מחקר שוטף פפטיד מיקרוביאלית tardigrade נתמך על ידי מימון מגזר מן המערב התיכון אוניברסיטת Office של מחקר במימון תוכניות (ORSP). ORSP היה אין תפקיד תכנון המחקר, איסוף נתונים, ניתוח, פרשנות או הכנת כתב היד.

1. לקבוע את הגדרת התכונות של קבוצת חלבונים עניין <ol><li>ייעוץ פרסומים קודמים כדי לקבוע אם יש קונצנזוס לגבי התכונות הדרושות להיחשב חלק מהקבוצה. שימו לב כל חוסר עקביות או הבדלים דעת בין קבוצות מחקר, וכוללים מאפיינים שיכול לשרת כדי להבדיל עוד תת קבוצה אחת.</li>
	<li>אם ספרות הקודם אינו מטפל הגדרת מאפיינים, להשתמש רצפי הנחשבים נציג של קבוצת כנקודת התחלה כדי לזהות תכונות שנשמרת.</li>
</ol> 2. לאסוף את רצפי הרלוונטיים <ol><li>אם הדעת נכתב כי כוללים ניתוחים של רצפי המייצגות את הקבוצה, כוללים רצפי אלה ב- raw dataset. לאחזר רצפי מספרים ההצטרפות המוזכרים בספרות ולשמור ברצף רגיל בתוכנית לעריכת (למשל, EditSeq חבילת Lasergene או אחד מני רבים זמינים עבור חינם באינטרנט).</li>
	<li>אם המדובר הקבוצה הוגדרה באחד המאגרים מבניים, כוללים את רצפי שמסד הנתונים רשימות להיות חלק הקבוצה. אחזר רצפים באמצעות העלייה שהמספרים שסופקו במסד הנתונים ולשמור בעריכת רצף רגיל תכנית, לעיל- 
	הערה: לדוגמה, רצפי לקטגוריות את superfamily CS-αβ (עקרב הרעלן דמוי) במסד הנתונים SCOP ניתן למצוא כאן: http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/data/scop.b.h.c.h.html.</li> <li>לבצע בסיסי מקומי יישור כלי חיפוש (פיצוץ) 14 חיפושים ציבורי מקוון, מאגרי מידע זמין דרך המרכז הלאומי עבור ביוטכנולוגיה מידע (NCBI) למצוא רצפי אשר ייתכן שלא נכללו בספרות או מבניים מסדי נתונים. ביותר להשלים את התוצאות, להשתמש בשני החלבון הפיצוץ (blastp), תרגם הפיצוץ עם חלבון תוכניות שאילתה (tblastn); . אלו זמינות: https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi.
	<ol><li>שימוש רצפים ידועים להיות חלק מקבוצת עניין כמו רצפים של השאילתה. העתק והדבק את הרצף בתיבת החיפוש בחלק העליון, או לספק GenBank ההצטרפות מספר או במערכת העיכול מזהה, אם זמין.</li>
		<li>בחר את מסד הנתונים מתוך התפריט הנפתח. לבחור רצפי חלבונים לא יתיר (ע נ) blastp והביע את רצף תגים עבור tblastn.</li>
		<li>חיפוש של תוצאות taxa ספציפיים בתוך האורגניזם הגדרת על-ידי הקלדת את האורגניזם או טקסון שם ו בחירה מתוך הרשימה המופיעה בעת הקלדת. כדי להוסיף אורגניזמים נוספים או taxa כדי לא לכלול, לחץ &#34; + &#34; יופיעו לחצן של שדה אחר. לא לכלול כל taxa לא רצויים בתיבת אורגניזם על-ידי הקלדת את השם או אורגניזם טקסון, בחירה מתוך הרשימה המופיעה בעת הקלדת ובדיקת &#34; תכלול &#34; בתיבה בשמאל.</li>
		<li>לגשת פרמטרים נוספים על ידי לחיצה על &#34; פרמטרי האלגוריתם &#34; ליד החלק התחתון של הדף. נשאיר את ברירת המחדל אלא אם כן יש תירוץ עבור שינוי פרמטר.</li>
		<li>לחץ &#34; הפיצוץ &#34; לחצן הפעל הניתוח; זה עלול לקחת קצת זמן התוצאות יופיעו. באופן כללי, לאחזר כניסות עם מצפה ערך (או e-ערך) של &#34; -05 &#34; או יותר ולשמור ברצף רגיל בתוכנית לעריכת.
		<ol><li>אם כל הלהיטים מעל לגודל הסף הזה, הפעל מחדש את החיפוש עם מספר רב יותר של רצפי היעד (במקטע פרמטרים אלגוריתם) כדי להשיג כל רצפי רלוונטי.</li>
		</ol></li></ol></li> <li>במידת הצורך, לקצץ את רצפי כדי לא לכלול מידע לא רלוונטי (למשל, הקיפול CS-αβ חל רק פפטיד בוגר). לזהות את האות פפטידים pro-פפטידים להסרת באמצעות אביזר 15 (זמין באינטרנט), או SignalP עבור מתוחכמים יותר אות פפטיד חיזוי 16 (זמין באינטרנט).</li>
</ol> 3. ליצור הפניה ב גיליון אלקטרוני המבוסס על חשוב תכונות כי זוהו <ol><li>לזהות את מאפייני המכונן של קבוצת עניין. לדוגמה, השתמש הקיפול CS-αβ שקבע סופית מבנה הפתרון של חרק defensin A Phormia terraenovae ( איור 1) 8.
	<ol><li>הקיפול כוללת מוטיב קטן יותר הנקרא סליל מיוצב ציסטאין (תגובת CSH) 17; לזהות את מוטיב זה על ידי CXXXC (כאשר X הוא כל חומצה אמינית) הזרם של CXC בצורת שתי איגרות חוב דיסולפידי ( איור 1 , מוצק ורוד קווים). 
		הערה: כדי להשלים את מוטיב CS-αβ, קשר דיסולפידי השלישית נוצר מן cysteines נוספים הממוקמים לפני חצי אחד של המוטיב תגובת CSH ( איור 1, מנוקד קווים ורודים).</li>
	</ol></li> <li>להיכנס אלה הגדרת תכונות לתוך גיליון אלקטרוני. ראה איור 2-
	<ol><li>שימוש עמודות עבור התכונות שנשמרת ו כדי לייצג את החללים בין תכונות אלה. שמור את העמודות רחב מספיק כדי להתאים מספרים ולהבטיח שיש להם רוחב עקבי. הגדר את רוחב באמצעות &#34; עיצוב | רוחב עמודה &#34; פונקציה ( איור 2, חץ ורוד).</li>
		<li>השתמש בשורות עבור רצף שמות.</li>
		<li>כאשר רצף יש התכונה, מלא את התיבה באמצעות הפונקציה מילוי ( איור 2, כיכר ורוד). עבור המרווח בין תכונות, הזן את מספר חומצות אמינו בתיבת בין ולהשאיר אותה ללא מילוי. לדוגמה, באמצעות החרק defensin רצף נותן הפניה הכוללת שש cysteines, עם spacings מוגדר בין C2 C3 ובין C5 C6.</li>
	</ol></li> <li>הוסף נציג רצפים שהוקמו בעבר חברי הקבוצה בהתבסס על מסדי נתונים מבניים ספרות. 
