Name: an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions
Uploaded: 2017-05-08T15:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions at JoVE.com

אנו מודים ל- Johnson &amp; Johnson, ל- TB Alliance, ל- Astra Zeneca, ל- Rib-X ול- Trius Therapeutics על אספקת bedaquiline, PA-824 (pretomanid), AZD5847, radezolid ו- tedized, בהתאמה. ברנדן פרידו, מתיו צימרמן, סטיבן ג&#39;וזווין, אמה ריי-ג&#39;וראדו, ננסי רואל, ליאן לי ודניאלה ויינר סיפקו תמיכה בניתוח MALDI, בשיטות ביואנליטיות, בהכנת תחליף המקרה, בסינתזה כימית ובבידוד של ארנבת ארנבת. עבודה זו התקיימה במימון של קרן ביל ומלינדה גייטס, פרס # OPP1044966 ו OPP1024050 ל V. Dartois, NIH משותפת Instrumentation גרנט S10OD018072, כמו גם מימון משותף של קרן ביל ומלינדה גייטס וולקום Trust עבור מרכז מצוינות עבור אופטימיזציה של עופרת למחלות העולם המתפתח ל P. Wyatt.

כל המחקרים בבעלי חיים בוצעו בהתאם מדריך לטיפול ושימוש בחיות מעבדה של המכון הלאומי לבריאות באישור ועדת טיפול בבעלי חיים מוסדיים השימוש NIAID (NIH), Bethesda, MD. כל המחקרים היו מעורבים מ שחפת בוצעו במעבדה עם בלימת בטיחות ביולוגית ברמה 3 (BSL-3). 1. ארנב דגם זיהום Caseum אוסף <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להדביק ניו זילנד ארנבים לבנים עם שחפת באמצעות מערכת חשיפת תרסיס אף בלבד כפי שתואר לעיל. 12, 13 אפשר זיהום להתקדם במשך 12-16 שבועות. שלווים ארנבים עם 35 מ&quot;ג / ק&quot;ג קטמין 5 מ&quot;ג / ק&quot;ג xylazine לשריר, להרדים את הארנבים עם 0.22 מ&quot;ל / ק&quot;ג נתרן ו פניטואין נתרן pentobarbital לווריד ולהמשיך עם necropsies. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות פינצטה אזמל, להסיר ריאות מן ca החזה. מכל אונה ריאה, לנתח את חללים בודדים גרנולומה נמקית גדולה באמצעות איזמל. בזהירות לגרד את caseum מן החלל ואת הקירות גרנולומה. לשקול, להקליט דגימות החנות ב 2 מ&quot;ל בורג כתרים צינורות ב -20 ° C עד מוכן לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Gamma- להקרין את דגימות caseum זיהומיות ב 3 MegaRad על קרח יבש כדי להפוך אותם חסרי ובטוח לשימוש במעבדה BSL-2. </li></ol> 2. בשנת הדור גזרתי של Caseum פונדקאי THP-1 תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול THP-1 מונוציטים ב RPMI 1640 בינוני (2 מ&quot;מ L- גלוטמין 10% בסרום עוברי בסרום) ב T175 צלוחיות תרבות התא (80 מ&quot;ל / בקבוק). דגירה את צלוחיות באווירה 5% CO 2 ב 37 מעלות צלזיוס במשך 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה התרבות מבקבוק T175 בשני צינורות 50 מ&quot;ל חרוטי ב 150 xg במשך 5 דקות. מחק supernatant ו להשעות את גלולה 10 מ&quot;ל של התקשורת 1640 RPMI. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה 5 μL של תרבות זו לתוך צינור 1.5 מ&quot;ל המכיל 45 μL של tכחול. מערבבים היטב לפי pipetting. העברה 10 μL כדי hemocytometer ולספור את מספר monocytes THP-1 קיימא (ללא כתם) באמצעות מיקרוסקופ אור (הגדלה 10X). חישוב מספר תאים קיימא לכל מ&quot;ל של התרבות. לדלל אותו עם התקשורת RPMI לצפיפות הסופית של 1.25 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען 40 מ&quot;ל של התרבות על צלחת תרבות גדולה התא (50 x 10 6 תאים / צלחת). הוסף 40 μL של 100 מיקרומטר PMA (פורבול 12-myristate13 אצטט מוכן באתנול) ולאפשר לתאים לדבוק לילה בחממה. הערה: הריכוז הסופי של PMA הוא 100 ננומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדולל חומצה אולאית טהורה (OA) (0.89 גרם / מ&quot;ל) באתנול לריכוז של 0.1 M ( כלומר 31.7 OA μL ב 968.3 אתנול μL). לדלל את הפתרון הזה טריים מראש חימם מדיה RMPI לריכוז של 10 מ&quot;מ. לדלל את ההשעיה OA ל 0.4 מ&quot;מ (ריכוז עובד הסופי) בינוני RPMI מראש חימם ל 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המדיה הקיימת ולא אתתאים -adhered מן צלחות תרבית תאים ולהוסיף בעדינות 40 מ&quot;ל של 0.4 מ&quot;מ OA אל מקרופאגים THP-1 (THP-M). לדגור על 37 מעלות צלזיוס בחממה לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במיקרוסקופ אור בהגדלה 40x חזותי לאשר הנוכחות של תכלילים גוף שומנים רבים בכל THP-M. הסר את כל מדיום RPMI מן צלחות תרבית תאים בעדינות לשטוף את התאים החסידים פעמים עם בופר פוספט (PBS) בעזרת פיפטה סרולוגיות 50 מיליליטר. הערה: גופים ליפידים להופיע קטן, ברור, מבנים כדוריים בציטופלסמה של THP-M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 40 מ&quot;ל של 5 מ&quot;מ חומצה ethylenediaminetetraacetic (EDTA) ב PBS על כל צלחת. דגירה של 15 דקות ב 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרידו את מקרופאגים מקציף (FM) על ידי pipetting מעלה שוב ושוב ושוב על פני השטח של צלחת כולו באמצעות פיפטה סרולוגיות 10 מ&quot;ל. מעבירים את ההשעיה לתא צינור חרוטי 50 מ&quot;ל ומסובב ב XG 150 עבור 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התא גלולה ב 10 מ&quot;ל של PBS (לשטוף PBS השלישי) אnd להעביר צינורות חרוטי טרום שקל 15 מ&quot;ל. ספין למטה שוב ב XG 150 עבור 5 דקות. בזהירות לשאוב supernatant בעזרת פיפטה, נושא הפסולת סרולוגיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנושא את כדורי FM כדי 3 מחזורים להקפיא להפשיר כדי lyse תאי דגירה אותם 75 מעלות