עבודה זו נתמכה על ידי NIH AI099854 ו- AI126742 למפתח.

<ol><li>Lopez, M. A. Jr, Mackler, R. M., Yoder, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Removal+of+nuclease+contamination+during+purification+of+recombinant+prototype+foamy+virus+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol+Methods%22%5BJournal%5D)">Removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase.</a> J Virol Methods. 235, 134-138 (2016).</li>
<li>Senavirathne, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Widespread+nuclease+contamination+in+commonly+used+oxygen-scavenging+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Widespread nuclease contamination in commonly used oxygen-scavenging systems.</a> Nat Methods. 12 (10), 901-902 (2015).</li>
<li>Gunn, K. H., Marko, J. F., Mondragon, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+orthogonal+single-molecule+experiment+reveals+multiple-attempt+dynamics+of+type+IA+topoisomerases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Struct+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">An orthogonal single-molecule experiment reveals multiple-attempt dynamics of type IA topoisomerases.</a> Nat Struct Mol Biol. 24 (5), 484-490 (2017).</li>
<li>Valkov, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+and+structural+characterization+of+the+integrase+from+the+prototype+foamy+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Functional and structural characterization of the integrase from the prototype foamy virus.</a> Nucleic Acids Res. 37 (1), 243-255 (2009).</li>
<li>Coffin, J. M., Hughes, S. H., Varmus, H. E. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aCoffin%2C+JM+%22Retroviruses%22">Retroviruses</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1997).</li>
<li>Li, M., Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Processing+of+viral+DNA+ends+channels+the+HIV-1+integration+reaction+to+concerted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Processing of viral DNA ends channels the HIV-1 integration reaction to concerted integration.</a> J Biol Chem. 280 (32), 29334-29339 (2005).</li>
<li>Li, M., Mizuuchi, M., Burke, T. R. Jr, Craigie, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+DNA+integration%3A+reaction+pathway+and+critical+intermediates%5BTitle%5D)+AND+%22EMBO+J%22%5BJournal%5D)">Retroviral DNA integration: reaction pathway and critical intermediates.</a> EMBO J. 25 (6), 1295-1304 (2006).</li>
<li>Sinha, S., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Recombinant+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase+exhibits+a+capacity+for+full-site+integration+in+vitro+that+is+comparable+to+that+of+purified+preintegration+complexes+from+virus-infected+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Recombinant human immunodeficiency virus type 1 integrase exhibits a capacity for full-site integration in vitro that is comparable to that of purified preintegration complexes from virus-infected cells.</a> J Virol. 79 (13), 8208-8216 (2005).</li>
<li>Goodarzi, G., Im, G. J., Brackmann, K., Grandgenett, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Concerted+integration+of+retrovirus-like+DNA+by+human+immunodeficiency+virus+type+1+integrase%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Concerted integration of retrovirus-like DNA by human immunodeficiency virus type 1 integrase.</a> J Virol. 69 (10), 6090-6097 (1995).</li>
<li>Vora, A. C., Grandgenett, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assembly+and+catalytic+properties+of+retrovirus+integrase-DNA+complexes+capable+of+efficiently+performing+concerted+integration%5BTitle%5D)+AND+%22J+Virol%22%5BJournal%5D)">Assembly and catalytic properties of retrovirus integrase-DNA complexes capable of efficiently performing concerted integration.</a> J Virol. 69 (12), 7483-7488 (1995).</li>
<li>Jones, N. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Retroviral+intasomes+search+for+a+target+DNA+by+1D+diffusion+which+rarely+results+in+integration%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Retroviral intasomes search for a target DNA by 1D diffusion which rarely results in integration.</a> Nat Commun. 7, 11409(2016).</li>
<li>JoVE Science Education Database. Basic Methods in Cellular and Molecular Biology. Separating Protein with SDS-PAGE. JoVE. , Cambridge, MA (2017).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), (2012).</li>
</ol>

המחברים אין לחשוף.