	הערה: לדוגמה, ספרות הקודם לבין מסד הנתונים SCOP לזהות מספר קבוצות להכללה: defensins חרקים, קצר-שרשרת העקרב רעלים, רעלים ארוכי שרשרת העקרב, MGD-1, צמח defensins, תולעים נימיות ABFs, drosomycins מן דרוזופילה, ו macins. הספרות מזהה רצף חיידקי עם cysteines רק 4 עשוי לייצג אב הטיפוס הזה superfamily 18. הוספת רצפי אלה מגדילה את מספר cysteines של ההפניה מ-6 עד 10 אך שומר את היישור של המאפיינים המבניים החשובים ( איור 3).
	<ol><li>כדי להוסיף תכונה זו נוטים להגדיר קבוצת משנה של רצפים (לדוגמה, נוספת ציסטאין), השתמש &#34; הוספה &#34; פונקציה ( איור 3, חץ ורוד).</li>
		<li>אם קיימות תכונות חסרות רצף נתון, השאר את התיבה ללא מילוי, ולשלב אותו עם תיבות המייצגות חומצות אמינו להתערב. במידת הצורך, למזג את התאים באמצעות התכונה מזג ומרכז ( איור 3, תיבת ורוד).</li>
	</ol></li> <li>המשך הוספת רצפים לקבוצות כדי לקבל תמונה טובה יותר של וריאציית בכל קבוצה של superfamily גדול יותר. לסכם את מאפייני הקבוצה כדי להקל על השוואות ( איור 4).
	<ol><li>כאשר מספר חומצות אמינו בין התכונות העיקריות משתנה, להשתמש במקף לציון טווח, כגון 6-12 (חומצות אמינו 6-12) וקו נטוי כדי לציין גם / או, כגון 7/10 (7 או 10 החומצות).</li>
		<li>לבחור דרך להוסיף ביאור תכונות של רצפי עשוי להיות רלוונטי, אך אינן מתרחשות לעיתים קרובות מספיק כדי לכלול בהפניה. לדוגמה, מאחר cysteines חשובים superfamily הזה, תווית cysteines נוספים ( איור 4, תיבות ורוד).</li>
	</ol></li> <li>להוסיף newlרצפים המזוהים y בגיליון הנתונים באמצעות את רצפי הקים כמדריך. לדוגמה, הוספת רצפים tardigrades (צהוב) מציג רצפי tardigrade נחלקים למספר קבוצות שונות של superfamily ( איור 5 מציג סיכומים במקום שורה לכל רצף למטרות רווח).</li>
	<li>מראים השתנות בתוך קבוצת טקסונומי על ידי ארגון מחדש את השורות ( איור 6).</li>
</ol> 4. להשתמש את ההפניה כדי לחדד היישורים חומצת אמינו הערה: ישנן תוכניות רבות יכול לשמש עבור היישורים רצף מרובים, אבל להפגנה ישתמש מולקולרית ניתוח גנטיקה אבולוציונית (MEGA6) 19. כי הוא זמין להורדה בחינם.
<ol><li>להוריד ולהתקין את התוכנה-</li>
	<li>להתחיל עם זווית חדשה במגה על-ידי בחירה &#34; עריכה/בנייה יישור &#34; תחת הכרטיסיה יישור, בחר &#34; ליצור זווית חדשה של &#34; בתיבת מופיע ולחץ על &#34; אישור. &#34; מכן בחר &#34; חלבון. &#34;</li>
	<li>בחר &#34; הכנס רצף מקובץ &#34; ב &#34; עריכה &#34; תפריט כדי לייבא את רצפי. 
	הערה: רצפים תצטרך להיות בתבנית FASTA לייבוא לתוך מגה. צבעי רקע המשקפים סוגי חומצות אמיניות שונות משמשות כברירת מחדל, אך אפשרות זו ניתן לבטל תחת &#34; תצוגה &#34; תפריט.</li>
	<li>לאחר כל רצפי מוזנים, לחץ על הסמל כיפוף היד ולאחר מכן &#34; חלבון יישר &#34; כדי ליישר את רצפי באמצעות אלגוריתם השריר 20. 
	הערה: ClustalW הינו גם זמין.
	<ol><li>אם הודעה המציינת כי שום דבר לא נשאר ער אבא שנבחר ומבקש לבחור את כל, לחץ על &#34; אישור. &#34;</li> <li>הערה: זה פותח חלון המאפשר אחד לשנות פרמטרים מסוימים, אבל הם רק כשידוע אין סיבה לעשות זאת. ניתוח זה משתמש תת-קבוצה של הרצף נותחו גם עם נייר הקודם 12.</li>
	</ol></li> <li>סימון היישור מבוסס על התכונות החשובות; שימו לב: הבר העליון מעל רצפי יציג עמודות כלשהן איפה החומצה אמינית לחלוטין והתפאורה (*). לראות איור 7. נראה כי היישור הראשוני מראה רק שלושה cysteines שנשמרת ארבע ( איור 7, תיבות ורוד); הבטתי למטה את העמודה רצף AlCRP הוא בבירור לא מיושרים ( איור 7, חץ ורוד).</li>
	<li>להיפטר פער גדול בין ה-אני את c שנשמרת, לסמן את המקפים ולחץ &#34; מחק &#34; מפתח. מסמן כל חומצות אמינו, או שהם יימחקו גם כן.</li>
	<li>כדי להעביר חומצות אמינו מימין, להאיר, הקש על מקש רווח
	<ol><li>הערה כי AlCRP עכשיו יש את cysteines מבנית מיושר, כי C האחרון של מוטיב CXXXC כולו במהלך היישור ( איור 8). להתאים את היישור לפי הצורך כדי לקבוע עדיפויות של התכונות החשובות ביותר של הרצף.</li>
	</ol></li></ol> 5. להשוות את קבוצות המזוהים באמצעות ההפניה עם תוצאות מניתוחי פילוגנטי <ol><li>מן במערכים ראשוני, לקבוע אילו רצפים צריך להיות כלול בניתוח פילוגנטי; עבור מספר קטן של רצפים, שלב זה עלול שלא יהיה צורך.
	<ol><li>לשמור קובץ יישור הכולל כל רצפי, אך עבור ניתוח פילוגנטי, להסיר רצפים יתירים ( איור 9, ורוד בתיבות הצג זוגות של רצפי יתירים).</li>
		<li>אם ערכת הנתונים כוללת מספר רב של רצפים, להפעיל את ערך ניתוח ראשוני ויוצרים בחירת נציגי קבוצות זה תמיד קלייד.</li>
	</ol></li> <li>לקבוע המודל הטוב ביותר של החלפת חומצת אמינו.
	<ol><li>לייצא את היישור בתבנית מגה (תחת הכרטיסיה נתונים).</li>
		<li>עבור לתפריט מודלים ובחר &#34; למצוא את הטוב ביותר DNA/חלבון במודל. &#34; בחר את קובץ ה. הרגע הצלת ופתיחתו; פעולה זו תפתח חלון בעל פרמטרים מסוימים שניתן לשנות.</li>
		<li>השתמש הפרמטרים של ברירת המחדל אלא אם כן יש סיבה לשנות אותם. לחץ על &#34; לחשב &#34; להתחיל את הניתוח.</li>