צלזיוס למשך 20-30 דקות כדי לפגל חלבונים במטריצה. אחסן את כדורי נייר -20 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol> Assay 3. דיאליזה ראפיד איזון (RED) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10 מניות פתרונות מ&quot;מ של כל תרכובות בדיקת sulfoxide דימתיל (DMSO). לדלל את 500 מיקרומטר עובד פתרונות DMSO לפני כל assay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את הצינור המכיל את הגלולה הפונדקאית caseum. הפחת משקל הצינור הריק כדי לגזור את המשקל של הגלולה לבד. להוסיף 2-3 חרוזי מתכת לכל צינור ו, באמצעות homogenizer רקמות בבית 1200 משייכות / min 1 דק &#39;, לשבש caseum או המטריצה ​​הפונדקאית ב PBS (1: 9 w / v) כדי להשיג 10x השעיה מדוללת של כל מטריצה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספייק 6.5 μL של 500ΜM הפתרון של המתחם הבדיקה לתוך 643.5 μL של homogenate כדי להשיג את הריכוז הסופי של 5 מיקרומטר (≤ 1% DMSO) ו מערבולת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את התוספות האדומות בצלחת הבסיס. הוסף 200 μL של מטריקס סמים ממוסגרת לתא התורם (טבעת אדומה) של כל הוספה אדום ו 350 μL של PBS לתוך כל חדר המקלט. הכן 3 מוסיף עבור כל מתחם הבדיקה (דגימות בשלושה עותקים). צלחת חותם עם דבק צלחת דבק ו דגירה על 37 מעלות צלזיוס על thermomixer ב 200 סל&quot;ד (1 xg) במשך 4 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הדגירה, לערבב בעדינות את התוכן של התורם ו המקלט חדרים על ידי pipetting מעלה ומטה 2-3 פעמים. פיפטה 20 aliquots μL של homogenate מתאי התורם ולהוסיף 20 μL של PBS נקי בצינור 1.5 מ&quot;ל (1: 1). באופן דומה, פיפטה 20 aliquots μL של דגימות PBS מתאי המקלט ולהוסיף μL 20 של homogenate נקי (התאמה מטריקס). 8 הערה: התאמת מטריקס מבטלת את neעבור 2 עקומות כיול נפרד (ב homogenate ו PBS) כדי להיעשות לצורך ניתוח כמותי. התוכן של החדר התורם עשוי משקעים לאורך זמן. בעדינות לערבב את התוכן על ידי pipetting לפני הסרת aliquots. </li></ol> 4. כימות LC-MS וניתוח נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 160 μL של 1: 1 מתנול: אצטוניטריל המכיל 500 ng / מ&quot;ל ​​diclofenac או 10 ng / מ&quot;ל ​​verapamil (תקן פנימי) על כל צינור ו מערבולת כדי לזרז חלבונים. צנטריפוגה ב XG 10,000 במשך 5 דקות למשקע משקע והעברת supernatants לתוך 96 היטב טוב צלחות היטב עבור ניתוח כרומטוגרפי נוזלי ספקטרומטריית מסה (LCMS). 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בניית עקומות כיול מ 1-1,000 ננומטר עבור כל מתחם הבדיקה תוך שמירה על הרכב מטריקס זהה הדוגמאות לעיל. לכמת את הריכוז של מתחם הבדיקה בדגימות של התורם ו המקלט חדרים באמצעות שיטה LC-MS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חישוב החלק השבריר ( f u ) oF התרופה במטריצה מדוללת באמצעות משוואה 1. חשבה את f u במטריצה חייה באמצעות משוואה 2 (D = דילול פקטור של 10). 14 <img alt="משוואה 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="משוואה 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק את ההתאוששות (מאזן מסה) של כל מתחם באמצעות משוואה 3 לזהות תרכובות עם יציבות / המטבוליזם / בעיות כריכה הלא ספציפיות. הערה: שחזור בדרך כלל נופל בין 70% ו 130%. 15 <img alt="משוואה 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+versus+bugs:+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis.">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis.">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li><li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy.">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li><li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis.">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions.">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li><li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding.">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li><li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Equilibrium+Dialysis+(RED):+an+In-vitro+High-Throughput+Screening+Technique+for+Plasma+Protein+Binding+using+Human+and+Rat+Plasma.">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid.">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li><li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+localization,+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat.">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+a+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li><li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+Granulomas+are+Hypoxic+in+Guinea+pigs,+Rabbits,+and+Non-Human+Primates.">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li><li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure:+implications+for+rational+drug+discovery.">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li><li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis.">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li><li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910.">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li></ol>

