نود أن نشكر جونسون آند جونسون، تحالف السل، أسترا زينيكا، ريب-X و تريوس العلاجية لتوفير بيداكيلين، با-824 (بريتمانيد)، AZD5847، راديزوليد و تيديزوليد، على التوالي. بريندان بريدو، ماثيو زيمرمان، ستيفن جوزوين، إيما ري جورادو، نانسي راول، ليان لي و دانيال وينر قدمت الدعم مع تحليل مالدي، أساليب التحليلية البيولوجية، وإعداد بديل الكالسيوم، التركيب الكيميائي، وعزل الكالسيوم الأرنب. وقد تم هذا العمل بتمويل من مؤسسة بيل وميليندا غيتس، وجائزة # OPP1044966 و OPP1024050 إلى V. دارتواز، المعاهد الوطنية للصحة تقاسم الأجهزة منحة S10OD018072، فضلا عن التمويل المشترك من مؤسسة بيل وميليندا غيتس و ويلكوم الثقة لمركز التميز لتحسين الرصاص لأمراض العالم النامي إلى P. وايت.

أجريت جميع الدراسات الحيوانية وفقا لدليل لرعاية واستخدام الحيوانات المختبرية للمعاهد الوطنية للصحة مع موافقة من اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام نيد (نيه)، بيثيسدا، مد. أجريت جميع الدراسات التي شملت M. السل في مختبر مع مستوى السلامة الاحتواء 3 (بسل-3). 1. أرنب العدوى نموذج ومجموعة كاسوم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصابة نيوزيلندا الأرانب البيضاء مع M. السل باستخدام نظام التعرض الهباء الأنف فقط كما هو موضح سابقا. 12 ، 13 السماح للعدوى إلى التقدم لمدة 12-16 أسابيع. يخدع الأرانب مع 35 ملغ / كغ من الكيتامين و 5 ملغ / كغ زيلازين العضل، الموت ببطء الأرانب مع 0.22 مل / كغ بينتوباربيتال الصوديوم والفينيتوين الصوديوم عن طريق الوريد والمضي قدما في نكروبسيز. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام ملاقط ومشرط، وإزالة الرئتين من الصدر كاليفورنياvity. من كل الفص الرئة، تشريح تجاويف الفردية والأورام الحبيبية نخرية كبيرة باستخدام مشرط. كشط بعناية من كاسوم من تجويف والجدران الورم الحبيبي. وزن وتسجيل وتخزين العينات في 2 مل أنابيب المسمار المغطاة في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غاما-إراديت عينات الكالسيوم المعدية في 3 ميغراد على الجليد الجاف لجعلها غير مأمونة وآمنة للاستخدام في مختبر بسل-2. </li></ol> 2. في المختبر جيل من كيسوم بديل من خلايا ثب-1 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنمو ثب-1 حيدات في رمي 1640 المتوسطة (2 ملي L- الجلوتامين و 10٪ مصل بقري جنيني) في T175 قوارير ثقافة الخلية (80 مل / قارورة). احتضان القوارير في 5٪ كو 2 الغلاف الجوي عند 37 درجة مئوية لمدة 3-4 أيام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الطرد المركزي الثقافة من قارورة T175 في اثنين 50 مل أنابيب مخروطية في 150 x ج لمدة 5 دقائق. تجاهل طاف وتعليق بيليه في 10 مل من رمي 1640 وسائل الإعلام. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 5 ميكرولتر من هذه الثقافة إلى أنبوب 1.5 مل تحتوي على 45 ميكرولتر من رالأزرق الأزرق. مزيج جيدا بيبتينغ. نقل 10 ميكرولتر إلى عدادة الكريات وعدد عدد من حيدات ثب-1 قابلة للحياة (غير ملوثين) باستخدام المجهر الضوئي (10X التكبير). حساب عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مل من الثقافة. تمييع ذلك مع وسائل الإعلام رمي إلى الكثافة النهائية من 1.25 × 10 6 خلايا / مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل 40 مل من الثقافة على لوحة زراعة الخلايا الكبيرة (50 × 10 6 خلايا / لوحة). إضافة 40 ميكرولتر من 100 ميكرومتر سلطة النقد الفلسطينية (فوربول 12-myristate13 أسيتات أعدت في الإيثانول) والسماح للخلايا على الالتزام بين عشية وضحاها في الحاضنة. ملاحظة: تركيز النهائي من سلطة النقد الفلسطينية هو 100 نانومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تمييع حمض الأوليك النقي (أوا) (0.89 غرام / مل) في الإيثانول إلى تركيز 0.1 M ( أي 31.7 ميكرولتر الزراعة العضوية في 968.3 ميكرولتر الإيثانول). تمييع هذا الحل في وسائل الإعلام رمبي قبل تحسنت جديدة إلى تركيز 10 ملم. تمييع هذا تعليق أوا إلى 0.4 ملم (تركيز العمل النهائي) في رمي المتوسطة قبل تحسنت إلى 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الوسائط الموجودة وغيرخلايا -edhered من لوحات ثقافة الخلية وإضافة بلطف 40 مل من 0.4 مم الزراعة العضوية إلى الضامة ثب-1 (ثب-M). احتضان عند 37 درجة مئوية في الحاضنة بين عشية وضحاها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام المجهر الضوئي في التكبير 40X لتأكيد بصريا وجود العديد من الشحوم الجسم الدهون في كل ثب-M. إزالة جميع المتوسطة رمي من لوحات زراعة الخلايا وغسل بلطف الخلايا الملتصقة مرتين مع الفوسفات مخزنة المالحة (بس) باستخدام ماصة 50 مل المصلية. ملاحظة: تظهر الهيئات الدهنية هياكل صغيرة، واضحة، كروية في السيتوبلازم من ثب-M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 40 مل من 5 ملي إثيلينديامينيتتراسيتيك حمض (إدتا) في برنامج تلفزيوني لكل لوحة. احتضان لمدة 15 دقيقة عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الضامة رغوي (فم) من قبل بيبتينغ مرارا وتكرارا صعودا وهبوطا على سطح لوحة كاملة باستخدام ماصة 10 مل المصلية. نقل تعليق خلية إلى أنبوب مخروطي 50 مل وتدور باستمرار في 150 x ج لمدة 5 دقائق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ريسوسبيند بيليه الخلية في 10 مل من برنامج تلفزيوني (ثالث بس غسل) أونقل إلى أنابيب مخروطية قبل وزنها 15 مل. تدور باستمرار مرة أخرى في 150 x ج لمدة 5 دقائق. نضح بعناية طاف باستخدام ماصة المصلية وتجاهل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> موضوع الكريات فم إلى 3 دورات تجميد ذوبان الجليد إلى ليز الخلايا واحتضان لهم في 75 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة لتفريق البروتينات في المصفوفة. تخزين الكريات في -20 درجة مئوية حتى جاهزة للاستخدام. </li></ol> 3. السريع موازنة غسيل الكلى (الأحمر) الفحص <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 10 ملي حلول الأسهم من جميع مركبات الاختبار في ثنائي ميثيل سلفوكسيد (دمسو). تمييع إلى 500 ميكرومتر حلول العمل في دمسو قبل كل فحص. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن أنبوب يحتوي على الكالسيوم بديل بيليه. طرح وزن أنبوب فارغ لاستخلاص وزن بيليه وحده. إضافة 2-3 الخرز المعدنية لكل أنبوب، وذلك باستخدام الخالط الأنسجة في 1،200 السكتات الدماغية / دقيقة لمدة 1 دقيقة، وتعطيل كاسوم أو المصفوفة البديلة في برنامج تلفزيوني (1: 9 ث / ت) لتحقيق 10X تعليق المخفف من كل مصفوفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ارتفاع 6.5 ميكرولتر من 500محلول ميكرومتر من مجمع الاختبار إلى 643.5 ميكرولتر من جناسة لتحقيق تركيز النهائي من 5 ميكرومتر (≤1٪ دمسو) والدوامة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع إدراج الأحمر في لوحة قاعدة. إضافة 200 ميكرولتر من المصفوفة المغطاة المخدرات في غرفة المانحة (حلقة حمراء) من كل إدراج الأحمر و 350 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني في كل غرفة الاستقبال. إعداد 3 إدراج لكل مركب اختبار (ثلاث نسخ عينات). ختم لوحة مع ختم لوحة لاصقة واحتضان عند 37 درجة مئوية على ثيرموميكسر في 200 دورة في الدقيقة (1 زغ) لمدة 4 ساعات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد الحضانة، وخلط بلطف محتويات غرف المانحين والمتلقي من قبل بيبتينغ صعودا وهبوطا 2-3 مرات. ماصة من 20 أليكوتس ميكرولتر من جناسة من غرف المانحة وإضافة إلى 20 ميكرولتر من برنامج تلفزيوني نظيفة في أنبوب 1.5 مل (1: 1). وبالمثل، ماصة من 20 قسامة ميكرولتر من عينات بس من غرف الاستقبال وإضافة إلى 20 ميكرولتر من جناسة نظيفة (مطابقة مصفوفة). 8 ملاحظة: مصفوفة مطابقة يلغي نإد ل 2 منحنيات المعايرة منفصلة (في جناسة و بس) ليتم إجراؤها للتحليل الكمي. وقد تتسبب محتويات غرفة المانحين في الرواسب على مر الزمن. خلط بلطف محتويات بيبتينغ قبل إزالة أليكوتس. </li></ol> 4. لك-مس الكمي وتحليل البيانات <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 160 ميكرولتر من 1: 1 الميثانول: أسيتونتريل تحتوي على 500 نانوغرام / مل ديكلوفيناك أو 10 نانوغرام / مل فيراباميل (معيار داخلي) إلى كل أنبوب ودوامة لترسيب البروتينات. أجهزة الطرد المركزي في 10،000 x ج لمدة 5 دقائق لرسوبيات راسب ونقل سوبرناتانتس إلى 96 جيدا جيدا لوحات عميقة للتحليل اللوني السائل الطيف الكتلي (لمس) التحليل. 7 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بناء منحنيات المعايرة من 1-1،000 نانومتر لكل مجمع اختبار مع الحفاظ على نفس تكوين المصفوفة كما العينات أعلاه. تحديد تركيز مركب الاختبار في عينات من غرف المانحين والمستقبلات باستخدام طريقة لك-مس. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احسب الجزء غير المنضم ( f u ) oو المخدرات في المصفوفة المخففة باستخدام المعادلة 1. حساب و u في مصفوفة غير مخفف باستخدام المعادلة 2 ( D = عامل التخفيف من 10). 14 <img alt="المعادلة 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq1.jpg" /> <img alt="المعادلة 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq2.jpg" /></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التحقق من الانتعاش (توازن الكتلة) من كل مركب باستخدام المعادلة 3 لتحديد المركبات مع الاستقرار / الأيض / قضايا ملزمة غير محددة. ملاحظة: الانتعاش عادة ما يتراوح بين 70٪ و 130٪. 15 <img alt="المعادلة 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559eq3.jpg" /></li></ol>