	</ol></li> <li>להפעיל ניתוח נראות מקסימלית (מ"ל) במגה-
	<ol><li>בחר &#34; לבנות/מבחן הסבירות המרבי עץ &#34; ' מתפריט ' טקסונומי.</li>
		<li>לבחור הדגם נחוש בדעתו להיות בכושר הטוב ביותר עבור הנתונים מ שלב 5.2 (הפלט ייתן המודל החלפה, כמו גם את הטוב ביותר &#34; המחירים בין אתרי &#34; פרמטר).</li>
		<li>1,000 לבחור bootstrap משכפל כדי להשיג את האמצעים של תמיכה עבור העץ.</li>
		<li>לחץ &#34; לחשב &#34; כדי להפעיל את הניתוח; מגה יש &#34; Explorer עץ &#34; להמחיש את העץ.</li>
	</ol></li> <li>להפעיל ניתוח בייסיאני תוכנת קוד פתוח MrBayes 21. 
	הערה: מדריך MrBayes זמין גם מאתר זה. זה נועד לספק שלבים בסיסיים ואינו מדריך מקיף להתנהלות ניתוח פילוגנטי בייסיאנית.
	<ol><li>לייצא את היישור מגה בתבנית PAUP (Nexus) באותה תיקיה שבה התוכנית MrBayes-</li>
		<li>MrBayes פתוח וסוג &#34; exe שם הקובץ &#34; (למשל, &#34; exe Alignment.nex &#34;).</li>
		<li>לציין את הפרמטרים מודל וניתוח. לבחור את הדגם או שצוין בשלב 5.2 או לבחור &#34; מעורב &#34; הגדרת לנסות מודלים שונים ולדווח את התדירות של המודל על העצים עם ההסתברויות האחורי הטוב ביותר (prset aamodelpr = מעורב). סוג &#34; showmodel &#34; לדווח את ההגדרות הנוכחיות של מודל, &#34; לעזור mcmc ב &#34; כדי להציג את הגדרות הפרמטר הנוכחי, עם הסבר קצר על כל אחד.</li>
		<li>להגדיר את מספר הדורות באמצעות &#34; mcmcp ngen = &#34; הפקודה (1 מיליון הוא אופייני).</li>
		<li>סוג &#34; mcmc ב &#34; כדי להתחיל את הניתוח.</li>
		<li>בעת השלמת מספר דורות, התוכנית תבקש להוסיף דורות רבים יותר. אם סטיית התקן הממוצע של פיצול התדרים הוא פחות מ- 0.1, הקלד. לא. אם זה מעל 0.1, הניתוח צריך להיות מותר להמשיך או פרמטרים מסוימים צריך להיות שונה (עיין במדריך).</li>
		<li>השתמש &#34; sumt &#34; פקודה כדי ליצור את קבצי עץ.</li>
		<li>לאחר הניתוח הושלם נוצר קונצנזוס עץ, וניתן להציגו העץ FigTree (זמין באינטרנט).</li>
	</ol></li> <li>להשוות את העצים כדי לראות אם השיטות מפיקים תוצאות עקביות. 
	הערה: כמה רצפים אינם מספקים מידע רב: העצים לא יכול להיות פתרון טוב, הענפים שיש תמיכה מינימלית ( איור 10).</li>
	<li>להשוות בין העצים לקבוצות מזוהה באמצעות ההפניה כדי לראות אם אלה קבוצות תמיכה הניתוחים פילוגנטי.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Matsuyama, K., Natori, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+of+Three+Antibacterial+Proteins+from+the+Culture+Medium+of+NIH-Sape-4,+an+Embryonic+Cell+Line+of+Sarcophaga+peregrina.">Purification of Three Antibacterial Proteins from the Culture Medium of NIH-Sape-4, an Embryonic Cell Line of Sarcophaga peregrina.</a> J Biol Chem. 263 (32), 17112-17116 (1988).</li><li>Lambert, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insect+immunity:+Isolation+from+immune+blood+of+the+dipteran+Phormia+terranovae.+of+two+insect+antibacterial+peptides+with+sequence+homology+to+rabbit+lung+macrophage+bactericidal+peptides.">Insect immunity: Isolation from immune blood of the dipteran Phormia terranovae. of two insect antibacterial peptides with sequence homology to rabbit lung macrophage bactericidal peptides.</a> PNAS. 86 (262-266), (1989).</li><li>Dimarcq, J. -. L., Bulet, P., Hetru, C., Hoffmann, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cysteine-rich+antimicrobial+peptides+in+invertebrates.">Cysteine-rich antimicrobial peptides in invertebrates.</a> Biopolymers. 47, 465-477 (1998).</li><li>Shafee, T. M. A., Lay, F. T., Hulett, M. D., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Defensins+Consist+of+Two+Independent,+Convergent+Protein+Superfamilies.">The Defensins Consist of Two Independent, Convergent Protein Superfamilies.</a> Mol Biol Evol. 33 (9), 2345-2356 (2016).</li><li>Zhu, S., Gao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nematode-derived+drosomycin-type+antifungal+peptdies+provide+evidence+for+plant-to-ecdysozoan+horizontal+transfer+of+a+disease+resistance+gene.">Nematode-derived drosomycin-type antifungal peptdies provide evidence for plant-to-ecdysozoan horizontal transfer of a disease resistance gene.</a> Nat Commun. 5, (2014).</li><li>Zhu, S., Gao, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evolutionary+origin+of+b-defensins.">Evolutionary origin of b-defensins.</a> Dev. Comp. Immunol. 39, 79-84 (2013).</li><li>Bonmatin, J. -. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-dimensional+1H+NMR+study+of+recombinant+insect+defensin+A+in+water:+Resonance+assignments,+secondary+structure+and+global+folding.">Two-dimensional 1H NMR study of recombinant insect defensin A in water: Resonance assignments, secondary structure and global folding.