חומרים המקיימים אינטראקציה עם ה-DNA, כגון ה-DNA לתקן חלבונים, אוכלי נבלות חמצן עבור יישומים מיקרוסקופ מולקולה בודדת, או retroviral integrases, צריך להיות חופשי של זיהום חיידקי nucleases2,3. מזהמים אלה עשוי לבלבל את הפרשנות של תוצאות במהלך מבחני ביוכימית או יחיד מולקולה בצובר.
מצאנו כי נוקלאז חיידקי לעתים קרובות שותף מטהרת עם PFV IN... אולם, ב PFV יציג זיקה sepharose הפארין זה בקלות ניתן להבחנה בין מזהם חיידקי נוקלאז1. המפתח הכנת נטולת נוקלאז PFV IN הוא כימות זהיר של נוקלאז פעילות כל שבר בעקבות • תנאי מעבר צבע מן sepharose הפארין. מעבר הצבע חייב להיות רדוד במידה מספקת כדי לאפשר ההפרדה של PFV ב מ הזיהום נוקלאז; מדרג תלול לא יהיה תואם עם הפרדה יעילה. בנוסף, המצע דנ א פלסמיד צריך להיות אחוז נמוך של עיגולים רגוע כדי להפחית את הרקע של נוקלאז וזמינותו. אם המצע דנ א פלסמיד יש רקע גבוה של מעגלים רגוע, הוא לטיהור החדש של פלסמיד ה-DNA יש לבצעו. נוקלאז פעילות וזמינותו מגלה הנוכחות של מזהמים נוקלאז ושברים זה צריכים להיות מושלך.
במקרים מסוימים, ייתכן גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה (שניות) שיטה יעילה להסרת נוקלאז מזהמים2. קבוצות קודמות השתמשו שניה במהלך טיהור של PFV ב4. שניה יש חלל אחסון בנפח מוגבל, נוטה להפחית את ריכוז החלבון הסופי. היתרון העיקרי זיקה, כרומטוגרפיה יונים הוא ביכולת טעינה של אמצעי אחסון גדול יותר באופן משמעותי מאשר לניירות
בדיקות לפעילות נוקלאז עשוי להיות מותאם כדי חלבונים שונים לטהר במשותף עם נוקלאז חיידקי. כאן אנו מזהים את IN PFV, נוקלאז מזהמים עשוי להיות מופרדת באמצעות כרומטוגרפיה sepharose הפארין. אנחנו הראו בעבר כי ב PFV יש פרופיל דומה נוקלאז עם מונו-S הקטיון, מונו-Q אניון חילופי גזים שהופך שרפים אלו מתאים חלבון זה. בהתאם מאפייני זיקה של החלבון הרצוי ביחס נוקלאז, פרוטוקול זה עשוי לשמש עם מעבר צבע • תנאי ושרפים זיקה או יונים. המפתח סילוק יעיל של נוקלאז זיהום של חלבון עניין הבדל אהדה עבור שרף. כל שבר חייב להיות לבדיקה נוקלאז פעילות. שרפים כרומטוגרפיה של פרוטוקול זה עשוי לא להיות ישירות מוחל על כל החלבונים זה לטהר במשותף עם חיידקי nucleases. עם זאת, התפיסה הכוללת של משתמש זיקה או שרף חילוף יונים להפריד את נוקלאז חלבון של עניין assaying שברים לפעילות נוקלאז עשויים לחול באופן כללי.

מחקרים ביוכימיים, רווק מולקולה של אינטראקציות חלבון עם ה-DNA דורשים חומרים טהור במיוחד. מזהם nucleases מחיידקים, ניתן להסתיר את התוצאות של מבחני אלה. נוקלאז מזהמים נמצא בתוך ההכנות של חומרים חמצן נבלות protocatechuate-3,4-dioxygenase (יהלומים), אב-טיפוס קצפית וירוס (PFV) integrase (ב) מבודד Escherichia coli (e. coli)1 , 2 , 3.