אין אינטרסים פיננסיים מתחרים.

נגעים וחללי נימקי ריאתי בחולים שנדבק בשחפת לכלול תת-אוכלוסיות של חיידקים שנמצאים סרבנים טיפול תרופתי. ליבות caseous של מבנים אלה הן בעיקר אחראיות מחסה persisters אלה בסביבה תאית. 16 נוחים הפצה של חומרים אנטי-בקטריאליים במיקומים מרוחקים אלה הוא האמין להיות גורם חשוב של יעילות התרופה שחפת. לפני כניסתם לתוקף של פרוטוקול זה, לא היו זמינים טכניקות במבחנה שיכול לחזות את ההפצה של תרכובות גילוי תרופות בנגעים caseous. כתוצאה מכך, ההערכה של הפצת סמים ב מוקדים קריטיים אלה היה תלוי בכבדות על מודלים זיהום חיה, מחקרי פרמקוקינטיקה הממוקד הנגע וטכניקות הדמיה המוני ספקטרומטריית MALDI. 5, 17 את assay חוץ גופית המתואר הואמחדש הוא דרך מהירה ויעילה כדי לחזות חדירת תרופת נגעים שחפת ללא שעמום העלות המחקרית פרמקוקינטיקה vivo. הפרוטוקול הוא שינוי של assay מחייב חלבון פלזמה אשר היה במקור לשימוש המיועד של המכשיר RED. המגון של דגימות רקמה למרקם פיפטה-מסוגל מאפשר חלבון רקמות המחייבים להימדד באמצעות אותו המכשיר. פרוטוקול זה יכול להתנהל עם caseum אם הוא זמין ממודלים זיהום חיה. כפי שניתן לראות בתרשים 1 מסביר, מולקולות תרופה להיקשר מקרומולקולות ב caseum / homogenate הפונדקאית, שמירה על אותה בתא התורם, ואילו מולקולות התרופה המאוגדות חופשיות מפוזר על פני הקרום החדיר למחצה לתוך תא המקלט. השבר המאוגד (ו u) equilibrates בין שני התאים בתקופת הדגירה. כפי שניתן לראות בתרשים 2 ממחיש, מאוד תרכובות נקשר מאוד (ו u ≤ 1%) כי הם AlmoSt לגמרי לכודים בתוך החדר התורם אינם יעילים במקרה מחלחל. מצד שני, תרכובות פחות קשורות (1% &lt; F &gt; &lt;100%) מסוגלות לפזר לליבת המקרה במעלות שונות; ככל שה- F גבוה יותר, כך הוא מתפשט באופן נרחב יותר באזור הנמק. הפרוטוקול יכול לשמש גם עם מטריצה ​​פונדקאית נגזר lipid נטען מקרופאגים THP-1 כי כבר המושרה עם חומצה אולאית. מספר תנאים לאינדוקציה של הצטברות של שומנים בדם נבדקו ב- THP-1. אלה כוללים היפוקסיה, חשיפה מ &#39;מוקרן שחפת וחשיפה טרהלוז 6,6&#39;-dimycolate (TMD) נגזר קיר התא mycobacterial. הריכוז הסופי הדגירה חומצה אולאית של 400 מיקרומטר הוכח לגרום לשיא הגוף השומנים היווצרות מבלי להתפשר על הכדאיות התא הידבקות. 7 דילול של חומצה אולאית מראש התקשורת מחומם הוא קריטי כדי להבטיח מקסימוםפירוק חומצת השומן. מטריצה ​​הפרוגרמה וכתוצאה מכך יש תוכן כולסטרול דומה caseum נכון, אבל גבוה יותר בטריגליצרידים ותכולת החלבון, בהתאמה. 