<ol>
	<li>Sacchettini, J. C., Rubin, E. J., Freundlich, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drugs+versus+bugs:+in+pursuit+of+the+persistent+predator+Mycobacterium+tuberculosis.">Drugs versus bugs: in pursuit of the persistent predator Mycobacterium tuberculosis.</a> Nat Rev Microbiol. 6 (1), 41-52 (2008).</li><li>Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Persistent+and+dormant+tubercle+bacilli+and+latent+tuberculosis.">Persistent and dormant tubercle bacilli and latent tuberculosis.</a> Front Biosci. 1 (9), 1136-1156 (2004).</li><li>Aber, V. R., Nunn, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Short+term+chemotherapy+of+tuberculosis.+Factors+affecting+relapse+following+short+term+chemotherapy.">Short term chemotherapy of tuberculosis. Factors affecting relapse following short term chemotherapy.</a> Bull Int Union Tuberc. 53 (4), 276-280 (1978).</li><li>Chang, K. C., Leung, C. C., Yew, W. W., Ho, S. C., Tam, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+nested+case-control+study+on+treatment-related+risk+factors+for+early+relapse+of+tuberculosis.">A nested case-control study on treatment-related risk factors for early relapse of tuberculosis.</a> Am J Respir Crit Care Med. 170 (10), 1124-1130 (2004).</li><li>Dartois, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+path+of+anti-tuberculosis+drugs:+from+blood+to+lesions+to+mycobacterial+cells.">The path of anti-tuberculosis drugs: from blood to lesions to mycobacterial cells.</a> Nature Rev Microbiol. 12 (3), 159-167 (2014).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+association+between+sterilizing+activity+and+drug+distribution+into+tuberculosis+lesions.">The association between sterilizing activity and drug distribution into tuberculosis lesions.</a> Nat Med. 21 (10), 1223-1227 (2015).</li><li>Sarathy, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prediction+of+Drug+Penetration+in+Tuberculosis+Lesions.">Prediction of Drug Penetration in Tuberculosis Lesions.</a> ACS Infect Dis. 2 (8), 552-563 (2016).</li><li>Waters, N. J., Jones, R., Williams, G., Sohal, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Validation+of+a+rapid+equilibrium+dialysis+approach+for+the+measurement+of+plasma+protein+binding.">Validation of a rapid equilibrium dialysis approach for the measurement of plasma protein binding.</a> J Pharm Sci. 97 (10), 4586-4595 (2008).</li><li>Singh, J. K., Solanki, A., Maniyar, R. C., Banerjee, D., Shirsath, V. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Equilibrium+Dialysis+(RED):+an+In-vitro+High-Throughput+Screening+Technique+for+Plasma+Protein+Binding+using+Human+and+Rat+Plasma.">Rapid Equilibrium Dialysis (RED): an In-vitro High-Throughput Screening Technique for Plasma Protein Binding using Human and Rat Plasma.</a> J Bioequiv Availab. 14, 1-4 (2012).</li><li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unbound+drug+concentration+in+brain+homogenate+and+cerebral+spinal+fluid+at+steady+state+as+a+surrogate+for+unbound+concentration+in+brain+interstitial+fluid.">Unbound drug concentration in brain homogenate and cerebral spinal fluid at steady state as a surrogate for unbound concentration in brain interstitial fluid.</a> Drug Metab Dispos. 37 (4), 787-793 (2009).</li><li>Able, S. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Receptor+localization,+native+tissue+binding+and+ex+vivo+occupancy+for+centrally+penetrant+P2X7+antagonists+in+the+rat.">Receptor localization, native tissue binding and ex vivo occupancy for centrally penetrant P2X7 antagonists in the rat.</a> Br J Pharmacol. 162 (2), 405-414 (2011).</li><li>Subbian, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chronic+pulmonary+cavitary+tuberculosis+in+rabbits:+a+failed+host+immune+response.">Chronic pulmonary cavitary tuberculosis in rabbits: a failed host immune response.</a> Open Biol. 1 (4), 1-14 (2011).</li><li>Via, L. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tuberculous+Granulomas+are+Hypoxic+in+Guinea+pigs,+Rabbits,+and+Non-Human+Primates.">Tuberculous Granulomas are Hypoxic in Guinea pigs, Rabbits, and Non-Human Primates.</a> Infect Immun. 76 (6), 2333-2340 (2008).</li><li>Kalvass, J. C., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Influence+of+nonspecific+brain+and+plasma+binding+on+CNS+exposure:+implications+for+rational+drug+discovery.">Influence of nonspecific brain and plasma binding on CNS exposure: implications for rational drug discovery.</a> Biopharm Drug Dispos. 23 (8), 327-338 (2002).</li><li>Di, L., Umland, J. P., Trapa, P. E., Maurer, T. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+recovery+on+fraction+unbound+using+equilibrium+dialysis.">Impact of recovery on fraction unbound using equilibrium dialysis.</a> J Pharm Sci. 101 (3), 1327-1335 (2012).</li><li>Lenaerts, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Location+of+persisting+mycobacteria+in+a+Guinea+pig+model+of+tuberculosis+revealed+by+r207910.">Location of persisting mycobacteria in a Guinea pig model of tuberculosis revealed by r207910.</a> Antimicrob Agents Chemother. 51 (9), 3338-3345 (2007).</li><li>Prideaux, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-sensitivity+MALDI-MRM-MS+imaging+of+moxifloxacin+distribution+in+tuberculosis-infected+rabbit+lungs+and+granulomatous+lesions.">High-sensitivity MALDI-MRM-MS imaging of moxifloxacin distribution in tuberculosis-infected rabbit lungs and granulomatous lesions.</a> Anal Chem. 83 (6), 2112-2118 (2011).</li></ol>