שילוב retroviral מבחני להסתמך על ההמרה של ה-DNA supercoiled עצור או ליניארי מוצרים כאמצעי של פעילות4. במהלך זיהום הסלולר ב מצטרף בשני קצותיו של cDNA ויראלי כרומטין מארח5. בכל קצה מצטרף התגובה נקרא העברה strand. מבחני של recombinant ב פעילות יכול להצטרף oligomers דנ א שני מחקה את cDNA ויראלי נגמר אל יעד ה-DNA אינטגרציה מתואמת תגובה4,5,6,7,8. לחלופין IN רקומביננטי עשוי להצטרף קצה דנ א אחד רק9,10תגובה אינטגרציה שאינה פיזיולוגית הרלוונטיים באתר חצי. כאשר הדנ א פלסמיד supercoiled היעד של אינטגרציה, אינטגרציה מתואמת המוצרים הם לליניארית דנ א, חצי אתר שילוב מוצרים עיגולים רגועה. מוצרים אלה התגובה מזוהים על ידי ניידות היחסי שלהם במהלך agarose ג'ל אלקטרופורזה1. אם IN רקומביננטי של נוקלאז מזהמים, יהיה כדין עיגולים רגועה או על פלסמיד ליניארית יכול להיות מבלבל את תוצאות הניסוי. נגיפי DNA oligomers עשוי להיות מסומן fluorescently באופן סופי לזהות מוצרים אינטגרציה, בניגוד נוקלאז מוצרים. עם זאת, ב מאוד טובות מטרות DNA supercoiled; אובדן של פלסמיד supercoiled עיגולים רגועה או DNA ליניארי על ידי מזהמים נוקלאז יכול להטות תוצאות ופרשנות של נתונים11. לכן יש הכרח להסיר את nucleases חיידקי retroviral בהכנות.
ב PFV יש זיקה שונה עבור sepharose הפארין בהשוואה של נוקלאז חיידקי1. ב PFV, את נוקלאז עשוי להיות מופרדים של • תנאי מעבר צבע ליניארי של הפארין sepharose. נוקלאז אינה מזוהה בקלות על-ידי של ספיגת אולטרה סגול (UV) בשיא 280 ננומטר או נתרן אנליטית dodecyl סולפט לזיהוי בג'ל (מרחביות-עמוד). במקום זאת, נוקלאז מאותרים על ידי assay פעילות נוקלאז העסקת את ההמרה של פלסמיד supercoiled עיגולים רגועה או מוצרים. כל שבר בעקבות הפארין sepharose כרומטוגרפיה נבדק נוקלאז פעילות. ב PFV את הזיהום נוקלאז יש הבדל אהדה עבור מונו-Q אניון שרף. יש הבדל קטן אהדה עבור מונו-S הקטיון שרף. עם זאת, הרזולוציה מונו-S של נוקלאז חיידקי ו PFV לא תאפשר הפרדה יעילה בין החלבונים. בסופו של דבר, הפארין sepharose זיקה טיהור מציע ההפרדה הטוב ביותר של נוקלאז חיידקי מ PFV IN ויש לו היתרון של נפח בלתי מוגבל.
בדיקה של מזהם נוקלאז פעילות עשוי להיות מותאם חלבונים אחרים. החלבון עניין סביר להניח יש זיקה חלופי מאפיינים מאשר ב PFV; ההבדל מחייבים המאפיינים של החלבון של עניין את הזיהום נוקלאז להיקבע מדעית. מתודולוגיה זו לזיהוי נוקלאז הזיהום עשוי להיות מותאם כדי אחרים שרפים כולל הקטיון מונו-S או מונו-Q אניון exchange שרפים. זיקה, יונים שרפים עשויים להציע שיטה אמינה כדי לבודד חלבון רקומביננטי עניין ובלחות nucleases ללא מגבלות באמצעי האחסון של חלבון במהלך כרומטוגרפיה.