7 כפי שמראה איור 3 , מחייב של 18 נגד שחפת תרכובות על מטריצה ​​פונדקאית מאוד בקורלציה עם מחייב שלהם caseum. המחקר האחרון שכלל גם תרכובות לא מסחריות עם פעילות bactricidal לא מוגדר הוכיח כי מטריקס נגזר FM הוא תחליף יעיל caseum. 7 על ידי הסרת הצורך מודלים זיהום בבעלי חיים, מטריצה ​​פונדקאית בהצלחה מגדילה את התפוקה של assay זה תוך ביצוע זה יותר חסכונית. זה פרוטוקול צדדי יכול לשמש גם כדי לבדוק תרכובות מרובות בו זמנית (בדיקות קלטת). יש לנו בעבר הראו כי בדיקות 5 סמים שילובים, כל 5 מיקרומטר, בכל להוסיף באמצעות פרוטוקול זה יכול למעשה לדרג המתחםS מבוסס על הקשרים שלהם מחייב הזיקה תוך חיסכון בזמן וחומרים. תרכובת שליטה השישית כגון moxifloxacin ניתן להוסיף את הקלטת כמו בקרה פנימית כדי להבטיח עקביות בין מבחני וקבוצות של caseum / surrogate. 7 חשוב לציין, פרוטוקול ניתן להפעיל עם מעט כמו 20 μL של מלאי 10 מ&quot;מ מתחם (&lt;&lt; 1 מ&quot;ג של תרכובת). זהו יתרון עצום בשלב מוקדם של תהליך גילוי התרופה כאשר כימאים לסנתז כמויות מוגבלות של כל מתחם למטרות ההקרנה. המכשיר אדום המכשיר הם אוטומציה ידידותית; טביעת הרגל microplate של צלחת הבסיס עושה את זה תואם עם מערכות אוטומטיות שנועדו להתמודד עם תקן 96-גם צלחות. למרות המטריצה ​​פונדקאית הוכח בהצלחה לחקות את המאפיינים מחייב של vivo caseum לשעבר ( איור 3 ) אנו מאשרים כי זה עלול באופן מדויק פרופיל compounds מסוימים. THP-1 מקרופאגים משמשים בדרך כלל <eמ &#39;&gt; במבחנה טכניקות כדי לדמות מקרופאגים מקדם את רקמת הריאה. עם זאת, מטריצה ​​פונדקאית הנגזרות THP-1 אין את ההרכב זהה החומר נקרטי caseos בנגעים הריאה. כתוצאה מכך, סוגים מסוימים של תרכובות מאי אינטראקציה אחרת עם מטריצה ​​פונדקאית. יתר על כן, ההצלחה של assay מותנה על היציבות של המתחם הבדיקה במטריצה ​​caseus. Caseum הוא מטריצה ​​ביולוגית כי מניות רכיבים רבים עם פלזמה, ומכאן פרוטוקול זה הוא רגיש בעיות השפלה מורכבת באותה דרך רבים מבוססי פלזמה מבחני גם. במובן זה, מטריקס תחליף THP-M נגזר עדיף בגלל שלב denaturation בפרוטוקול מסיר פעילות האנזים, שיפור ההתאוששות הכוללת בסוף assay. Assay מחייב במקרה caseay הוא כלי שימושי בשחפת גילוי סמים נמצא בשימוש במספר תוכניות אופטימיזציה אופטימיזציה. זה גם יכול לעזור לעצב יותר efמשלב שילוב משלב מבוסס על היכולת של תרופות בודדות לחלק את השכבות השונות של סוגים שונים של נגע. ניתן להתאים את הפרוטוקול גם כדי להקל על גילוי תרופות למחלות אחרות המאופיינות על ידי היווצרות נגעים או מורסות שבהן חדירת התרופות מוגבלת אך חיונית לטיפול מוצלח.