لا توجد مصالح مالية متنافسة.

الآفات الميتة الرئوية والتجويف في المرضى المصابين بالسل تحتوي على مجموعات سكانية فرعية من البكتيريا التي تعاد إلى العلاج من تعاطي المخدرات. النوى الحلقية لهذه الهياكل هي المسؤولة بشكل خاص عن إيواء هذه بيرسيسترس في بيئة خارج الخلية. ويعتقد أن التوزيع المواتي لعوامل مضادة للبكتيريا في هذه المواقع النائية يعتبر عاملا هاما في تحديد فعالية أدوية السل. قبل التحقق من صحة هذا البروتوكول، لم تكن هناك تقنيات في المختبر المتاحة التي يمكن التنبؤ بتوزيع مركبات اكتشاف المخدرات في الآفات الكاحلية. ونتيجة لذلك، فإن تقييم توزيع المخدرات في هذه البؤر الحرجة تعتمد اعتمادا كبيرا على نماذج العدوى الحيوانية، والدراسات الدوائية الآفة مركزية ومالدي تقنيات قياس الطيفي الكتلي. 5 ، 17 وصف في المختبر الفحص انهإعادة هو وسيلة سريعة وفعالة للتنبؤ اختراق المخدرات في الآفات السل دون تيديوم وتكلفة الدراسات الدوائية في الجسم الحي . البروتوكول هو تعديل للبلازما البروتين فحص ملزمة الذي كان في الأصل الاستخدام المقصود من الجهاز الأحمر. تجانس عينات الأنسجة إلى الاتساق ماصة قادرة يسمح للبروتين الأنسجة ملزمة لقياس باستخدام نفس الجهاز. ويمكن إجراء هذا البروتوكول مع كاسوم إذا كان متوفرا من نماذج العدوى الحيوانية. كما يوضح الشكل 1 ، جزيئات المخدرات ترتبط الجزيئات في الجينوم الكازوم / البديل، وحفظه في غرفة المانحة، في حين أن جزيئات الدواء غير منضم أحرار لنشر عبر غشاء شبه نفاذية في غرفة الاستقبال. الجزء غير المنضم ( f u ) يوازن بين كل من المقصورات خلال فترة الحضانة. كما يوضح الشكل 2 ، مركبات ملزمة للغاية للغاية ( f u ≤ 1٪) التي ألموست المحاصرين تماما داخل غرفة المانحين ليست فعالة في تخترق الكالسيوم. ومن ناحية أخرى، يمكن للمركبات الأقل ارتباطا (1٪ &lt; f u &lt;100٪) أن تنتشر في النواة الحلقية بدرجات متفاوتة؛ وكلما ارتفعت درجة الحرارة، كلما اتسعت على نطاق واسع منطقة نخرية. ويمكن أيضا أن تستخدم البروتوكول مع مصفوفة بديلة المستمدة من البلاعم ثب-1 تحميلها البلاعم التي تم تحريضها مع حمض الأوليك. تم اختبار عدة شروط لتحريض تراكم الجسم الدهني على ثب-1s. وتشمل هذه نقص الأكسجة، والتعرض لمرض السل المشع والتعرض ل تريهالوز 6،6&#39;- ديميكولات (تمد) المستمدة من جدار الخلية المتفطرة. وقد ثبت أن تركيز الحضانة حمض أوليك النهائي من 400 ميكرومتر للحث الذروة تشكيل الجسم الدهون دون المساس بقاء الخلية والتصاق. 7 التخفيف من حمض الأوليك في وسائل الإعلام قبل تحسنت أمر بالغ الأهمية لضمان الحد الأقصىل حل الأحماض الدهنية. مصفوفة البديلة الناتجة يحتوي على نسبة الكولسترول مماثلة لcaseum صحيح، ولكن أعلى وأقل الدهون الثلاثية والبروتين محتويات، على التوالي. 7 كما يوضح الشكل رقم 3، وربط 18 مركبات مكافحة السل إلى مصفوفة البديلة يرتبط بقوة مع تجليدها لcaseum. أثبتت دراسة حديثة شملت أيضا المركبات غير التجارية مع النشاط جراثيم غير معروف أن المصفوفة المستمدة FM هي بديل فعال لcaseum. 7 عن طريق إزالة الحاجة إلى نماذج عدوى الحيوان، مصفوفة البديلة يزيد بنجاح مرت من هذا الاختبار في حين جعلها أكثر فعالية من حيث التكلفة. ويمكن أيضا أن هذا البروتوكول تنوعا استخدامها لاختبار مركبات متعددة في وقت واحد (كاسيت اختبار). لقد أظهرنا في وقت سابق ان الاختبار 5 مجموعات المخدرات، وكلها في 5 ميكرومتر، في كل إدراج باستخدام هذا البروتوكول يمكن أن تصنف على نحو فعال مركبs على أساس ارتباطات الكالسيوم مع توفير الوقت والمواد. ويمكن إضافة مركب التحكم السادس مثل موكسيفلوكساسين إلى الكاسيت كرقابة داخلية لضمان الاتساق بين المقايسات ودفعات من الكالسيوم / البديل. 