<table><tbody><tr><td>BL21/DE3 Rosetta E. coli</td><td>EMD Millipore</td><td>70956-4</td><td></td></tr><tr><td>LB broth</td><td>EMD biosciences</td><td>1.10285.0500</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Amresco</td><td>0339</td><td></td></tr><tr><td>Chloramphenicol&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0230</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D8537</td><td></td></tr><tr><td>IPTG&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CI8280</td><td></td></tr><tr><td>ZnCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>208086</td><td></td></tr><tr><td>Tris Ultra Pure</td><td>Gojira Fine Chemicals</td><td>UTS1003</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>P212121</td><td>RP-S23020</td><td></td></tr><tr><td>PMSF&amp;nbsp;</td><td>Amresco</td><td>0754</td><td></td></tr><tr><td>Imidazole&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>I0250</td><td></td></tr><tr><td>DTT&amp;nbsp;</td><td>P212121</td><td>SV-DTT</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure EDTA</td><td>Invitrogen/Gibco</td><td>15575</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Amresco</td><td>0662</td><td></td></tr><tr><td>Agarose&amp;nbsp;</td><td>Denville Scientific</td><td>CA3510</td><td></td></tr><tr><td>Ethidium bromide</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>BP1302</td><td></td></tr><tr><td>Glycerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G37-20</td><td></td></tr><tr><td>Ni-NTA Superflow</td><td>Qiagen</td><td>30430</td><td></td></tr><tr><td>Heparin Sepharose 6 Fast Flow</td><td>GE Healthcare Life Sciences</td><td>17-0998-01</td><td></td></tr><tr><td>HRV14 3C protease&amp;nbsp;</td><td>EMD Chemicals</td><td>71493-3</td><td></td></tr></tbody></table>

detection and removal of nuclease contamination during purification of recombinant prototype foamy virus integrase

החלבון integrase (ב) של רטרווירוס אב טיפוס קצפית וירוס (PFV) הוא אנזים מודל לימוד המנגנון של retroviral אינטגרציה. בהשוואה ל- IN של רטרווירוסים אחרים, PFV IN הוא מסיס יותר נוטה יותר מניפולציה ניסויית. בנוסף, הוא רגיש מעכבי IN הרלוונטית קלינית וירוס הכשל החיסוני האנושי (HIV-1), רומז כי מנגנון PFV IN קטליטי דומה כי של HIV-1 ב- IN IN מזרז קוולנטיות בהצטרפות של נגיפי DNA משלימים (cDNA) למטרה DNA בתהליך שנקרא העברה strand. כזאתי העברה סטרנד מציג ניקס יעד ה-DNA. ניתוח של אינטגרציה התגובה מוצרים יכול להיות מבולבל על ידי הנוכחות של nucleases שניק באופן דומה ה-DNA. נוקלאז חיידקי הוכח לטהר במשותף עם רקומביננטי IN PFV לידי ביטוי Escherichia coli (e. coli). כאן אנו מתארים שיטה לבודד PFV ב מ נוקלאז משחיתה מאת הפארין כרומטוגרפיית זיקה. שברים מוקרנים בקלות עבור נוקלאז זיהום עם פלסמיד supercoiled, agarose בג'ל. ב PFV ו נוקלאז משחיתה את להציג הזיקות חלופי עבור sepharose הפארין ומאפשר נוקלאז ללא הכנת IN PFV רקומביננטי מתאים לניתוח ביוכימית או יחיד מולקולה בצובר של אינטגרציה.