הטיפול במחלת שחפת ריאות מחייב הפצה יעילה של תרופות לסוגים שונים של נגעים. נגעים נקרוטיים וחללים מכילים מרכזים קוגניטיביים המאכלסים תת-אוכלוסיות של חיידקים סובלניים או &quot;מתמידים&quot;. 1 , 2 המחלה cavital קשורה עם שיעורי תרופה נחות ופרוגנוזה גרועה. 3 , 4 מחקרים קודמים הראו, באמצעות טכניקות כמותיות והדמיה, כי היכולת לחדור caseum משתנה באופן משמעותי משלב התרופות אחד למשנהו. 5 , 6 שיטות אלה, לעומת זאת, דורשים שימוש במודלים זיהום בבעלי חיים כי הם איטיים ומייגעים. ב assay במבחנה כי אמצעים מחייב סמים exum case vivo לשעבר תוכנן. מחייב זה נמצא בקורלציה הפוכה עם חדירת סמים גרנולומה במקרה, ומכאן, הואהמשמש כלי ניבוי. 7 שיווי המשקל דיאליזה נחשבת כגישה זהב רגיל למחקרים חלבון פלזמה מחייב. דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) המכשיר מספק מהיר, קל לשימוש מערכת אמינה לביצוע מבחנים כאלה. 8 המכשיר מורכב משני מרכיבים: תוספות חד פעמיות, חד פעמיות המורכבות משני תאים המופרדים על ידי גליל אנכי של קרום חדיר למחצה; ואת לוחות בסיס לשימוש חוזר שיכול להכיל עד 48 מוסיף בכל פעם. קרום דיאליזה יש 8 kDa משקל מולקולרי לחתוך (MWCO) כי הוא אידיאלי עבור מחקרים מקרומולקולה תרופה. היחס בין שטח השטח לנפח גדול של תא הממברנה מאפשר דיאליזה מהירה ושיווי משקל. הן התוספות והן צלחת הבסיס אומתו עבור מחייב מינימלי שאינו ספציפי. השילוב של המכשיר האדום עם טכניקות bioanalytical מספק הערכות מדויקות של שברים unbound של תרופות pLasma. 8 , 9 למרות תוכנן במקור למדוד מחלב פלזמה מחייב, המכשיר האדום כבר בשימוש במספר מחקרים מחייב רקמה באמצעות homogenates. 10 , 11 בפרוטוקול זה, אנו מודדים את התרופה מחייב caseum, פסולת נקרית נכרת מן נגעים נמק חללים של שפעת נגועים ארנבות. האופי ואת לא כלי הדם של חומר caseous עושה את זה קל homogenize לתוך ההשעיה הומוגנית התואמת assay. בהתחשב בכך caseum מייגע לייצר וקשה לבוא, הפרוטוקול יש גם תוקף לשימוש עם מטריצה ​​פונדקאית כי הוא מוכן מקרופאגים מקציף. THP-1 מונוציטים הנגזרות מקרופאגים הם המושרה עם חומצה אולאית לצבור מספר רב של גופים השומנים המעניקים להם את המראה &quot;מקציף&quot; שלהם. תאים אלה טעון שומנים נקצרים ומעובד כדי לייצר מטריצה ​​שאנחנו משתמשים בתור תחליף כדי caseum. מחקר זה הוכיח כי התרופה קשורה מטריקס זה פונדקאי מתואם היטב עם מחייב caseum, ביעילות מחקה את תהליך vivo כי מעכב חדירת סמים הליבה המקרה של גרנולומות וחללים.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White Rabbits</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&amp;nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocytic cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&amp;sup2; TC-Treated Flask (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media w/o glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Reusable Base Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Inserts, 50/box&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED insert removal tool&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive plate seal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac sodium salt</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Irradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&amp;nbsp;C-Chip Disposable Hemacytometers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Upright Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binary Liquid Chromatography system</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Multi-compenent</td></tr><tr><td>Mass spectrometer</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions

חיסול מחלת השחפת דורש משטרי סמים שיכולים לחדור לשכבות מרובות של נגעים ריאתיים מורכבים. התפלגות הסמים של ליבות המקרה של חללים ו lesions הוא חיוני במיוחד משום שהם הנמל subpopulations של חיידקים סובלני חיידקים גם נפוץ המכונה פרעות. שיטות קיימות למדידת חדירת סמים בשחפת שחלות כרוך יקר זמן רב במחקרים vivo pharmacokinetic יחד עם טכניקות bioanalytical או הדמיה. המדידה במבחנה של תרופה מחייב מקרומולקולות המקרה הוצע כחלופה לטכניקות כאלה מאז מחייב זה מעכב את דיפוזיה פסיבית של מולקולות התרופה באמצעות caseum. דיאליזה מהירה שיווי המשקל היא מערכת מהירה ואמינה לביצוע מחקרים חלבון פלזמה ורקמות מחייב. בפרוטוקול זה, השתמשנו דיאליזה שיווי משקל מהיר (אדום) מכשיר למדוד מחייב סמים homogenates של caseum כי הוא excisאד מן הנגעים והחללים של ארנבים נגועים בשחפת. הפרוטוקול גם מתאר כיצד ליצור מטריצה ​​פונדקאית מן השומנים טעון מקרופאגים THP-1 להשתמש במקום caseum. caseum / זה assay מחייב הפונדקאי הוא כלי חשוב לגילוי תרופות לשחפת ניתן להתאים לעזור ללמוד הפצת תרופת נגעים או מורסות נגרמים על ידי מחלות אחרות.