</a> J Biomol NMR. 2 (3), 235-256 (1992).</li><li>Cornet, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refined+three-dimensional+solution+structure+of+insect+defensin+A.">Refined three-dimensional solution structure of insect defensin A.</a> Structure. 3 (5), 435-448 (1995).</li><li>Murzin, A. G., Brenner, S. E., Hubbard, T., Chothia, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SCOP:+a+structural+classification+of+proteins+database+for+the+investigations+of+sequences+and+structures.">SCOP: a structural classification of proteins database for the investigations of sequences and structures.</a> J Mol Biol. 247, 536-540 (1995).</li><li>Sillitoe, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CATH:+comprehensive+structural+and+functional+annotations+for+genome+sequences.">CATH: comprehensive structural and functional annotations for genome sequences.</a> Nucleic Acids Res. 43, 376-381 (2015).</li><li>Lam, S. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene3D:+expanding+the+utility+of+domain+assignments.">Gene3D: expanding the utility of domain assignments.</a> Nucleic Acids Res. 44, 404-409 (2016).</li><li>Tarr, D. E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Establishing+a+reference+array+for+the+CS-ab+superfamily+of+defensive+peptides.">Establishing a reference array for the CS-ab superfamily of defensive peptides.</a> BMC Res Notes. 9, 490 (2016).</li><li>Shafee, T. M. A., Robinson, A. J., van der Weerden, N., Anderson, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+homology+guided+alignment+of+cysteine+rich+proteins.">Structural homology guided alignment of cysteine rich proteins.</a> SpringerPlus. 5 (27), (2016).</li><li>Altschul, S. F., Gish, W., Miller, W., Myers, E. W., Lipman, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basic+Local+Alignment+Search+Tool.">Basic Local Alignment Search Tool.</a> J Mol Biol. 215 (3), 403-410 (1990).</li><li>Duckert, P., Brunak, S., Blom, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+proprotein+convertase+cleavage+sites.">Prediction of proprotein convertase cleavage sites.</a> Protein Eng Des Sel. 17 (1), 107-112 (2004).</li><li>Petersen, T. N., Brunak, S., von Heijne, G., Nielsen, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SignalP+4.0:discriminating+signal+peptides+from+transmembrane+regions.">SignalP 4.0:discriminating signal peptides from transmembrane regions.</a> Nat Methods. 8, 785-786 (2011).</li><li>Kobayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cysteine-stabilized+a-helix:+A+common+structural+motif+of+ion-channel+blocking+neurotoxic+peptides.">The cysteine-stabilized a-helix: A common structural motif of ion-channel blocking neurotoxic peptides.</a> Biopolymers. 31, 1213-1220 (1991).</li><li>Gao, B., del Carmen Rodriguez, M., Lanz-Mendoza, H., Zhu, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=AdDLP,+a+bacterial+defensin-like+peptide,+exhibits+anti-Plasmodium.+activity.">AdDLP, a bacterial defensin-like peptide, exhibits anti-Plasmodium. activity.</a> Biochem Biophys Res Commun. 387, 393-398 (2009).</li><li>Tamura, K., Stecher, G., Peterson, D., Filipski, A., Kumar, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MEGA6:+Molecular+Evolutionary+Genetics+Analysis.">MEGA6: Molecular Evolutionary Genetics Analysis.</a> Mol Biol Evol. 30 (12), 2725-2729 (2013).</li><li>Edgar, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MUSCLE:+multiple+sequence+alignment+with+high+accuracy+and+high+throughput.">MUSCLE: multiple sequence alignment with high accuracy and high throughput.</a> Nucleic Acids Res. 32 (5), 1792-1797 (2004).</li><li>Ronquist, F., Huelsenbeck, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MrBayes+3:+Bayesian+phylogenetic+inference+under+mixed+models.">MrBayes 3: Bayesian phylogenetic inference under mixed models.</a> Bioinformatics. 19 (12), 1572-1574 (2003).</li><li>Altschul, S. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gapped+BLAST+and+PSI-BLAST:+a+new+generation+of+protein+database+search+programs.">Gapped BLAST and PSI-BLAST: a new generation of protein database search programs.</a> Nucleic Acids Res. 25 (17), 3389-3402 (1997).</li><li>Zhang, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+sequence+similarity+searches+using+patterns+as+seeds.">Protein sequence similarity searches using patterns as seeds.</a> Nucleic Acids Res. 26 (17), 3986-3990 (1998).</li></ol>