ב PFV רקומביננטי נגוע לעיתים קרובות עם חיידקי נוקלאז1. שילוב הביוכימי מבחני תלויים כימות תשובתו של פלסמיד supercoiled DNA עיגולים רגועה ומוצרים ליניארי. הנוכחות של נוקלאז מזהמים עלול להוביל כדין כימות של מבחני אלה. הביטוי של PFV IN עם תג hexahistidine המושרה ב e. coli (איור 1), תחילה מטוהרת על-ידי ניקל כרומטוגרפיית זיקה (איור 2). השברים עם טהור ב PFV משולבים, התג hexahistidine הוא ביקע על ידי פרוטאז. אנחנו קבעו כי PFV IN נוקלאז משחיתה את יש הזיקות שונים עבור הפארין sepharose כרומטוגרפיה (איור 3)1. שברים PFV IN בעקבות הפארין sepharose כרומטוגרפיה מודגרת של פלסמיד supercoiled כדי assay עבור עיגולים רגועה, פלסמיד ליניארית, המוצרים של פעילות נוקלאז (איור 4). Assay זו מאפשרת זיהוי חלבונים שברים ללא נוקלאז (איור 5). שברים אלה עשויים להיות משולב, דיאליזה, קפוא לניסויים עתידיים.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig1.jpg"> איור 1: אינדוקציה של PFV ב e. coli . תאים מתרבויות לפני (ליין 2), לאחר אינדוקציה (ליין 3) הם ניתחו לנוכחות של דגימות המחוזי PFV ב, 47374 היו מופרדים על ידי 10% מרחביות-דף מוכתם כחול מבריק Coomassie. ליין 1, סמני משקל מולקולרי (kDa). <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56605/56605fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig2.jpg"> איור 2: ניקל זיקה כרומטוגרפיה שברים. Lysates חיידקי מסיסים הופרדו באמצעות כרומטוגרפיית זיקה ניקל. ב PFV עם תג hexahistidine היה eluted עם מעבר צבע ליניארי של 20 מ ל-200 מ מ imidazole. שברים הוערכו ב- 10% מרחביות-דף מוכתם כחול מבריק Coomassie. PFV ב, 47374 דא, בולט לעין במדגם טעון על העמודה (עומס), אבל הוא פחות ניכרת הזרימה או כביסה. בשברים עם elute בשלב מוקדם של המילוי ההדרגתי imidazole בדרך כלל להציג מזהם ניידות איטי יותר בקרבת 75 kDa, כמו גם כמה מזהמים ניידות מהירה יותר או תחתיו 25 kDa. בריכוזים גבוהים של imidazole יש חומציות בולט לעין, PFV IN שנראה יחסית טהור. בדוגמה זו, שברים #33 דרך #84 היו משולבות וטיהרו עוד יותר. סמני משקל מולקולרי (kDa) נמצאים בצד השמאל של כל ג'ל. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56605/56605fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig3.jpg"> איור 3 : הפארין כרומטוגרפיה sepharose של PFV של 1 . בעקבות ניקל זיקה פרוטאז והסרת של התג hexahistidine, PFV ב (44394 Da) היה fractionated על ידי sepharose הפארין. חלבונים היו eluted עם מעבר צבע ליניארי מ-200 מ מ ל 1 M NaCl. אפילו שברים #12 כדי #44 הוערכו על ידי 8% מרחביות-דף מוכתם Coomassie כחול. סמני משקל מולקולרי (kDa) נמצאים בצד השמאל של כל ג'ל. שברים אלו נבדקו נוקלאז פעילות. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56605/56605fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig4.jpg"> איור 4: נוקלאז וזמינותו של הפארין sepharose שברים 1 . כל שבר sepharose הפארין נוספה supercoiled פלסמיד ה-DNA. שבר מספרים לתאם לאלו המוצגות באיור3. בעקבות דגירה, התגובות נוקלאז deproteinated, מופרדים על-ידי 1% agarose עם אתידיום ברומיד. פקדים השליליים כוללים הדנ א פלסמיד עם אין חלבונים (היעד בלבד) ולטיהור פראי סוג ב PFV שידוע כי של נוקלאז (PFV ב WT) הקודמת. פקד חיובי עבור מזהמות נוקלאז פעילות הוא הוא לטיהור הקודם של catalytically לא פעיל IN PFV מוכרת יש מזהמים נוקלאז (PFV IN D128N). סמני גודל ה-DNA מוצגים ב- kb. פלסמיד supercoiled (SC), פלסמיד ליניארי (L), רגועה עיגולים (RC) מסומנים. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56605/56605fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56605/56605fig5.jpg"> איור 5 : כימות של מבחני נוקלאז 1. Agarose ג'לים נסרקו וערכי פיקסלים היו לכמת supercoiled (SC), ליניארי (L) של מעגל רגועה (RC) להקות בנתיב בכל. שבר מספרים תשבחות אלה באיור דמויות 3 ו- 4. האחוזים של מעגלים ליניאריים ורגועה חושבו באמצעות ערכי הפיקסלים המשוואה המוצג. לדוגמה, הפיקסל הערכים עבור הלהקות של שבר #12: פלסמיד supercoiled 817636 50467 פלסמיד ליניארי, עיגולים רגועה 112052. הערך הכולל של פיקסל הדנ א של שבר #12 הוא הסכום של ערכים אלה, 980155. האחוז של DNA ליניארי הוא 50467 מוכפלים ב- 100 עבור האחוז ומופרדים הערך DNA הכולל שווה ב- 5.1%. האחוז של עיגולים רגוע הוא 112052 מוכפלים ב- 100, מחולק לפי הערך DNA הכולל שווה 11.4%. הסכום של מעגל ליניארי ורגועה אחוזי הוא 16.5%. בקרה שלילית פלסמיד DNA עם אין חלבונים (לא IN, הגרף התחתון) מציין כי זו הכנה של פלסמיד כולל 4.4% של ה-DNA הכולל כעיגולים ליניארי או רגועה. פקד שלילי השני היה טיהור קודמות מסוג הפרוע PFV IN (WT) מוצגים 8.6% של ה-DNA הכולל כעיגולים ליניארי או רגועה. מנתיבי שליטה שני מצביעים על רמת רקע של עצור או ליניארית פלסמיד הנוכחי עם המצע לבד ועם PFV IN... פקד חיובי הוא הוא לטיהור הקודם של catalytically לא פעיל IN PFV (D128N) אשר היה 23% של ה-DNA הכולל כעיגולים ליניארי ורגועה. ה-DNA נחשפים הפארין sepharose שברים #12 באמצעות #22, גרמו > 10% של ה-DNA כעיגולים ליניארי ורגועה. בדוגמה זו, שברים #24 #42 מוצגים < 10% המרה מעגלים ליניאריים ורגועה. שברים אלה היו משולבות, דיאליזה. Aliquots היו קפואים, מאוחסנים ב- 80 ° C לשימוש עתידי. <a href="//cloudflare-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/56605/56605fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase at JoVE.com

Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

אב טיפוס רקומביננטי וירוס קצפית integrase חלבון נגוע לעיתים קרובות נוקלאז חיידקי במהלך טיהור. שיטה זו מזהה נוקלאז זיהום ומסירה אותו הכנת הסופי של האנזים.

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

The integrase (IN) protein of the retrovirus prototype foamy virus (PFV) is a model enzyme for studying the mechanism of retroviral integration. Compared ...

detection-removal-nuclease-contamination-during-purification

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

7.1K Views.  The Ohio State University College of Medicine. אב טיפוס רקומביננטי וירוס קצפית integrase חלבון נגוע לעיתים קרובות נוקלאז חיידקי במהלך טיהור. שיטה זו מזהה נוקלאז זיהום ומסירה אותו הכנת הסופי של האנזים.

Video: Detection and Removal of Nuclease Contamination During Purification of Recombinant Prototype Foamy Virus Integrase

Affinity Purification of Influenza Virus Ribonucleoprotein Complexes from the Chromatin of Infected Cells

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the single-stranded genome is encapsidated by the nucleoprotein (NP), and associated with the trimeric polymerase complex consisting of the PA, PB1, and PB2 subunits. However, in contrast to most RNA viruses, influenza viruses perform viral RNA synthesis in the nuclei of infected cells. Interestingly, viral mRNA synthesis uses cellular pre-mRNAs as primers, and it has been proposed that this process takes place on chromatin1. Interactions between the viral polymerase and the host RNA polymerase II, as well as between NP and host nucleosomes have also been characterized1,2.
Recently, the generation of recombinant influenza viruses encoding a One-Strep-Tag genetically fused to the C-terminus of the PB2 subunit of the viral polymerase (rWSN-PB2-Strep3) has been described. These recombinant viruses allow the purification of PB2-containing complexes, including vRNPs, from infected cells. To obtain purified vRNPs, cell cultures are infected, and vRNPs are affinity purified from lysates derived from these cells. However, the lysis procedures used to date have been based on one-step detergent lysis, which, despite the presence of a general nuclease, often extract chromatin-bound material only inefficiently. 
Our preliminary work suggested that a large portion of nuclear vRNPs were not extracted during traditional cell lysis, and therefore could not be affinity purified. To increase this extraction efficiency, and to separate chromatin-bound from non-chromatin-bound nuclear vRNPs, we adapted a step-wise subcellular extraction protocol to influenza virus-infected cells. Briefly, this procedure first separates the nuclei from the cell and then extracts soluble nuclear proteins (here termed the "nucleoplasmic" fraction). The remaining insoluble nuclear material is then digested with Benzonase, an unspecific DNA/RNA nuclease, followed by two salt extraction steps: first using 150 mM NaCl (termed "ch150"), then 500 mM NaCl ("ch500") (Fig. 1). These salt extraction steps were chosen based on our observation that 500 mM NaCl was sufficient to solubilize over 85% of nuclear vRNPs yet still allow binding of tagged vRNPs to the affinity matrix.
After subcellular fractionation of infected cells, it is possible to affinity purify PB2-tagged vRNPs from each individual fraction and analyze their protein and RNA components using Western Blot and primer extension, respectively. Recently, we utilized this method to discover that vRNP export complexes form during late points after infection on the chromatin fraction extracted with 500 mM NaCl (ch500)3.

Influenza viruses replicate their RNA genome in association with host-cell chromatin. Here, we present a method to purify intact viral ribonucleoprotein complexes from the chromatin of infected cells. Purified viral complexes can be analyzed by both Western blot and primer extension of protein and RNA content, respectively.

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

Like all negative-strand RNA viruses, the genome of influenza viruses is packaged in the form of viral ribonucleoprotein complexes (vRNP), in which the ...

Multi-target Parallel Processing Approach for Gene-to-structure Determination of the Influenza Polymerase PB2 Subunit

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States alone, an average of 41,400 deaths and 1.86 million hospitalizations are caused by influenza virus infection each year 1. Point mutations in the polymerase basic protein 2 subunit (PB2) have been linked to the adaptation of the viral infection in humans 2. Findings from such studies have revealed the biological significance of PB2 as a virulence factor, thus highlighting its potential as an antiviral drug target.
The structural genomics program put forth by the National Institute of Allergy and Infectious Disease (NIAID) provides funding to Emerald Bio and three other Pacific Northwest institutions that together make up the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease (SSGCID). The SSGCID is dedicated to providing the scientific community with three-dimensional protein structures of NIAID category A-C pathogens. Making such structural information available to the scientific community serves to accelerate structure-based drug design.
Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for new lead discovery by targeting a pathway or an entire protein family. Emerald Bio has developed a high-throughput, multi-target parallel processing pipeline (MTPP) for gene-to-structure determination to support the consortium. Here we describe the protocols used to determine the structure of the PB2 subunit from four different influenza A strains.

Structure-based drug design plays an important role in drug development. Pursuing multiple targets in parallel greatly increases the chance of success for lead discovery. The following article highlights how the Seattle Structural Genomics Center for Infectious Disease utilizes a multi-target approach for gene-to-structure determination of the PB2 influenza A subunit.

גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

Pandemic outbreaks of highly virulent influenza strains can cause widespread morbidity and mortality in human populations worldwide. In the United States ...

Purification and Visualization of Influenza A Viral Ribonucleoprotein Complexes

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A nucleoprotein (NP) into viral ribonulceoprotein particles (vRNPs). The influenza vRNPs are enclosed within the viral envelope. During cell entry, however, these vRNP complexes are released into the cytoplasm, where they gain access to the host nuclear transport machinery. In order to study the nuclear import of influenza vRNPs and the replication of the influenza genome, it is useful to work with isolated vRNPs so that other components of the virus do not interfere with these processes. Here, we describe a procedure to purify these vRNPs from the influenza A virus. The procedure starts with the disruption of the influenza A virion with detergents in order to release the vRNP complexes from the enveloped virion. The vRNPs are then separated from the other components of the influenza A virion on a 33-70% discontinuous glycerol gradient by velocity sedimentation. The fractions obtained from the glycerol gradient are then analyzed on via SDS-PAGE after staining with Coomassie blue. The peak fractions containing NP are then pooled together and concentrated by centrifugation. After concentration, the integrity of the vRNPs is verified by visualization of the vRNPs by transmission electron microscopy after negative staining. The glycerol gradient purification is a modification of that from Kemler et al. (1994)1, and the negative staining has been performed by Wu et al. (2007).2

The genome of the influenza A virus consists of eight separate complexes of RNA and proteins, termed viral ribonucleoprotein complexes (vRNPs). This paper describes the glycerol gradient purification and transmission electron microscopy visualization of influenza A vRNPs.

טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

The influenza A viral genome consists of eight negative-sense, single stranded RNA molecules, individually packed with multiple copies of the influenza A ...

Biology

InSET: A Novel Tool for Unbiased Genome-Wide Functional Element Discovery

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens have made strides in exploring this, they often limit their scope to known genomic elements and may introduce non-specific effects. This underscores the urgent need for novel functional genomics tools that enable a deeper, unbiased understanding of genome functionality. This protocol introduces the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for identifying lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library. InSET facilitates the capture of genome-wide lentiviral integration sites, with next-generation sequencing used to detect and quantify flanking sequences. InSET's design enables the analysis of integration site abundance variations in phenotypic screens on a large scale, establishing it as a robust tool for forward genetics and for identifying functional genomic elements. A key benefit of InSET is its capacity to reveal previously unidentified genomic elements, including novel functional exons of both protein-coding and non-coding RNAs, independent of prior annotation. Overall, InSET holds significant value in studying the intricate complexity of the human genome and transcriptome, where many genomic elements await functional characterization.

Insertional mutagenesis is an essential tool in forward genetics for identifying functional genomic elements. Here, we describe the Insertion-based Screen for functional Elements and Transcripts (InSET), a method for detecting lentivirus integration sites within a lentivirus-based insertional mutagenesis cell library.

The extent of functional sequences within the human genome is a pivotal yet debated topic in biology. Although high-throughput reverse genetic screens ...

Genetics

Isolation of Viral Replication Compartment-enriched Sub-nuclear Fractions from Adenovirus-infected Normal Human Cells

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments through the recruitment of viral and cellular proteins to sites occupied by the viral genome. These sites, called replication compartments (RC), can be considered viral-induced nuclear domains where the viral genome is localized and viral and cellular proteins that participate in replication, transcription and post-transcriptional processing are recruited. Moreover, cellular proteins involved in the antiviral response, such as tumor suppressor proteins, DNA damage response (DDR) components and innate immune response factors are also co-opted to RC. Although RC seem to play a crucial role to promote an efficient and productive replication cycle, a detailed analysis of their composition and associated activities has not been made. To facilitate the study of adenoviral RC and potentially those from other DNA viruses that replicate in the cell nucleus, we adapted a simple procedure based on velocity gradients to isolate Ad RC and established a cell-free system amenable to conduct morphological, functional and compositional studies of these virus-induced subnuclear structures, as well as to study their impact on host-cell interactions.

We provide a novel strategy to isolate viral replication compartments (RC) from adenovirus (Ad)-infected human cells. This approach represents a cell-free system that can help to elucidate the molecular mechanisms regulating viral genome replication and expression as well as regulation of viral-host interactions established at the RC.

בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus

During infection of human cells by adenovirus (Ad), the host cell nucleus is dramatically reorganized, leading to formation of nuclear microenvironments ...

Purification of Viral DNA for the Identification of Associated Viral and Cellular Proteins

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and cellular proteins by mass spectrometry. Although proteins that interact with viral genomes play major roles in determining the outcome of infection, a comprehensive analysis of viral genome associated proteins was not previously feasible. Here we demonstrate a method that enables the direct purification of HSV-1 genomes from infected cells. Replicating viral DNA is selectively labeled with modified nucleotides that contain an alkyne functional group. Labeled DNA is then specifically and irreversibly tagged via the covalent attachment of biotin azide via a copper(I)-catalyzed azide-alkyne cycloaddition or click reaction. Biotin-tagged DNA is purified on streptavidin-coated beads and associated proteins are eluted and identified by mass spectrometry. This method enables the selective targeting and isolation of HSV-1 replication forks or whole genomes from complex biological environments. Furthermore, adaptation of this approach will allow for the investigation of various aspects of herpesviral infection, as well as the examination of the genomes of other DNA viruses.

The goal of this protocol is to specifically tag and selectively isolate viral DNA from infected cells for the characterization of viral genome associated proteins.

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

The goal of this protocol is to isolate herpes simplex virus type 1 (HSV-1) DNA from infected cells for the identification of associated viral and ...

Assembly and Purification of Prototype Foamy Virus Intasomes

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an integrase (IN) enzyme that catalyzes the covalent joining of viral to host DNA, which is known as strand transfer. Integration may be modeled in vitro with recombinant retroviral IN and DNA oligomers mimicking the ends of the viral genome. In order to more closely recapitulate the integration reaction that occurs in vivo, integration complexes are assembled from recombinant IN and synthetic oligomers by dialysis in a reduced salt concentration buffer. The integration complex, called an intasome, may be purified by size exclusion chromatography. In the case of prototype foamy virus (PFV), the intasome is a tetramer of IN and two DNA oligomers and is readily separated from monomeric IN and free oligomer DNA. The integration efficiency of PFV intasomes may be assayed under a variety of experimental conditions to better understand the dynamics and mechanics of retroviral integration.