7 الأهم من ذلك، يمكن تشغيل البروتوكول مع ما لا يقل عن 20 ميكرولتر من الأسهم مجمع 10 ملي (&lt;&lt; 1 ملغ من مركب). هذا هو ميزة كبيرة في وقت مبكر في عملية اكتشاف المخدرات عندما الكيميائيين توليف كميات محدودة من كل مركب لأغراض الفرز. جهاز الجهاز الأحمر هي أتمتة ودية. فإن بصمة الصفيحة الصغرى للوحة القاعدة تجعلها متوافقة مع الأنظمة الآلية المصممة للتعامل مع لوحات قياسية 96-جيدا. على الرغم من أن مصفوفة البديل قد ثبت أن يحاكي بنجاح خصائص ملزمة من الجسم الحي السابقين كاسوم ( الشكل 3 ) ونحن نعترف أنه قد غير دقيقة تعريف مركبات معينة. وتستخدم الضامة ثب-1 عادة في <eم&gt; في المختبر تقنيات لمحاكاة الضامة السنخية في أنسجة الرئة. ومع ذلك، فإن المصفوفة البديلة المستمدة من ثب-1 ليس لديها نفس التركيب كمادة نازية نخرية في آفات الرئة. ونتيجة لذلك، قد تتفاعل فئات معينة من المركبات بشكل مختلف مع المصفوفة البديلة. وعلاوة على ذلك، فإن نجاح الفحص مرهون باستقرار مركب الاختبار في المصفوفة الكايوسية. كاسوم هو مصفوفة البيولوجية التي تشارك العديد من المكونات مع البلازما، وبالتالي هذا البروتوكول هو عرضة لقضايا تدهور مركب في نفس الطريقة العديد من المقايسات القائمة على البلازما هي كذلك. في هذا الصدد، المصفوفة البديل المستمدة من ثب-M هو الأفضل لأن الخطوة تمسخ في البروتوكول يزيل نشاط الانزيم، وتحسين الانتعاش الكلي في نهاية الفحص. ويعتبر فحص الكازوم البديل ملزم أداة مفيدة في اكتشاف المخدرات السل ويستخدم في برامج تحسين الرصاص متعددة. ويمكن أن تساعد أيضا تصميم أكثر إفمزيج fective نظم على أساس قدرة العقاقير الفردية لتقسيم إلى طبقات مختلفة من عدة أنواع الآفة. ويمكن أيضا أن تتكيف بروتوكول لتسهيل اكتشاف الأدوية للأمراض الأخرى التي تتميز بها تشكيل الآفات أو الخراجات حيث انتشار المخدرات محدودة لكن حاسمة لنجاح العلاج.

علاج مرض السل الرئوي يتطلب التوزيع الفعال للأدوية إلى أنواع مختلفة من الآفات. آفات الميتة وتجاويف تحتوي على مراكز الجبني التي تأوي مجموعات سكانية فرعية من البكتيريا &#39;دائمة&#39; أو متسامحة المخدرات. ويرتبط 1، 2 مرض جوفي مع معدلات الشفاء متدنية وسوء أحوال الطقس. وقد أظهرت 3 و 4 دراسات سابقة، وذلك باستخدام التقنيات الكمية والتصوير، أن القدرة على اختراق caseum تختلف بشكل كبير من الطبقة دواء واحد إلى آخر. 5، 6 هذه الطرق، ومع ذلك، تتطلب استخدام نماذج العدوى الحيوانية التي تكون بطيئة ومملة. وقد تم تصميم مقايسة في المختبر الذي يقيس المخدرات ملزمة لخارج الحي caseum. هذا الربط وجدت لربط عكسيا مع انتشار المخدرات في حبيبية الجبني، وبالتالي، هوتستخدم كأداة تنبؤية. 7 ويعتبر التوازن غسيل الكلى نهج الذهب القياسية لبروتينات البلازما الدراسات ملزمة. يوفر جهاز غسيل الكلى السريع (ريد) نظام سريع وسهل الاستخدام وموثوق به لإجراء مثل هذه المقايسات. 8 يتكون الجهاز من مكونين: واحد-- استخدام، المتاح إدراج تتألف من 2 غرف مفصولة اسطوانة عمودية من غشاء شبه-- نفاذية؛ و لوحات قاعدة يمكن إعادة استخدامها التي يمكن أن تعقد ما يصل إلى 48 إدراج في وقت واحد. غشاء غسيل الكلى لديه 8 كيلو دالتون الوزن الجزيئي قطع (موكو) التي هي مثالية للدراسات ملزمة جزيء المخدرات. ارتفاع نسبة مساحة إلى حجم وحدة من غشاء مقصورة يسمح الغسيل السريع و موازنة. وقد تم التحقق من كل من إدراج ولوحة قاعدة للحد الأدنى ملزمة غير محددة. الجمع بين الجهاز الأحمر مع تقنيات بيواناليتيكال يوفر تقديرات دقيقة للكسور غير منضم من المخدرات في صlasma. 8 ، 9 على الرغم من أن أصلا مصممة لقياس بروتين البلازما ملزمة، وقد تم استخدام الجهاز الأحمر في العديد من الدراسات ملزمة الأنسجة باستخدام التجانس. 10 ، 11 في هذا البروتوكول، نقيس المخدرات ملزمة لكاسيوم، الحطام نخرية استئصال من الآفات نخر وتجويف الأرانب المصابة بالسل. طبيعة خلوية وغير الأوعية الدموية من المواد الكاجي يجعل من السهل التجانس في تعليق متجانسة التي تتوافق مع الفحص. وبالنظر إلى أن كاسيوم مملة لإنتاج ويصعب أن تأتي من قبل، كما تم التحقق من صحة البروتوكول لاستخدامها مع مصفوفة بديلة التي يتم إعدادها من البلاعم رغوي. وتتسبب الضامة المستمدة من خلية واحدة من ثب-1 بحمض الأوليك لتراكم أجسام دهنية متعددة تعطيها مظهرها &quot;الرغوي&quot;. يتم حصاد هذه الخلايا محملة الدهون ومعالجتها لإنتاج مصفوفة التي نستخدمها كبديل ل كاسوم. وقد أظهرت هذه الدراسة أن المخدرات ملزمة لهذه المصفوفة البديلة يرتبط بشكل جيد مع ملزم إلى الكالسيوم، محاكاة على نحو فعال في عملية الجسم الحي الذي يعيق اختراق المخدرات في جوهر الكاحل من حبيبي وتجويف.