המחבר אין לחשוף.

הקריטריונים למתן חלבון בתוך קבוצה צריכה להיות ברורה, אבל זה לא תמיד המקרה. רצפים זאת יש CS-αβ מקפלים נחקרו במעבדות רבות באמצעות מגוון רחב של אורגניזמים, וכתוצאה מכך מערכות שונות של נומנקלטורה, וכן ברמות שונות של אפיון. בניסיון לכפות במינוח חדש לחלוטין אינה סבירה ולא יגרום בלבול רב כאשר ייעו?...

השם של חלבון לשקף היא המאפיינים ואת היחסים חלבונים אחרים. למרבה הצער, שמות מוקצים בדרך כלל בזמנו של גילוי, וכמו המחקר ממשיך, ההבנה של הקשר גדול עשוי להשתנות. זה יכול להוביל שמות מרובים אם חלבון זוהתה באופן עצמאי על ידי מעבדה אחד או יותר, שינויי המינוח או בכל המאפיינים נחשב סופית בעת הקצאת השם, שם כבר לא מספיק המבדילים את החלבון מאחרים.
הגעה defensins ספק דוגמה טובה של ניוון נומנקלטורה, סיווג. Defensins הגעה הראשונה דווחו מפני חרקים, השם "חרק defensin" הוצע בהתאם הנתפס הומולוגיה ל- defensins בתרבית של1,2. המונח defensin משמש עדיין, למרות שזה עכשיו לנקות את defensins הגעה, יונקים אל תשתף3,אב קדמון משותף4. תלוי בזן, חסרי חוליות "defensin" ייתכן cysteines 6-8 (שיוצרים חוב דיסולפידי שלושה או ארבעה) ועוד מגוון של פעילות מיקרוביאלית. כדי לסבך את המצב, חלבונים עם מאפיינים זהים כפי defensins לא תמיד מכונים "defensins," כמו cremycins שזוהה לאחרונה Caenorhabditis remanei5. בנוסף, הגעה defensins גדול הם נוטים יותר להיות קשור אבולוציונית חוליות β-defensins מאשר ל- defensins הגעה אחרים6. למרות זאת, החוקרים לפעמים להסתמך על השם "defensin" בעת קביעת רצפי אשר צריכים להיכלל ניתוחים.
מחקרים מבניים נחשף הדמיון בין חרקים defensins עקרב רעלים7, הקיפול CS-αβ הוקמה לאחר מכן מאפיין מבנית של חרקים defensins8. הקיפול מגדיר את superfamily (CS-αβ) של הרעלן דמוי עקרב ב מבניים סיווג של חלבונים (SCOP) מסד הנתונים9, הכולל חמש המשפחות: defensins חרקים, קצר-שרשרת העקרב רעלים, ארוכי שרשרת העקרב רעלים, MGD-1 (מ רכיכה), צמח defensins. Superfamily הזה הוא נרדף עם חבר העמים תיאר לאחרונה-defensins4 ו Superfamily 3.30.30.1010,מסד נתונים תלת-ממדיים הצנתור/ג'ין11. מחקרים מתוך מגוון של הגעה taxa, צמחים, פטריות הצג כי השמות של חלבונים המכילים הקיפול שאינן בבירור קשורות לציסטאין מספר או דפוס התקשרות, פעילות מיקרוביאלית או היסטוריה אבולוציונית12.
חוסר העקביות ואת קריטריונים ברורים לעשות את זה מאתגר שם ולסווג זיהו לאחרונה רצפי superfamily הזה. מכשול גדול השוואת חלבונים ב superfamily הזה הוא cysteines ממוספרים ביחס לכל בודדים רצף (ציסטאין הראשון ברצף כל הוא C1), בלי שום דרך להסביר התפקיד המבני. משמעות הדבר היא כי ניתן להשוות רק רצפים עם מספר זהה של cysteines. יש קטן שימור רצף שונה cysteines ויוצרים, מקפלים CS-αβ שהופך היישורים וניתוחים פילוגנטי קשה. על ידי פיתוח מערכת מספור קובע סדר עדיפויות של תכונות מבניות, רצפים superfamily יכול להיות בקלות רבה יותר בהשוואה, מיושר. תכונות שנשמרת, כמו גם אלה הגדרת קבוצות, ניתן לאבחן במהירות, רצפים החדש ניתן להציב יותר בקלות לתוך הקשר המתאים.
מאמר זה משתמש בתכנת (למשל, Excel) ליצור הפניה מספור מערכת superfamily CS-αβ. זה מראה איך זה מבהיר השוואות בין רצפים והחלתו רצפים CS-αβ החדש מזוהה של tardigrades. כדוגמא את superfamily CS-αβ, הפרוטוקול נכתב כדי לספק הדרכה בעת שימוש רצפים של עניין; עם זאת, זה לא נועד לפרט הזה superfamily או רצפי ציסטאין-עשיר. שיטה זו צפוי להיות שימושית במיוחד עבור קבוצות של חלבונים אשר נחקרו באופן עצמאי ב- taxa מתפצלת ו/או יש רצף הומולוגיה הכולל קטן, עם מאפיינים בדידה זה לא ניתן בקלות לזהות תוכנות אנליזה מולקולרית. שיטה זו דורשת כמה החלטות קודמת לגבי תכונות חשובות, אז זה יהיה של השירות מוגבל אם אין תכונות חשובות זוהו. המטרה העיקרית היא להראות כיצד ניתן להשיג פריט חזותי פשוט הגומלין רצף. לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להודיע עימוד רצפים וניתוח, אבל אם יישור וניתוח המטרות, שיטת ברקוד יהיה חלופה בעלת קיבולת נוספת עבור אוטומציה13. השיטה הנוכחית מציגה את התכונות של כל פפטיד בצורה לינארית, אז זה לא יהיה שימושי עבור הפריט החזותי ישירה של מבנה תלת-ממדי.

