological-derived materials containing the target organ cell type and endothelial cells for enhancing new vessels formation in the &#8220;tissue&#8221;. Although these studies focus on the generation of heart-like tissue, this tissue design can be applied to many organs other than heart with minimal design and material changes, and is meant to be an off-the-shelf product for regenerative therapies. The protocol contains five detailed steps. A temperature sensitive Poly(N-isopropylacrylamide) (pNIPAAM) is used to coat tissue culture dishes. Then, tissue specific cells are cultured on the surface of the coated plates/micropattern surfaces to form cell sheets with strong lateral adhesions. Thirdly, a base matrix is created for the tissue by combining porous matrix with neovascular permissive hydrogels and endothelial cells. Finally, the cell sheets are lifted from the pNIPAAM coated dishes and transferred to the base element, making the complete construct.

For creation of highly organized structures of complex tissue, one must assemble multiple material and cell types into an integrated composite. This combinatorial design incorporates organ-specific layered cell sheets with two distinct biologically-derived materials containing a strong fibrous matrix base, and endothelial cells for enhancing new vessels formation.

Tissue Engineering: Aufbau eines Multizelluläre 3D Gerüst für die Lieferung von Layered Zellschichten

Many tissues, such as the adult human hearts, are unable to adequately regenerate after damage.2,3 Strategies in tissue engineering propose innovations to ...

Optimizing Attachment of Human Mesenchymal Stem Cells on Poly(&#949;-caprolactone) Electrospun Yarns

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell number. While researchers commonly reference their seeding density this does not necessarily indicate the actual number of cells that have adhered to the material in question. This is particularly the case for materials, or scaffolds, that do not cover the base of standard cell culture well plates. This study investigates the initial attachment of human mesenchymal stem cells seeded at a known number onto electrospun poly(&#949;-caprolactone) yarn after 4 hr in culture. Electrospun yarns were held within several different set-ups, including bioreactor vessels rotating at 9 rpm, cell culture inserts positioned in low binding well plates and polytetrafluoroethylene (PTFE) troughs placed within petri dishes. The latter two were subjected to either static conditions or positioned on a shaker plate (30 rpm). After 4 hr incubation at 37&#160;oC, 5% CO2, the location of seeded cells was determined by cell DNA assay. Scaffolds were removed from their containers and placed in lysis buffer. The media fraction was similarly removed and centrifuged &#8211; the supernatant discarded and pellet broken up with lysis buffer. Lysis buffer was added to each receptacle, or well, and scraped to free any cells that may be present. The cell DNA assay determined the percentage of cells present within the scaffold, media and well fractions. Cell attachment was low for all experimental set-ups, with greatest attachment (30%) for yarns held within cell culture inserts and subjected to shaking motion. This study raises awareness to the actual number of cells attaching to scaffolds irrespective of the stated cell seeding density.

This article describes a range of set-ups for seeding human mesenchymal stem cells onto materials, in this case electrospun yarns, that do not cover the base of standard culture well plates in order to maximize and quantify the number of cells that initially attach compared to the known seeding density.

Optimierung der Befestigung der humanen mesenchymalen Stammzellen auf Poly (ε-caprolacton) Elektrogesponnene Garne

Research into biomaterials and tissue engineering often includes cell-based in vitro investigations, which require initial knowledge of the starting cell ...

Electrospun Nanofiber Scaffolds with Gradations in Fiber Organization

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible applications in controlling cell morphology/orientation. Nanofiber organization is controlled with a new fabrication apparatus that enables the gradual decrease of fiber organization in a scaffold. Changing the alignment of fibers is achieved through decreasing deposition time of random electrospun fibers on a uniaxially aligned fiber mat. By covering the collector with a moving barrier/mask, along the same axis as fiber deposition, the organizational structure is easily controlled. For tissue engineering purposes, adipose-derived stem cells can be seeded to these scaffolds. Stem cells undergo morphological changes as a result of their position on the varied organizational structure, and can potentially differentiate into different cell types depending on their locations. Additionally, the graded organization of fibers enhances the biomimicry of nanofiber scaffolds so they more closely resemble the natural orientations of collagen nanofibers at tendon-to-bone insertion site compared to traditional scaffolds. Through nanoencapsulation, the gradated fibers also afford the possibility to construct chemical gradients in fiber scaffolds, and thereby further strengthen their potential applications in fast screening of cell-materials interaction and interfacial tissue regeneration. This technique enables the production of continuous gradient scaffolds, but it also can potentially produce fibers in discrete steps by controlling the movement of the moving barrier/mask in a discrete fashion.

Here, we present a protocol to fabricate electrospun nanofiber scaffolds with gradated organization of fibers and explore their applications in regulating cell morphology/orientation. Gradients with regard to physical and chemical properties of the nanofiber scaffolds offer a wide variety of applications in the biomedical field.

Elektronanofasergerüste mit Abstufungen in Fiber-Organisation

The goal of this protocol is to report a simple method for generating nanofiber scaffolds with gradations in fiber organization and test their possible ...