<table><tbody><tr><td>New Zealand White Rabbits</td><td>Covance</td><td>-</td><td></td></tr><tr><td>HN878 Mycobacterium tuberculosis</td><td>BEI Resources</td><td>NR-13647&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Ketathesia (Ketamine) 100 mg/mL C3N</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>56344</td><td></td></tr><tr><td>Anased (Xylazine) 100 mg/mL</td><td>Henry Schein Animal Health</td><td>33198</td><td></td></tr><tr><td>Euthasol (pentobarbital sodium and phenytoin sodium) Solution&amp;nbsp;</td><td>Virbac</td><td>710101</td><td></td></tr><tr><td>THP-1 monocytic cell line</td><td>ATCC</td><td>ATCC TIB-202</td><td></td></tr><tr><td>175 cm&amp;sup2; TC-Treated Flask (T175)</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-3400-175</td><td></td></tr><tr><td>RPMI 1640 media w/o glutamine</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT-15-040-CV</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone Fetal Bovine Serum, Gamma irradiated&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3091003IR</td><td></td></tr><tr><td>Hyclone L-glutamine, 200 mM</td><td>Fisher Scientific</td><td>SH3003401</td><td></td></tr><tr><td>Cellstar TC dish, 145 mm x 20 mm, vented</td><td>Fisher Scientific</td><td>T-2881-1</td><td></td></tr><tr><td>Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP685-1</td><td></td></tr><tr><td>Ethylenediaminetetraacetic acid</td><td>Sigma</td><td>E6758</td><td></td></tr><tr><td>Oleic acid&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>ICN15178101</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Reusable Base Plate</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89811</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED Device Inserts, 50/box&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-89809</td><td></td></tr><tr><td>Pierce RED insert removal tool&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>89812</td><td></td></tr><tr><td>Adhesive plate seal</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-240</td><td></td></tr><tr><td>PBS, pH 7.4, 10x 500 mL (Gibco)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies&amp;nbsp;</td><td>10010-049</td><td></td></tr><tr><td>DMSO</td><td>Sigma</td><td>472301</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrile</td><td>Sigma</td><td>34998</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Sigma</td><td>34860</td><td></td></tr><tr><td>Verapamil hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>V4629</td><td></td></tr><tr><td>Diclofenac sodium salt</td><td>Sigma</td><td>93484</td><td></td></tr><tr><td>Trypan Blue Solution, 0.4%</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-250-061</td><td></td></tr><tr><td>Ethanol, 200 proof</td><td>Fisher Scientific</td><td>04-355-451</td><td></td></tr><tr><td>2010 Geno/Grinder</td><td>SPEX SamplePrep</td><td>2010</td><td></td></tr><tr><td>Bead Mill Homogenizer Accessory, Metal Bulk Beads</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-340-158</td><td></td></tr><tr><td>484R Cobalt 60 Irradiator</td><td>JL Shepard</td><td>7810-484-1</td><td></td></tr><tr><td>INCYTO&amp;nbsp;C-Chip Disposable Hemacytometers</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-600-100</td><td></td></tr><tr><td>Upright Light Microscope</td><td>Leica</td><td>DM1000</td><td></td></tr><tr><td>Binary Liquid Chromatography system</td><td>Agilent</td><td>1260</td><td>Multi-compenent</td></tr><tr><td>Mass spectrometer</td><td>AB Sciex</td><td>4000</td><td></td></tr></tbody></table>

an in vitro caseum binding assay that predicts drug penetration in tuberculosis lesions

ويتطلب القضاء على مرض السل وجود نظم أدوية يمكن أن تخترق الطبقات المتعددة من الآفات الرئوية المعقدة. توزيع المخدرات في النوى الكاحل من تجاويف والآفات هو أمر بالغ الأهمية خاصة لأنها تؤوي مجموعات فرعية من البكتيريا المتسامحة للدواء أيضا يشار إليها عادة باسم بيرسيسترس. الطرق الحالية لقياس اختراق المخدرات في الآفات السل تنطوي مكلفة وتستغرق وقتا طويلا في الدراسات الدوائية الحيوي إلى جانب تقنيات بيواناليتيكال أو التصوير. واقترح في المختبر قياس المخدرات ملزمة لجزيئات كاسيوم كبديل لهذه التقنيات منذ هذا الربط يعيق الانتشار السلبي لجزيئات الدواء من خلال الكالسيوم. التوازن السريع غسيل الكلى هو نظام سريع وموثوق بها لأداء بروتين البلازما والدراسات ملزمة الأنسجة. في هذا البروتوكول، استخدمنا جهاز غسيل الكلى السريع (ريد) لقياس المخدرات ملزمة لمجانسة من الكالسيوم وهذا هو زيسمن آفات وتجويف الأرانب المصابة بالسل. يصف البروتوكول أيضا كيفية إنشاء مصفوفة بديلة من الدهون تحميل ثب-1 الضامة لاستخدامها بدلا من الكالسيوم. هذا فحص الكالسيوم / البديل ملزمة هو أداة هامة في اكتشاف المخدرات السل ويمكن تكييفها للمساعدة في دراسة توزيع المخدرات في الآفات أو الخراجات الناجمة عن أمراض أخرى.