<table><tbody><tr><td>BLAST webpage</td><td></td><td></td><td>https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</td></tr><tr><td>EditSeq (Lasergene suite)</td><td>DNASTAR</td><td></td><td>https://www.dnastar.com/t-allproducts.aspx</td></tr><tr><td>Excel 2013</td><td>Microsoft</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FigTree</td><td></td><td></td><td>&amp;nbsp;http://tree.bio.ed.ac.uk/software/figtree/</td></tr><tr><td>MEGA</td><td></td><td></td><td>www.megasoftware.net</td></tr><tr><td>MrBayes</td><td></td><td></td><td>http://mrbayes.sourceforge.net/</td></tr><tr><td>SCOP database</td><td></td><td></td><td>http://scop.mrc-lmb.cam.ac.uk/scop/</td></tr></tbody></table>

creating and applying a reference to facilitate the discussion and classification of proteins in a diverse group

חלבונים הקשורים נחקרו במעבדות שונות באמצעות אורגניזמים משתנות מעצמן מערכת אחידה של נומנקלטורה, סיווג, ולכן קשה לדבר על הקבוצה בכללותה, למקום חדש רצפים לתוך הקשר המתאים. פיתוח הפניה לפי עדיפות רצף חשוב תכונות הקשורות למבנה ו/או פעילות יכול לשמש בנוסף שמות הוקמה כדי להוסיף קצת קוהרנטיות קבוצה מגוונת של חלבונים. מאמר זה משתמש מיוצב ציסטאין סליל אלפא (CS-αβ) superfamily כדוגמה להראות איך הפניה המופקים בתכנת יכולים להבהיר את קשרי הגומלין בין החלבונים הקיימים ב- superfamily, וכן להקל על התוספת של חדש רצפים. הוא גם מראה איך ההפניה יכול לעזור כדי לחדד היישורים רצף שנוצר בתוכנה נפוץ, אשר משפיעה על תוקפה של ניתוח פילוגנטי. השימוש של הפניה צפוי להיות מועיל ביותר עבור קבוצות חלבון הכוללות רצפים מאוד מתפצלת מתוך קשת רחבה של taxa, עם תכונות לא מספקת בשבי על ידי ניתוחים מולקולריים.

קבוצות של רצפי superfamily CS-αβ דיווחו בספרות מוצגים באיור4. זיווגים ציסטאין סמך את המספור עבור כל רצף מציע חמש קבוצות בסיסיות (טבלה 1, העמודה האמצעית). קבוצה 1 יש שישה cysteines זה דיסולפידי שלוש איגרות חוב, כולל רצפים מפני חרקים, זוהי חברת, רכיכות, נמטודות, ו?...

Watch this Scientific Journal Video about Creating and Applying a Reference to Facilitate the Discussion and Classification of Proteins in a Diverse Group at JoVE.com

Creating and Applying a Reference to Facilitate the Discussion and Classification of Proteins in a Diverse Group

ליצירה והחלה הפניה כדי לקדם את הדיון ואת הסיווג של חלבונים בתוך קבוצה מגוונת

המטרה של פרוטוקול זה היא לפתח התייחסות חלבונים מתבדרת בקבוצה חסר קוהרנטי לקריטריונים במינוח והסיווג. הפניה זו יקל על ניתוח ודיון של הקבוצה בכללותה, יכול לשמש שמות הוקמה.

Related proteins that have been studied in different labs using varying organisms may lack a uniform system of nomenclature and classification, making it ...

creating-applying-reference-to-facilitate-discussion-classification

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Behavior

7.0K Views.  Midwestern University. המטרה של פרוטוקול זה היא לפתח התייחסות חלבונים מתבדרת בקבוצה חסר קוהרנטי לקריטריונים במינוח והסיווג. הפניה זו יקל על ניתוח ודיון של הקבוצה בכללותה, יכול לשמש שמות הוקמה.

Video: Creating and Applying a Reference to Facilitate the Discussion and Classification of Proteins in a Diverse Group

Investigating Protein Sequence-structure-dynamics Relationships with Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality for: (1) The identification of related protein structure sets to user specified thresholds of similarity; (2) Their multiple alignment and structure superposition; (3) Sequence and structure conservation analysis; (4) Inter-conformer relationship mapping with principal component analysis, and (5) comparison of predicted internal dynamics via ensemble normal mode analysis. This integrated functionality provides a complete online workflow for investigating sequence-structure-dynamic relationships within protein families and superfamilies.

A protocol for the online investigation of protein sequence-structure-dynamics relationships using Bio3D-web is presented.

חקירת חלבון רצף-מבנה-דינמיקה יחסים עם Bio3D-web

We demonstrate the usage of Bio3D-web for the interactive analysis of biomolecular structure data. The Bio3D-web application provides online functionality ...

Biochemistry

mRNA Interactome Capture from Plant Protoplasts

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional gene regulation (PTGR) of messenger RNAs (mRNAs). In the past few years, a number of mRNA-bound proteomes from yeast and mammalian cell lines have been successfully isolated through the use of a novel method called &#34;mRNA interactome capture,&#34; which allows for the identification of mRNA-binding proteins (mRBPs) directly from a physiological environment. The method is composed of in vivo ultraviolet (UV) crosslinking, pull-down and purification of messenger ribonucleoprotein complexes (mRNPs) by oligo(dT) beads, and the subsequent identification of the crosslinked proteins by mass spectrometry (MS). Very recently, by applying the same method, several plant mRNA-bound proteomes have been reported simultaneously from different Arabidopsis tissue sources: etiolated seedlings, leaf tissue, leaf mesophyll protoplasts, and cultured root cells. Here, we present the optimized mRNA interactome capture method for Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts, a cell type that serves as a versatile tool for experiments that include various cellular assays. The conditions for optimal protein yield include the amount of starting tissue and the duration of UV irradiation. In the mRNA-bound proteome obtained from a medium-scale experiment (107 cells), RBPs noted to have RNA-binding capacity were found to be overrepresented, and many novel RBPs were identified. The experiment can be scaled up (109 cells), and the optimized method can be applied to other plant cell types and species to broadly isolate, catalog, and compare mRNA-bound proteomes in plants.