3D Magnetic Stem Cell Aggregation and Bioreactor Maturation for Cartilage Regeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach recently explored for the development of autologous replacements involves the differentiation of stem cells into chondrocytes. To initiate this chondrogenesis, a degree of compaction of the stem cells is required; hence, we demonstrated the feasibility of magnetically condensing cells, both within thick scaffolds and scaffold-free, using miniaturized magnetic field sources as cell attractors. This magnetic approach was also used to guide aggregate fusion and to build scaffold-free, organized, three-dimensional (3D) tissues several millimeters in size. In addition to having an enhanced size, the tissue formed by magnetic-driven fusion presented a significant increase in the expression of collagen II, and a similar trend was observed for aggrecan expression. As the native cartilage was subjected to forces that influenced its 3D structure, dynamic maturation was also performed. A bioreactor that provides mechanical stimuli was used to culture the magnetically seeded scaffolds over a 21-day period. Bioreactor maturation largely improved chondrogenesis into the cellularized scaffolds; the extracellular matrix obtained under these conditions was rich in collagen II and aggrecan. This work outlines the innovative potential of magnetic condensation of labeled stem cells and dynamic maturation in a bioreactor for improved chondrogenic differentiation, both scaffold-free and within polysaccharide scaffolds.

Chondrogenesis from stem cells requires fine tuning the culture conditions. Here, we present a magnetic approach for condensing cells, an essential step to initiate chondrogenesis. In addition, we show that dynamic maturation in a bioreactor applies mechanical stimulation to the cellular constructs and enhances cartilaginous extracellular matrix production.

3D Magnetic Stem Cell Aggregation und Bioreactor Ausreifung für Knorpelregeneration

Cartilage engineering remains a challenge due to the difficulties in creating an in vitro functional implant similar to the native tissue. An approach ...

Simultaneous Electrical and Mechanical Stimulation to Enhance Cells' Cardiomyogenic Potential

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated researchers in the stem cell and bioengineering fields to develop in vitro high-fidelity human myocardium for both basic research and clinical applications. However, the immature phenotype of cardiac cells is a limitation on obtaining tissues that functionally mimic the adult myocardium, which is mainly characterized by mechanical and electrical signals. Thus, the purpose of this protocol is to prepare and mature the target cell population through electromechanical stimulation, recapitulating physiological parameters. Cardiac tissue engineering is evolving toward more biological approaches, and strategies based on biophysical stimuli, thus, are gaining momentum. The device developed for this purpose is unique and allows individual or simultaneous electrical and mechanical stimulation, carefully characterized and validated. In addition, although the methodology has been optimized for this stimulator and a specific cell population, it can easily be adapted to other devices and cell lines. The results here offer evidence of the increased cardiac commitment of the cell population after electromechanical stimulation. Electromechanically stimulated cells show an increased expression of main cardiac markers, including early, structural, and calcium-regulating genes. This cell conditioning could be useful for further regenerative cell therapy, disease modeling, and high-throughput drug screening.

Here we present a protocol for training a cell population using electrical and mechanical stimuli emulating cardiac physiology. This electromechanical stimulation enhances the cardiomyogenic potential of the treated cells and is a promising strategy for further cell therapy, disease modeling, and drug screening.

Gleichzeitige elektrische und mechanische Stimulation, Cells Cardiomyogenic Potenzial zu steigern

Cardiovascular diseases are the leading cause of death in developed countries. Consequently, the demand for effective cardiac cell therapies has motivated ...

Construction and Use of an Electrical Stimulation Chamber for Enhancing Osteogenic Differentiation in Mesenchymal Stem/Stromal Cells In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) has been demonstrated to increase MSC osteogenic differentiation in vitro and promote bone healing in clinical settings. Here we describe the construction of an EStim cell culture chamber and its use in treating rat bone-marrow-derived MSC to enhance osteogenic differentiation. We found that treating MSCs with EStim for 7 days results in a significant increase in the osteogenic differentiation, and importantly, this pro-osteogenic effect persists long after (7 days) EStim is discontinued. This approach of pretreating MSCs with EStim to enhance osteogenic differentiation could be used to optimize bone tissue engineering treatment outcomes and, thus, help them to achieve their full therapeutic potential. In addition to this application, this EStim cell culture chamber and protocol can also be used to investigate other EStim-sensitive cell behaviors, such as migration, proliferation, apoptosis, and scaffold attachment.

Here we present a protocol for the construction of a cell culture chamber designed to expose cells to various types of electrical stimulation, and its use in treating mesenchymal stem cells to enhance osteogenic differentiation.

Bau und Betrieb von einer Kammer elektrische Stimulation zur Verbesserung der osteogene Differenzierung mesenchymaler Stammzellen/Stromazellen Zellen In Vitro

Mesenchymal stem/stromal cells (MSCs) have been used extensively to promote bone healing in tissue engineering approaches. Electrical stimulation (EStim) ...