שימוש בפרוטוקול זה, בדקנו מאות תרכובות פיתוח התרופה שחפת עבור יעילות ניבאו שלהם חודר caseum. איור 1 מציג באופן ויזואלי את המושגים הבסיסיים של assay RED. קרום הדיאליזה של הוסיף RED מאפשר מולקולות קטנות מאוגדות לנטרל מן התורם גם למקלט היטב, ולבסוף השיגו איזון בין שני התאים. מולקולות קטנות המאוגדים מקרומולקולות כגון חלבונים או שומנים כלואות בתוך התורם גם. ניתוח כמותי של דגימות משני תאים ומאפשר לחשב את השבר מאוגד (ו u) של כל מולקולה קטנה caseum או מטריקס פונדקאית. חלק זה הוכח לתאם ישירות עם חדירת תרופת caseum in vivo. 7 כפי שניתן לראות בתרשים 2 ממחיש באמצעות MALDI (desorption לייזר בסיוע מטריקס / יינון) spectro המוניתMetry images, ככל ש- F u גבוה יותר, כך התרופה מתפשטת יותר ויותר. לפיכך, זה מסכים עם ההשערה כי כמו מולקולות התרופה מפוזרים לתוך השפה החיצונית של caseum מממשק שלה עם שכבות הסלולר של הנגע, מחייב מקרומולקולות המקרה סלקטרס התרופה, מונע ממנו להתפשט נוספת לתוך הליבה במקרה. לוח מדגם של 18 תרופות נגד שחפת מופיע בטבלה 1 יחד עם F שלהם בשני caseum ואת הפונדקאית. כפי שמראה איור 3 , המטריצה ​​שהוכנה מקרופאגים מקציפים של THP-1 הנגזרות היא פונדקאית יעילה למקרה אמיתי. הכריכה בשני המטריצות קשורה מאוד זה לזה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig1.jpg" /> איור 1: איור של assay אדום. במהלך הדגירה, מולקולות התרופה שנותרו בלתי מקובלות למקרומולקולותהמטריצה ​​מתפזרת על פני קרום הדיאליזה. עם הזמן, נוצר שיווי המשקל בין ריכוז של מולקולות סמים מאוגדות הן התורם והן בארות המקלט. כל מקרומולקולות (חלבונים, שומנים, וכו &#39; ) ואת מולקולות התרופה קשורה לכודים בתוך החדר התורם. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55559/55559fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig2.jpg" /> איור 2: חדירה סמים in vivo . הקשר בין החלק לא מאוגד ( F u ) ו דיפוזיה לתוך במקרה ב vivo כפי שנקבע על ידי MALDI (מטריקס בסיוע לייזר desorption / יינון) ספקטרומטריית מסה הדמיה עבור שש תרופות נגד שחפת. מפות יון הן של נגעים ריאות נציג עוצמת האות מסומן על ידי סרגל קנה מידה משמאל. ח<html> Ematoxylin ו Eosin (H &amp; E) מכתים של חלקים סמוכים מוצג מתחת מפות יון. קווי מתאר שחור / לבן מדגישים את מרכז המקרה של כל נגע. הודפס מחדש (מותאם) באישור Sarathy et al . 7 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55559/55559fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig3.jpg" /> איור 3: מתאם בין שברים unbound ( F u ) של 18 תרופות נגד שחפת ב caseum ואת מטריקס פונדקאית. קו ההתאמה הטובה ביותר נקבע באמצעות רגרסיה ליניארית. טוב ההתאמה מתבטא בערך R 2 . הודפס מחדש (מותאם) באישור Sarathy et al . 7K &quot;&gt; אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של דמות זו. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> Caseum f u (%) </td><td> פונדקאית (%) </td></tr><tr><td> Ethambutol </td><td> 35.2 ± 4.4 </td><td> 38.8 ± 5.6 </td></tr><tr><td> איזוניזיד </td><td> &gt; 99.9 </td><td> &gt; 99.9 </td></tr><tr><td> אצטיל-איזוניאזיד </td><td> &gt; 99.9 </td><td> &gt; 99.9 </td></tr><tr><td> חומצה p -aminosalicylic </td><td> 54.7 ± 1.4 </td><td> 51.1 ± 11.2 </td></tr><tr><td> ריפמפיצ&#39;ין </td><td> 5.13 ± 0.2 </td><td> 7.3 ± 0.6 </td></tr><tr><td> ריפפנטין </td><td> 0.5 ± 0.1 </td><td> 1.1 ± 0.1 </td></tr><tr><td> Moxifloxacin </td><td> 13.5 ± 3.7 </td><td> 16.8 ± 1.8 </td></tr><tr><td> Levofloxacin </td><td> 8.34 ± 0.4 </td><td> 16.3 ± 3.1 </td></tr><tr><td> Gatifloxacin </td><td> 16.3 ± 4.2 </td><td> 18.8 ± 2.9 </td></tr><tr><td> ליין </td><td> 29.3 ± 3.6 </td><td> 27.9 ± 2.2 </td></tr><tr><td> פוזיולידי </td><td> 10.7 ± 1.7 </td><td> 17.6 ± 4.5 </td></tr><tr><td> סוטזוליד </td><td> 30.1 ± 8.7 </td><td> 21.7 ± 1.7 </td></tr><tr><td> Radezolid </td><td> 5.2 ± 0.8 </td><td> 7.6 ± 1.9 </td></tr><tr><td> לא מסובך </td><td> 8.8 ± 1.8 </td><td> 13.7 ± 2.7 </td></tr><tr><td> קלופזימין </td><td> &lt;0.01 </td><td> &lt;0.01 </td></tr><tr><td> בדאקילין </td><td> &lt;0.01 </td><td> &lt;0.01 </td></tr><tr><td> PA-824 </td><td> 7.31 ± 2.2 </td><td> 3.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td> OPC67683 </td><td> 0.04 ± 0.02 </td><td> 0.02 ± 0.002 </td></tr></tbody></table> טבלה 1: שבר מאוגד (ו u) של 18 תרופות TB נבדקו caseum ו פונדקאית מחייבת assay. כל התוצאות באות לידי ביטוי כממוצע ± סטיית תקן. הודפס מחדש (מותאם) באישור סראתי ואח. 7