Here, we present an interactome capture protocol applied to Arabidopsis thaliana leaf mesophyll protoplasts. This method critically relies on in vivo UV crosslinking and allows for the isolation and identification of plant mRNA-binding proteins from a physiological environment.

MRNA Interactome ללכוד מן Protoplasts הצמח

RNA-binding proteins (RBPs) determine the fates of RNAs. They participate in all RNA biogenesis pathways and especially contribute to post-transcriptional ...

Mass Spectrometry-Based Proteomics Analyses Using the OpenProt Database to Unveil Novel Proteins Translated from Non-Canonical Open Reading Frames

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame (ORF) annotation impose two arbitrary criteria: a minimum length of 100 codons and a single ORF per transcript. However, a growing number of studies report expression of proteins from allegedly non-coding regions, challenging the accuracy of current genome annotations. These novel proteins were found encoded either within non-coding RNAs, 5' or 3' untranslated regions (UTRs) of mRNAs, or overlapping a known coding sequence (CDS) in an alternative ORF. OpenProt is the first database that enforces a polycistronic model for eukaryotic genomes, allowing annotation of multiple ORFs per transcript. OpenProt is freely accessible and offers custom downloads of protein sequences across 10 species. Using OpenProt database for proteomic experiments enables novel proteins discovery and highlights the polycistronic nature of eukaryotic genes. The size of OpenProt database (all predicted proteins) is substantial and need be taken in account for the analysis. However, with appropriate false discovery rate (FDR) settings or the use of a restricted OpenProt database, users will gain a more realistic view of the proteomic landscape. Overall, OpenProt is a freely available tool that will foster proteomic discoveries.

OpenProt is a freely accessible database that enforces a polycistronic model of eukaryotic genomes. Here, we present a protocol for the use of OpenProt databases when interrogating mass spectrometry datasets. Using OpenProt database for analysis of proteomic experiments allows for discovery of novel and previously undetectable proteins.

ניתוחים פרוטאומיקס מבוססי ספקטרומטר מסה משימוש במסד הנתונים OpenProt לחשוף את הרומן חלבונים מתורגם ממסגרות קאנונית קריאה פתוחה

Genome annotation is central to today's proteomic research as it draws the outlines of the proteomic landscape. Traditional models of open reading frame ...

Genetics

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering (SEC-MALS)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in solution, is a relative technique that relies on the elution volume of the analyte to estimate molecular weight. When the protein is not globular or undergoes non-ideal column interactions, the calibration curve based on protein standards is invalid, and the molecular weight determined from elution volume is incorrect. Multi-angle light scattering (MALS) is an absolute technique that determines the molecular weight of an analyte in solution from basic physical equations. The combination of SEC for separation with MALS for analysis constitutes a versatile, reliable means for characterizing solutions of one or more protein species including monomers, native oligomers or aggregates, and heterocomplexes. Since the measurement is performed at each elution volume, SEC-MALS can determine if an eluting peak is homogeneous or heterogeneous and distinguish between a fixed molecular weight distribution versus dynamic equilibrium. Analysis of modified proteins such as glycoproteins or lipoproteins, or conjugates such as detergent-solubilized membrane proteins, is also possible. Hence, SEC-MALS is a critical tool for the protein chemist who must confirm the biophysical properties and solution behavior of molecules produced for biological or biotechnological research. This protocol for SEC-MALS analyzes the molecular weight and size of pure protein monomers and aggregates. The data acquired serve as a foundation for further SEC-MALS analyses including those of complexes, glycoproteins and surfactant-bound membrane proteins.

Characterization of Proteins by Size-Exclusion Chromatography Coupled to Multi-Angle Light Scattering SEC-MALS

This protocol describes the combination of size exclusion chromatography with multi-angle light scattering (SEC-MALS) for absolute characterization of proteins and complexes in solution. SEC-MALS determines the molecular weight and size of pure proteins, native oligomers, heterocomplexes and modified proteins such as glycoproteins.

אפיון של חלבונים לפי גודל כרומטוגרפיה הדרה מצמידים לפיזור אור רב זווית (SEC-דוליטל)

Analytical size-exclusion chromatography (SEC), commonly used for the determination of the molecular weight of proteins and protein-protein complexes in ...

TMT Sample Preparation for Proteomics Facility Submission and Subsequent Data Analysis

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view of the impact of a disease, treatment, or other condition on the proteome as a whole. This report provides a detailed protocol for the extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, and subsequent data analysis of protein samples. Our optimized TMT labeling protocol requires a lower tag-label concentration and achieves consistently reliable data. We have used this protocol to evaluate protein expression profiles in a variety of mouse tissues (i.e., heart, skeletal muscle, and brain) as well as cells cultured in vitro. In addition, we demonstrate how to evaluate thousands of proteins from the resulting dataset.

We present an optimized tandem mass tag (TMT) labeling protocol that includes detailed information for each of the following steps: protein extraction, quantification, precipitation, digestion, labeling, submission to a proteomics facility, and data analyses.

הכנה לדוגמא להגשת מתקנים פרוטאומניקס וניתוח נתונים שלאחר מכן

Proteomic technologies are powerful methodologies that can aid our understanding of mechanisms of action in biological systems by providing a global view ...

JUMPn: A Streamlined Application for Protein Co-Expression Clustering and Network Analysis in Proteomics

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. However, deriving biological insights from such valuable datasets is challenging. Here we introduce a systems biology-based software JUMPn, and its associated protocol to organize the proteome into protein co-expression clusters across samples and protein-protein interaction (PPI) networks connected by modules (e.g., protein complexes). Using the R/Shiny platform, the JUMPn software streamlines the analysis of co-expression clustering, pathway enrichment, and PPI module detection, with integrated data visualization and a user-friendly interface. The main steps of the protocol include installation of the JUMPn software, the definition of differentially expressed proteins or the (dys)regulated proteome, determination of meaningful co-expression clusters and PPI modules, and result visualization. While the protocol is demonstrated using an isobaric labeling-based proteome profile, JUMPn is generally applicable to a wide range of quantitative datasets (e.g., label-free proteomics). The JUMPn software and protocol thus provide a powerful tool to facilitate biological interpretation in quantitative proteomics.