Preparation of Tunable Extracellular Matrix Microenvironments to Evaluate Schwann Cell Phenotype Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the major glial cells of the PNS, play a vital role in promoting PNS regeneration by dedifferentiating into a regenerative cell phenotype following injury. However, the dedifferentiated state of SCs is challenging to maintain through the time-period needed for regeneration and is impacted by changes in the surrounding extracellular matrix (ECM). Therefore, determining the complex interplay between SCs and differing ECM to provide cues of regenerative potential of SCs is essential. To address this, a strategy was created where different ECM proteins were adsorbed onto a tunable polydimethylsiloxane (PDMS) substrate which provided a platform where stiffness and protein composition can be modulated. SCs were seeded onto the tunable substrates and critical cellular functions representing the dynamics of SC phenotype were measured. To illustrate the interplay between SC protein expression and cellular morphology, differing seeding densities of SCs in addition to individual microcontact printed cellular patterns were utilized and characterized by immunofluorescence staining and western blot. Results showed that cells with a smaller spreading area and higher extent of cellular elongation promoted higher levels of SC regenerative phenotypic markers. This methodology not only begins to unravel the significant relationship between the ECM and cellular function of SCs, but also provides guidelines for the future optimization of biomaterials in peripheral nerve repair.

This methodology aims to illustrate the mechanisms by which extracellular matrix cues such as substrate stiffness, protein composition and cell morphology regulate Schwann cell (SC) phenotype.

Vorbereitung von tunable Extracellular Matrix Microenvironments zur Bewertung der Schwann Cell Phänotyp Specification

Traumatic peripheral nervous system (PNS) injuries currently lack suitable treatments to regain full functional recovery. Schwann cells (SCs), as the ...

Finite Element Modelling of a Cellular Electric Microenvironment

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the mechanisms of cell response when exposed to electrical fields can therefore guide the optimization of clinical applications. In vitro experiments aim to help uncover those, offering the advantage of wider input and output ranges that can be ethically and effectively assessed. However, the advancements in in vitro experiments are difficult to reproduce directly in clinical settings. Mainly, that is because the ES devices used in vitro differ significantly from the ones suitable for patient use, and the path from the electrodes to the targeted cells is different. Translating the in vitro results into in vivo procedures is therefore not straightforward. We emphasize that the cellular microenvironment's structure and physical properties play a determining role in the actual experimental testing conditions and suggest that measures of charge distribution can be used to bridge the gap between in vitro and in vivo. Considering this, we show how in silico finite element modelling (FEM) can be used to describe the cellular microenvironment and the changes generated by electric field (EF) exposure. We highlight how the EF couples with geometric structure to determine charge distribution. We then show the impact of time dependent inputs on charge movement. Finally, we demonstrate the relevance of our new in silico model methodology using two case studies: (i) in vitro fibrous Poly(3,4-ethylenedioxythiophene) poly(styrenesulfonate) (PEDOT-PSS) scaffolds and (ii) in vivo collagen in extracellular matrix (ECM).

This paper presents a strategy for building finite element models of fibrous conductive materials exposed to an electric field (EF). The models can be used to estimate the electrical input that cells seeded in such materials receive and assess the impact of changing the scaffold's constituent material properties, structure or orientation.

Finite-Elemente-Modellierung einer zellulären elektrischen Mikroumgebung

Clinical studies show electrical stimulation (ES) to be a potential therapy for the healing and regeneration of various tissues. Understanding the ...

Optimizing Extracellular Vesicle Delivery Using a Core-Sheath 3D-Bioprinted Scaffold for Chronic Wound Management

This study outlines a detailed protocol for the fabrication of core-sheath 3D-bioprinted scaffolds designed to enhance chronic wound healing. The protocol involves isolating extracellular vesicles (EVs) from mesenchymal stem cells (MSCs), known for their regenerative and immunomodulatory properties. These EVs are then incorporated into a unique scaffold structure. The scaffold features a core composed of alginate loaded with EVs, surrounded by a sheath made of carboxymethyl cellulose and alginate lyase. This innovative design ensures controlled scaffold degradation while promoting efficient and controlled release of EVs at the wound site. The protocol covers key steps, including the preparation and characterization of the EVs, the formulation of bio-inks for 3D bioprinting, and the optimization of printing parameters to achieve the desired core-sheath architecture. By combining structural integrity and bioactivity, the scaffold aims to address the limitations of conventional wound dressings, offering a targeted approach to accelerate tissue regeneration and reduce inflammation in chronic wounds. This method provides a reproducible and scalable strategy for developing advanced biomaterials with potential clinical applications in chronic wound management. The protocol also highlights critical considerations for achieving consistent results, ensuring adaptability for future therapeutic applications.

This study presents a protocol for fabricating core-sheath 3D-bio-printed scaffolds for chronic wound healing. Extracellular vesicles are isolated from mesenchymal stem cells, and loaded into the core (alginate) with the sheath made from carboxymethyl cellulose and alginate lyase. This design allows controlled scaffold degradation and efficient EVs release.

Optimierung der extrazellulären Vesikelabgabe mit einem 3D-biogedruckten Gerüst für die Behandlung chronischer Wunden

This study outlines a detailed protocol for the fabrication of core-sheath 3D-bioprinted scaffolds designed to enhance chronic wound healing. The protocol ...