Recombinant retroviral integrase and DNA oligomers mimicking viral DNA ends can form an enzymatically active complex known as an intasome. Intasomes may be used for biochemical, structural, and kinetic studies. This protocol details how to assemble and purify prototype foamy virus intasomes.

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

A defining feature and necessary step of the retrovirus life cycle is the integration of the viral genome into the host genome. All retroviruses encode an ...

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally replicates through an episomal DNA intermediate; however, integration of HBV DNA fragments into the host genome has been observed, even though this form is not necessary for viral replication. The exact purpose, timing, and mechanism(s) by which HBV DNA integration occurs is not yet clear, but recent data show that it occurs very early after infection. Here, the in vitro generation and detection of HBV DNA integrations are described in detail. Our protocol specifically amplifies single copies of virus-cell DNA integrations and allows both absolute quantification and single-base pair resolution of the junction sequence. This technique has been applied to various HBV-susceptible cell types (including primary human hepatocytes), to various HBV mutants, and in conjunction with various drug exposures. We foresee this technique becoming a key assay to determine the underlying molecular mechanisms of this clinically relevant phenomenon.

Detection of Low Copy Number Integrated Viral DNA Formed by In Vitro Hepatitis B Infection

We describe here the in vitro generation of HBV DNA via a Hepatitis B virus infection system and the highly sensitive detection of its (1&#8211;2 copies) integration using inverse nested PCR.

זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

Hepatitis B Virus (HBV) is a common blood-borne pathogen causing liver cancer and liver cirrhosis resulting from chronic infection. The virus generally ...

טיהור וקטורי AAV על ידי כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבית

Isolation of Adeno-Associated Viral Vectors Through a Single-Step and Semi-Automated Heparin Affinity Chromatography Protocol

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. However, the commonly used methods to purify AAVs make use of cesium chloride or iodixanol density gradient ultracentrifugation. Despite their advantages, these methods are time-consuming, have limited scalability, and often result in vectors with low purity. To overcome these constraints, researchers are turning their attention to chromatography techniques. Here, we present an optimized heparin-based affinity chromatography protocol that serves as a universal capture step for the purification of AAVs.
This method relies on the intrinsic affinity of AAV serotype 2 (AAV2) for heparan sulfate proteoglycans. Specifically, the protocol entails the co-transfection of plasmids encoding the desired AAV capsid proteins with those of AAV2, yielding mosaic AAV vectors that combine the properties of both parental serotypes. Briefly, after the lysis of producer cells, a mixture containing AAV particles is directly purified following an optimized single-step heparin affinity chromatography protocol using a standard fast protein liquid chromatography (FPLC) system. Purified AAV particles are subsequently concentrated and subjected to comprehensive characterization in terms of purity and biological activity. This protocol offers a simplified and scalable approach that can be performed without the need for ultracentrifugation and gradients, yielding clean and high viral titers.

Author Spotlight: שיטה משופרת לייצור וטיהור של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו

This manuscript describes a detailed protocol for the generation and purification of adeno-associated viral vectors using an optimized heparin-based affinity chromatography method. It presents a simple, scalable, and cost-effective approach, eliminating the need for ultracentrifugation. The resulting vectors exhibit high purity and biological activity, proving their value in preclinical studies.

בידוד של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות פרוטוקול כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבי וחצי אוטומטי

Adeno-associated virus (AAV) has become an increasingly valuable vector for in vivo gene delivery and is currently undergoing human clinical trials. ...

האיתור וההסרה של נוקלאז זיהום במהלך טיהור של אב טיפוס רקומביננטי קצפית וירוס Integrase

Summary

Explore More Videos

זיקה טיהור של נגיף השפעת תסביכים Ribonucleoprotein של הכרומטין של תאים נגועים

גישת עיבוד מקביל רב היעד לקביעת גנטי למבנה של פולימראז שפעת PB2 מקטע

טיהור ויזואליזציה של שפעת מכלולים Ribonucleoprotein ויראלי

Identification of Functionally-Relevant Lentivirus Integration Sites in an Insertional Mutagenesis Cell Library

בידוד של שברים תת-גרעיניים מועשרים-תא ויראלי שכפול מתאים נורמלים אדם נגוע Adenovirus

טיהור של ה-DNA הנגיפי לצורך זיהוי חלבונים הקשורים ויראלי וסלולריות

הרכבה ולטיהור Intasomes וירוס קצפית אב-טיפוס

זיהוי של עותק נמוך מספר משולב ה-DNA הנגיפי נוצר על ידי במבחנה הפטיטיס B זיהום

בידוד של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות פרוטוקול כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבי וחצי אוטומטי

בידוד של וקטורים נגיפיים הקשורים לאדנו באמצעות פרוטוקול כרומטוגרפיית זיקה הפרין חד-שלבי וחצי אוטומטי