We present a systems biology tool JUMPn to perform and visualize network analysis for quantitative proteomics data, with a detailed protocol including data pre-processing, co-expression clustering, pathway enrichment, and protein-protein interaction network analysis.

JUMPn: יישום יעיל עבור אשכולות ביטוי משותף של חלבונים וניתוח רשת בפרוטאומיקה

With recent advances in mass spectrometry-based proteomics technologies, deep profiling of hundreds of proteomes has become increasingly feasible. ...

An Optimized Quantitative Pull-Down Analysis of RNA-Binding Proteins Using Short Biotinylated RNA

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying the binding partners of an RNA of interest remains of high importance to unveil the mechanisms behind many cellular processes. However, RNA molecules might interact transiently and dynamically with some RNA-binding proteins (RBPs), especially with non-canonical ones. Hence, improved methods to isolate and identify such RBPs are greatly needed.
To identify the protein partners of a known RNA sequence efficiently and quantitatively, we developed a method based on the pull-down and characterization of all interacting proteins, starting from cellular total protein extract. We optimized the protein pull-down using biotinylated RNA pre-loaded on streptavidin-coated beads. As a proof of concept, we employed a short RNA sequence known to bind the neurodegeneration-associated protein TDP-43 and a negative control of a different nucleotide composition but the same length. After blocking the beads with yeast tRNA, we loaded the biotinylated RNA sequences on the streptavidin beads and incubated them with the total protein extract from HEK 293T cells. After incubation and several washing steps to remove nonspecific binders, we eluted the interacting proteins with a high-salt solution, compatible with the most commonly used protein quantification reagents and with sample preparation for mass spectrometry. We quantified the enrichment of TDP-43 in the pull-down performed with the known RNA binder compared to the negative control by mass spectrometry. We used the same technique to verify the selective interactions of other proteins computationally predicted to be unique binders of our RNA of interest or of the control. Finally, we validated the protocol by western blot via the detection of TDP-43 with an appropriate antibody. 
This protocol will allow the study of the protein partners of an RNA of interest in near-to-physiological conditions, helping uncover unique and unpredicted protein-RNA interactions.

Here, we present an optimized in vitro method to uncover, quantify, and validate protein interactors of specific RNA sequences, using total protein extract from human cells, streptavidin beads coated with biotinylated RNA, and mass spectrometry analysis.

ניתוח כמותי אופטימלי של חלבונים קושרי RNA באמצעות RNA קצר ביוטינילציה

Protein-RNA interactions regulate gene expression and cellular functions at transcriptional and post-transcriptional levels. For this reason, identifying ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

פרוטוקול מבנה מחשב מבוסס חלבון חיזוי פונקציה

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

Biology

Interactome-Seq: A Protocol for Domainome Library Construction, Validation and Selection by Phage Display and Next Generation Sequencing

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to poorly folding proteins or random open reading frames. We have developed a strategy where, by using TEM-1 &#946;-lactamase (the enzyme conferring ampicillin resistance) on a genomic scale, we can select collections of correctly folded protein domains from the coding portion of the DNA of any intronless genome. The protein fragments obtained by this approach, the so called &#34;domainome&#34;, will be well expressed and soluble, making them suitable for structural/functional studies.
By cloning and displaying the &#34;domainome&#34; directly in a phage display system, we have showed that it is possible to select specific protein domains with the desired binding properties (e.g., to other proteins or to antibodies), thus providing essential experimental information for gene annotation or antigen identification.
The identification of the most enriched clones in a selected polyclonal population can be achieved by using novel next-generation sequencing technologies (NGS). For these reasons, we introduce deep sequencing analysis of the library itself and the selection outputs to provide complete information on diversity, abundance and precise mapping of each of the selected fragment. The protocols presented here show the key steps for library construction, characterization, and validation.

The protocols described allow the construction, characterization and selection (against the target of choice) of a &#34;domainome&#34; library made from any DNA source. This is achieved by a research pipeline that combines different technologies: phage display, a folding reporter and next generation sequencing with a web tool for data analysis.

Interactome-Seq: פרוטוקול עבור ספריית Domainome ובניה, אימות בחירה Phage התצוגה ורצף הדור הבא

Folding reporters are proteins with easily identifiable phenotypes, such as antibiotic resistance, whose folding and function is compromised when fused to ...

An Integrated Approach for Microprotein Identification and Sequence Analysis

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model organisms. However, despite this wealth of sequence information, comprehensive gene annotation efforts have proven challenging, especially for small proteins. Notably, conventional protein annotation methods were designed to intentionally exclude putative proteins encoded by short open reading frames (sORFs) less than 300 nucleotides in length to filter out the exponentially higher number of spurious noncoding sORFs throughout the genome. As a result, hundreds of functional small proteins called microproteins (&#60;100 amino acids in length) have been incorrectly classified as noncoding RNAs or overlooked entirely.
Here we provide a detailed protocol to leverage free, publicly available bioinformatic tools to query genomic regions for microprotein-coding potential based on evolutionary conservation. Specifically, we provide step-by-step instructions on how to examine sequence conservation and coding potential using Phylogenetic Codon Substitution Frequencies (PhyloCSF) on the user-friendly University of California Santa Cruz (UCSC) Genome Browser. Additionally, we detail steps to efficiently generate multiple species alignments of identified microprotein sequences to visualize amino acid sequence conservation and recommend resources to analyze microprotein characteristics, including predicted domain structures. These powerful tools can be used to help identify putative microprotein-coding sequences in noncanonical genomic regions or to rule out the presence of a conserved coding sequence with translational potential in a noncoding transcript of interest.

The protocol described here provides detailed instructions on how to analyze genomic regions of interest for microprotein-coding potential using PhyloCSF on the user-friendly UCSC Genome Browser. Additionally, several tools and resources are recommended to further investigate sequence characteristics of identified microproteins to gain insight into their putative functions.

גישה משולבת לזיהוי מיקרופרוטאינים וניתוח רצף

Next-generation sequencing (NGS) has propelled the field of genomics forward and produced whole genome sequences for numerous animal species and model ...