باستخدام هذا البروتوكول، قمنا باختبار مئات من مركبات تطوير المخدرات السل للكفاءة المتوقعة في اختراق الكالسيوم. الشكل 1 يتصور المفاهيم الأساسية للمقايسة الحمراء. غشاء غسيل الكلى من إدراج الأحمر يسمح للجزيئات الصغيرة غير منضم إلى منتشر من المتبرع جيدا إلى جهاز الاستقبال بشكل جيد، وأخيرا تحقيق التوازن بين كل من المقصورات. وتحاصر الجزيئات الصغيرة التي ترتبط بجزيئات كبيرة مثل البروتينات أو الدهون في البئر المانحة. التحليل الكمي للعينات من كل من المقصورات يسمح لحساب جزء غير منضم ( f ش ) من كل جزيء صغير في مصفوفة الكازوم أو البديل. وقد تبين هذا الجزء لربط مباشرة مع اختراق المخدرات في الكالسيوم في الجسم الحي . 7 كما يوضح الشكل 2 باستخدام مالدي (مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين) الطيف الشاملصور المقياس، وكلما ارتفعت درجة الحرارة، وأكثر انتشارا المخدرات ينتشر في الكالسيوم. وبالتالي، فإن هذا يتفق مع فرضية أنه كما جزيئات المخدرات منتشر في الحافة الخارجية من الكالسيوم من واجهته مع طبقات الخلوية من الآفة، ملزمة لجزيئات كاجوس يحجز المخدرات، ومنعها من مزيد من الانتشار في جوهر الكاجي. وترد في الجدول 1 عينة من 18 من العقاقير المضادة للسل، جنبا إلى جنب مع f في كل من كاسوم والبديل. وكما يوضح الشكل 3 ، فإن المصفوفة التي أعدت من البلاعم الرغوية المستمدة من ثب-1 هي بديل فعال لحالة الكالسيوم الحقيقية. الربط في كل من المصفوفات ترتبط ارتباطا قويا مع بعضها البعض. <img alt="شكل 1" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig1.jpg" /> الشكل 1: توضيح للفحص الأحمر. خلال الحضانة، جزيئات الدواء التي لا تزال غير منضم إلى الجزيئات فيالمصفوفة منتشر عبر غشاء غسيل الكلى. مع مرور الوقت، يتم إنشاء توازن بين تركيز جزيئات الدواء غير منضم في كل من الآبار المانحة والمتقدمة. كل الجزيئات (البروتينات، والدهون، وما إلى ذلك ) و جزيئات الدواء ملزمة محاصرين داخل غرفة المانحة. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55559/55559fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 2" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig2.jpg" /> الشكل 2: اختراق المخدرات في الجسم الحي . العلاقة بين جزء غير منضم ( f ش ) ونشرها في الكالسيوم في الجسم الحي كما هو محدد من قبل مالدي (مصفوفة بمساعدة الليزر الامتزاز / التأين) مطياف الكتلة التصوير لستة الأدوية المضادة للسل. خرائط أيون هي من آفات الرئة التمثيلية ويشار إلى كثافة الإشارة من شريط مقياس إلى اليسار. H<html> إماتوكسيلين ويوسين (H &amp; E) تلطيخ الأقسام المجاورة أدناه خرائط الأيونات. خطوط كفاف أسود / أبيض تسليط الضوء على مركز الكاحل من كل الآفة. أعيد طباعته (تكييف) بإذن من ساراثي وآخرون . 7 <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55559/55559fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل 3" src="/files/ftp_upload/55559/55559fig3.jpg" /> الشكل 3: الارتباط بين الكسور غير منضم ( f ش ) من 18 العقاقير المضادة للسل في الكازوم والمصفوفة البديلة. تم تحديد أفضل خط صالح باستخدام الانحدار الخطي. ويعبر عن حسن التناسب كقيمة R 2 . أعيد طباعته (تكييف) بإذن من ساراثي وآخرون . 7k &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم. <table fo:keep-together.within-page="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td></td><td> كاسوم f u (٪) </td><td> البديل f u (٪) </td></tr><tr><td> الإيثامبوتول </td><td> 35.2 ± 4.4 </td><td> 38.8 ± 5.6 </td></tr><tr><td> ديزاينوزي </td><td> &gt; 99.9 </td><td> &gt; 99.9 </td></tr><tr><td> أسيتيل ديزاينوزي </td><td> &gt; 99.9 </td><td> &gt; 99.9 </td></tr><tr><td> p -امينوساليسيليك حمض </td><td> 54.7 ± 1.4 </td><td> 51.1 ± 11.2 </td></tr><tr><td> ريفامبيسين </td><td> 5.13 ± 0.2 </td><td> 7.3 ± 0.6 </td></tr><tr><td> ريفابنتين </td><td> 0.5 ± 0.1 </td><td> 1.1 ± 0.1 </td></tr><tr><td> موكسيفلوكساسين </td><td> 13.5 ± 3.7 </td><td> 16.8 ± 1.8 </td></tr><tr><td> الليفوفلوكساسين </td><td> 8.34 ± 0.4 </td><td> 16.3 ± 3.1 </td></tr><tr><td> جاتيفلوكساسين </td><td> 16.3 ± 4.2 </td><td> 18.8 ± 2.9 </td></tr><tr><td> ينزوليد </td><td> 29.3 ± 3.6 </td><td> 27.9 ± 2.2 </td></tr><tr><td> Posizolid </td><td> 10.7 ± 1.7 </td><td> 17.6 ± 4.5 </td></tr><tr><td> Sutezolid </td><td> 30.1 ± 8.7 </td><td> 21.7 ± 1.7 </td></tr><tr><td> Radezolid </td><td> 5.2 ± 0.8 </td><td> 7.6 ± 1.9 </td></tr><tr><td> Tedizolid </td><td> 8.8 ± 1.8 </td><td> 13.7 ± 2.7 </td></tr><tr><td> الكلوفازيمين </td><td> &lt;0.01 </td><td> &lt;0.01 </td></tr><tr><td> Bedaquiline </td><td> &lt;0.01 </td><td> &lt;0.01 </td></tr><tr><td> PA-824 </td><td> 7.31 ± 2.2 </td><td> 3.6 ± 0.2 </td></tr><tr><td> OPC67683 </td><td> 0.04 ± 0.02 </td><td> 0.02 ± 0.002 </td></tr></tbody></table> الجدول 1: جزء غير منضم ( f ش ) من الأدوية السل 18 اختبارها في فحص الكالسيوم والبدائل ملزمة. وتعبر جميع النتائج عن متوسط ​​الانحراف المعياري. أعيد طباعته (تكييف) بإذن من ساراثي وآخرون . 7

Watch this Scientific Journal Video about An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions at JoVE.com

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

نحن هنا تصف طريقة التوازن السريع (ريد) غسيل الكلى لقياس المخدرات ملزمة لكازيوم من آفات السل الرئوي والتجويف. يستخدم البروتوكول أيضا مع مصفوفة مستمدة بلعم رغوي الذي هو بديل فعال ل كاسوم.