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions at JoVE.com

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

כאן אנו מתארים שיווי משקל שיווי משקל מהיר (אדום) שיטה למדוד מחייב סמים כדי caseum מ נגעים שחפת ריאות וחללים. הפרוטוקול משמש גם עם מטריצה ​​קצף הנגזר מקרופאג כי הוא תחליף יעיל caseum.

An<em&gt; במבחנה</em&gt; Assay מחייב Assay כי חוזה חדירה לסמים בשחפת נגעים

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Nanyang Technological University

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Nonlinear Pharmacokinetics

Introduction to Respiratory System Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

11.7K Views.  Rutgers.  כאן אנו מתארים שיווי משקל שיווי משקל מהיר (אדום) שיטה למדוד מחייב סמים כדי caseum מ נגעים שחפת ריאות וחללים. הפרוטוקול משמש גם עם מטריצה ​​קצף הנגזר מקרופאג כי הוא תחליף יעיל caseum. 

Video: An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

שחפת מולקולרית העמסה בקטריאלי שיטת (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Medicine

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

מערכת תרבית אוטומטית לשימוש בבדיקות פרה-קליניות של טיפולים מכווני מארח לשחפת

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>בדיקת סינון בתפוקה גבוהה עבור Mycobacterium abscessus באמצעות כתבים כפולים

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>Author Spotlight: Scalable Drug Screening Protocol for Efficient Discovery of M . abscessus Therapies

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

An

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

מערכת לסינון יעילות Cytotoxicity של מעכבי מיקוד תאי

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged

שחפת מולקולרית העמסה בקטריאלי שיטת (TB-MBLA)

כימות המרחבי של תרופות נגעים שחפת הריאה על ידי לייזר ללכוד Microdissection נוזלי כרומטוגרפיה ספקטרומטר מסה (LCM-LC/MS)

מערכת תרבית אוטומטית לשימוש בבדיקות פרה-קליניות של טיפולים מכווני מארח לשחפת

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה

פיתוח Assay לבדיקת תרופות בתפוקה גבוהה נגד מיקובקטריה