ل<em&gt; في المختبر</em&gt; كاسيم ملزمة الفحص الذي يتنبأ اختراق المخدرات في الآفات السل

The eradication of tuberculosis disease requires drug regimens that can penetrate the multiple layers of complex pulmonary lesions. Drug distribution in ...

an-vitro-caseum-binding-assay-that-predicts-drug-penetration

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Pharmacokinetics and Pharmacodynamics

Pharmacology

Immunology and Infection

Unit 1

An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

Nonlinear Pharmacokinetics

Introduction to Respiratory System Drugs

SCIENTISTS IN ACTION

11.7K Views.  Rutgers.  نحن هنا تصف طريقة التوازن السريع (ريد) غسيل الكلى لقياس المخدرات ملزمة لكازيوم من آفات السل الرئوي والتجويف. يستخدم البروتوكول أيضا مع مصفوفة مستمدة بلعم رغوي الذي هو بديل فعال ل كاسوم. 

Video: An In Vitro Caseum Binding Assay that Predicts Drug Penetration in Tuberculosis Lesions

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since several decades, the sudden burst of multi- and extensively-drug resistant strains is a serious threat for the control of tuberculosis. Therefore, it is essential to identify new targets and pathways critical for the causative agent of the tuberculosis, Mycobacterium tuberculosis (Mtb) and to search for novel chemicals that could become TB drugs. One approach is to set&#160;up methods suitable for the genetic and chemical screens of large scale libraries enabling the search of a needle in a haystack. To this end, we developed a phenotypic assay relying on the detection of fluorescently labeled Mtb within fluorescently labeled host&#160;cells using automated confocal microscopy. This in vitro assay allows an image based quantification of the colonization process of Mtb&#160;into the host and was optimized for the 384-well microplate format, which is proper for screens of siRNA-, chemical compound- or Mtb mutant-libraries. The images are then processed for multiparametric analysis, which provides read&#160;out inferring on the pathogenesis of Mtb&#160;within host cells.

Here, we describe a phenotypic assay applicable to the High-throughput/High-content screens of small-interfering synthetic RNA (siRNA), chemical compound, and Mycobacterium tuberculosis mutant libraries. This method relies on the detection of fluorescently labeled Mycobacterium tuberculosis within fluorescently labeled host&#160;cell using automated confocal microscopy.

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

التصور من الفحم آجار ريسازورين الفحص لشبه الكمي، متوسطة الإنتاجية تعداد مايكوباكتيريا

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread of multi drug-resistant TB (MDR-TB), there is a real urgency to develop new therapeutic strategies against M. tuberculosis infections. Traditionally, compounds are evaluated based on their antibacterial activity under in vitro growth conditions in broth; however, results are often misleading for intracellular pathogens like M. tuberculosis since in-broth phenotypic screening conditions are significantly different from the actual disease conditions within the human body. Screening for inhibitors that work inside macrophages has been traditionally difficult due to the complexity, variability in infection, and slow replication rate of M. tuberculosis. In this study, we report a new approach to rapidly assess the effectiveness of compounds on the viability of M. tuberculosis in a macrophage infection model. Using a combination of a cytotoxicity assay and an in-broth M. tuberculosis viability assay, we were able to create a screening system that generates a comprehensive analysis of compounds of interest. This system is capable of producing quantitative data at a low cost that is within reach of most labs and yet is highly scalable to fit large industrial settings.

System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis

We have developed a modular high-throughput screening system for discovering novel compounds against Mycobacterium tuberculosis, targeting intracellular and in-broth growing bacteria as well as cytotoxicity against the mammalian host cell.

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا<em&gt; المتفطرة السلية</em

Mycobacterium tuberculosis, the causative agent of tuberculosis (TB), is a leading cause of morbidity and mortality worldwide. With the increased spread ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to effectiveness in the clinical setting. This is likely due to a lack of consideration for the physiologically relevant cellular penetration barriers that exist in the infected host. We recently established an alternative infection model that generates large macrophage aggregate structures containing densely packed M. tuberculosis (Mtb) at its core, which was suitable for drug susceptibility testing. This infection model is inexpensive, rapid, and most importantly BSL-2 compatible. Here, we describe the experimental procedures to generate Mtb/macrophage aggregate structures that would produce macrophage-passaged Mtb for drug susceptibility testing. In particular, we demonstrate how this infection system could be directly adapted to the 96-well plate format showing throughput capability for the screening of compound libraries against Mtb. Overall, this assay is a valuable addition to the currently available Mtb drug discovery toolbox due to its simplicity, cost effectiveness, and scalability.

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

New models and assays that would improve the early drug development process for next-generation anti-tuberculosis drugs are highly desirable. Here, we describe a quick, inexpensive, and BSL-2 compatible assay to evaluate drug efficacy against Mycobacterium tuberculosis that can be easily adapted for high-throughput screening.

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological substance. For the sake of the workers&#8217; safety, handling of all samples presumed to carry Mtb must be conducted in a containment level (CL) 3 laboratory. The TB molecular bacterial load assay (TB-MBLA) test is a reverse transcriptase quantitative polymerase chain reaction (RT-qPCR) test that quantifies Mtb bacillary load using primers and dual-labelled probes for 16S rRNA. We describe the use of heat inactivation to render TB samples noninfectious while preserving RNA for the TB-MBLA. A 1 mL aliquot of the sputum sample in tightly closed 15 mL centrifuge tubes is boiled for 20 min at either 80 &#176;C, 85 &#176;C, or 95 &#176;C to inactivate Mtb bacilli. Cultivation of the heat inactivated and control (live) samples for 42 days confirmed the death of TB. The inactivated sample is then spiked with 100 &#181;L of the extraction control and RNA is extracted following the standard RNA isolation procedure. No growth was observed in the cultures of heat treated samples. The isolated RNA is subjected to real-time RT-qPCR, which amplifies a specific target in the Mtb 16S rRNA gene, yielding results in the form of quantification cycles (Cq). A standard curve is used to translate Cq into bacterial load, or estimated colony forming units per mL (eCFU/mL). There is an inverse relationship between Cq and the bacterial load of a sample. The limitation is that heat inactivation lyses some cells, exposing the RNA to RNases that cause a loss of &#60;1 log10eCFU/mL (i.e., &#60;10 CFU/mL). Further studies will determine the proportion of very low burden patients that cause false negative results due to heat inactivation.

A Tuberculosis Molecular Bacterial Load Assay TB-MBLA

We describe a tuberculosis molecular bacterial load assay test performed after heat inactivation of sputum. Heat inactivation renders sputum samples noninfectious and obviates the need for containment level 3 laboratories for tuberculosis molecular tests.

A السل الجزيئي ة الحمل البكتيري ة (TB-MBLA)

Tuberculosis is caused by Mycobacterium tuberculosis (Mtb), a pathogen classified by the United Nations (UN) as a dangerous category B biological ...

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel therapeutics are urgently required. The ability of dosed TB drugs to reach and sterilize bacteria within poorly-vascularized necrotic regions (caseum) of pulmonary granulomas is crucial for successful therapeutic intervention. Effective therapeutic regimens must therefore contain drugs with favorable caseum penetration properties. Current LC/MS methods for quantifying drug levels in biological tissues have limited spatial resolution capabilities, making it difficult to accurately determine absolute drug concentrations within small tissue compartments such as those found within necrotic granulomas. Here we present a protocol combining laser capture microdissection (LCM) of pathologically-distinct tissue regions with LC/MS quantification. This technique provides absolute quantification of drugs within granuloma caseum, surrounding cellular lesion and uninvolved lung tissue and, therefore, accurately determines whether bactericidal concentrations are being achieved. In addition to tuberculosis research, the technique has many potential applications for spatially-resolved quantification of drugs in diseased tissues.

Spatial Quantification of Drugs in Pulmonary Tuberculosis Lesions by Laser Capture Microdissection Liquid Chromatography Mass Spectrometry LCM-LC/MS

Here, we describe a protocol using laser capture microdissection coupled with LC/MS analysis to spatially-quantify drug distributions within pulmonary tuberculosis granulomas. The approach has broad applicability to quantifying drug concentrations within tissues at high spatial detail.

التقاط الكمي المكانية للمخدرات في الآفات السل الرئوي بالليزر اللوني السائل ميكروديسيكشن الكتلي (LCM-LC/MS)

Tuberculosis is still a leading cause of morbidity and mortality worldwide. Improvements to existing drug regimens and the development of novel ...

Medicine

An Automated Culture System for Use in Preclinical Testing of Host-Directed Therapies for Tuberculosis

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent of COVID-19. Mtb has evolved to persist in its intracellular environment, evade host defenses, and has developed resistance to many anti-tubercular drugs. One approach to solving resistance is identifying existing&#160;approved drugs that will boost the host immune response to Mtb. These drugs could then be repurposed as adjunctive host-directed therapies (HDT) to shorten treatment time and help overcome antibiotic resistance.
Quantification of intracellular Mtb growth in macrophages is a crucial aspect of assessing potential HDT. The gold standard for measuring Mtb growth is counting colony-forming units (CFU) on agar plates. This is a slow, labor-intensive assay that does not lend itself to rapid screening of drugs. In this protocol, an automated, broth-based culture system, which is more commonly used to detect Mtb in clinical specimens, has been adapted for preclinical screening of host-directed therapies. The capacity of the liquid culture assay system to investigate intracellular Mtb growth in macrophages treated with HDT was evaluated. The HDTs tested for their ability to inhibit Mtb growth were all-trans Retinoic acid (AtRA), both in solution and encapsulated in poly(lactic-co-glycolic acid) (PLGA) microparticles and the combination of interferon-gamma and linezolid. The advantages of this automated liquid culture-based technique over the CFU method include simplicity of setup, less labor-intensive preparation, and faster time to results (5-12 days compared to 21 days or more for agar plates).

Rapid and efficient quantification of intracellular M. tuberculosis growth is crucial for pursuing improved therapies against tuberculosis (TB). This protocol describes a broth-based colorimetric detection assay using an automated liquid culture system to quantify Mtb growth in macrophages treated with candidate host-directed therapies.

نظام زراعة آلي للاستخدام في الاختبارات قبل السريرية للعلاجات الموجهة للمضيف لمرض السل

Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of tuberculosis (TB), was the most significant infectious disease killer globally until the advent ...

<meta charset="utf8"></head><body>فحص الفحص عالي الإنتاجية لخراج المتفطرة باستخدام المراسلين المزدوجين

Assay Development for High-Throughput Drug Screening Against Mycobacteria

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. Treatments are extremely ineffective and based on a multi-drug regimen, resulting in low patient compliance. Consequently, the scientific community is urged to identify new and effective drugs to treat these infections. One of the strategies employed to this end is drug repurposing - the process of identifying new therapeutic opportunities for existing drugs in the market, circumventing the time required to establish pharmacokinetic and safety profiles of new drugs. With most studies on drug development against Mab relying on traditional and time-consuming methods, an assay for high-throughput drug screening was developed against mycobacteria using an in house developed double-reporter strain of Mab. Using liquid-handling robotics, automated microscopy, and analysis, alongside in house developed double reporter strains, bacterial viability can be rapidly measured using two different readouts, luminescence and fluorescence, without adding reagents or performing any extra steps. This reduces time and variability between assays, a major advantage for high-throughput screenings. The described protocol was validated by screening a library of 1280 compounds. The obtained results were corroborated by the literature, with efficient detection of active compounds. Thus, this work fulfilled the aim of supplying the field with a new tool to help fight this extremely drug-resistant bacteria.

<meta charset="utf8"></head><body>أضواء الكاتب: بروتوكول فحص الأدوية القابل للتطوير للاكتشاف الفعال لعلاجات M. abscessus

This study developed an assay for high-throughput screening against Mycobacterium abscessus with a&#160;recently created double reporter strain, using fluorescence and luminescence to assess bacterial viability quickly. This protocol will be relevant for researchers aiming to screen new drugs against this drug-resistant bacteria.

تطوير الفحص لفحص الأدوية عالي الإنتاجية ضد البكتيريا الفطرية

Mycobacterium abscessus (Mab) infections are challenging to treat due to high intrinsic drug resistance, comparable to multidrug-resistant tuberculosis. ...

ل

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

التصور من الفحم آجار ريسازورين الفحص لشبه الكمي، متوسطة الإنتاجية تعداد مايكوباكتيريا

نظام لفعالية والسمسة فحص مثبطات استهداف بين الخلايا

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged

A السل الجزيئي ة الحمل البكتيري ة (TB-MBLA)

التقاط الكمي المكانية للمخدرات في الآفات السل الرئوي بالليزر اللوني السائل ميكروديسيكشن الكتلي (LCM-LC/MS)

نظام زراعة آلي للاستخدام في الاختبارات قبل السريرية للعلاجات الموجهة للمضيف لمرض السل

تطوير الفحص لفحص الأدوية عالي الإنتاجية ضد البكتيريا الفطرية

تطوير الفحص لفحص الأدوية عالي الإنتاجية ضد البكتيريا الفطرية

تطوير الفحص لفحص الأدوية عالي الإنتاجية ضد البكتيريا الفطرية