This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. הכנת Supernatant להיבדק עבור פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות 0.5 מ&quot;ג / מ&quot;ל של C mitomycin ידי המסת את הכמות המתאימה לתוך 0.1 סטרילי חיץ M MgSO 4 (חיץ למשל 1 מ&quot;ג mitomycin C / 2 מ&quot;ל). חנות המניה ב 4 מעלות צלזיוס במיכל מוגן האור (C mitomycin רגיש לאור). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של פ syringae לתוך 3 מיליליטר של B הבינוני של המלך (KB) מרק 14. דגירה במשך הלילה עם רועד (200 סל&quot;ד) בטמפרטורת החדר (21-25 מעלות צלזיוס). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, לדלל את התרבות מרק 1/100 לתוך 3 מ&quot;ל של מרק KB טריים. דגירה של 3-4 שעות עם רעד בטמפרטורת החדר. להוסיף C mitomycin (0.5 מיקרוגרם / מ&quot;ל, הריכוז הסופי). דגירה התרבות במשך הלילה עם רועד בטמפרטורת החדר. הערה: mitomycin C גורמת הפסקות DNA גדילים כפולות, ובכך ממגרת את תגובת ה- SOS של התא, המוביל ליצירה של שני בקטריופאג ו bacteriocins. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> גלולה 1-2 מ&quot;ל mitomycin C המושרה תרבויות על ידי צנטריפוגה ב 20,000 XG במשך 5 דקות ב microcentrifuge הספסל העליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר לעקר supernatants תרבות או על ידי העברת supernatant דרך פילטר גודל הנקבוביות 0.22 מיקרומטר או על ידי טיפול supernatant עם כלורופורם (100 כלורופורם μl לכל 1 מ&quot;ל supernatant). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם באמצעות כלורופורם, המערבולת התערובת במשך 15 שניות ולתת דגירה בטמפרטורת החדר למשך שעה 1. לאחר דגירה, צנטריפוגות את התערובת על 20,000 XG במשך 5 דקות. הערה: כלורופורם ביעילות הורג תאים על ידי solubilizing הקרומים שלהם. היתרון של שימוש כלורופורם על עיקור מסנן הוא שזה זול יותר וקל יותר לגמלן אם עיבוד רב (&gt; 20) דגימות בכל פעם. תיתכן אפשרות כי פעילות הרג נתונה אבודה לאחר טיפול כלורופורם כתוצאת מחיצות לשלב האורגני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את השלב העליון, מימי באמצעות pipet 1 מיליליטר ל 1.5 או 2.0 מיליליטר טרי, סטריליצינור microfuge. היזהר שלא להעביר כל שכבת כלורופורם הנמוכה (עדיף להסיר פחות של השלב המימי כדי למנוע מעל carry). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה supernatant הועבר ופתחה במנדף לאפשר כלורופורם שיורית להתאדות (כמה שעות). supernatants חנות ב 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 2. ההפרדה וריכוז של תרכובות חיידקים משקל מולקולרי גבוה ידי פוליאתילן גליקול (PEG) רטיבות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי supernatant סטרילי, להוסיף NaCl ו PEG 8000 עד 1 מ &#39;ו -10% ריכוזיים סופי, בהתאמה. שוב ושוב להפוך את המדגם עד שני NaCl ו PEG מתמוססים לחלוטין. דגירה דגימות באמבט קרח למשך שעה 1 או לילה ב 4 ° C.. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה דגימות ב XG 16,000 למשך 30 דקות ב 4 ° C.. גלולה צריכה טופס בתחתית הצינור צנטריפוגות. למזוג supernatant ו resuspend גלולה בנפח הרצוי (כגון 1/10 או 1/100 של vol supernatant המקוריume) של חיץ (10 מ&quot;מ טריס, 10 מ&quot;מ MgSO 4, pH 7.0) על ידי pipetting חזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר PEG שיורי על ידי שתי עקירות רציפות עם נפח שווה של כלורופורם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב כלורופורם עם הגלולה ו המערבולת המושעית למשך 10 עד 15 שניות, ואז צנטריפוגות את התערובת על 20,000 XG במשך 5 דקות. מעביר את השלב העליון, מימית לצינור microfuge טרי. חזור על החילוץ הזה עד אין ממשק לבן בין השלב המימי ואורגני גלוי (בדרך כלל 2 עקירות סכות הכל). אפשר כלורופורם שיורית להתאדות מן supernatants חילוץ במנדף. </li></ol></li></ol> 3. הכנת השכבה ובדיקת Supernatants עבור פעילות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן מושבה אחת של זן פ syringae להיבדק עבור רגישות לתוך 3 מ&quot;ל של KB, דגירה במשך הלילה עם רועד בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למחרת בבוקר, חזרה לדלל את התרבות 1/100 לתוך KB הטרי. דגירה 3-4 שעות עם רועד ב חדר טמפרטורותמִחָדָשׁ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן אגר מים מעוקרים ידי מעוקר% השעית 0.35-0.7 (w / v) אגר במי ultrapure. הערה: מלאי של אגר מים רכים יכולים להיות נמס במיקרוגל ולעשות בהם שימוש חוזר שוב ושוב, כיסוי טרי לא צריך להיות מוכן עבור כל ניסוי. אם אגר מים לשימוש חוזר, זה קריטי כדי לוודא שהוא נמס לגמרי בא במיקרוגל. אם לא, את שכבת-העל יצטרך מרקם מחוספס על ולהתגבש שיגרום פרשנות קשה. במקרה זה, להמיס את אגר במשך כמה דקות יותר במיקרוגל מאשר לעשות בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על אגר רך המותך באמבט מי C ° 60 לפני השימוש. שימוש pipet סרולוגיות סטרילי, העברת 3 מ&quot;ל של אגר רך לצינור תרבות סטרילי. החזר את צינור התרבות באמבט מים כדי לשמור אותן במצב מותך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשפוך את הכיסוי, ראשון לאפשר אגר מותך להתקרר (זה צריך להרגיש חמים אך לא חם למגע), אך אינו מאפשר לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במנדף סטרילי, לחסן 100 μl שלתרבות הזן הבוחן לתוך אגר ו המערבולת הרכות לערבב. סובב תרבות ביד במשך 10-15 שניות, ואז לשפוך על גבי (אגר KB) אגר תחתון. הטה את הצלחת לכל הכיוונים כדי להבטיח את אגרתי הרך באופן ברור מכסה את אגר התחתון. הערה: אגר התחתונה יכול להיות כל הקרושה (1.5% אגר) בינוני שבו זן הבדיקה גדל במרץ. עבור צלחת בקוטר סטנדרטי 100 מ&quot;מ פטרי, השתמש ~ 20 מ&quot;ל נמס בינוני. אגר התחתונה אפשר להכין כמה שבועות לפני הזמן (אם שמרו על 4 מעלות צלזיוס ללא ייבוש) או ניתן להכין באותו יום. אם מוכן באותו היום כמו ביצוע הכיסוי, עדיף לעשות זאת לפני שלב 3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מכסים את הצלחת ולאפשר לו 20-30 דקות כדי לחזק. היזהר שלא להפריע את הצלחת תוך לחיזוק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הקרושה, במקום 2-5 μl של supernatant (שנוצר בסעיפים 1 ו -2 לעיל) על השכבה. אפשר הצלחות כדי לדגור במשך הלילה בטמפרטורת החדר. להתבונן תוצאות שיא למחרת בבוקר. הערה:עשוי להיות שימושי כדי לבצע ספוט מתוך דילול סדרתי של supernatant. זה יאפשר לחוקרים להבחין בין בקטריופאג ואת פעילות הסליקה bacteriocin. במקרה זה, מומלץ לבצע 1: 5 או 1:10 דילולים. </li></ol>

<ol>
	<li>Cavera, V. L., Arthur, T. D., Kashtanov, D., Chikindas, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacteriocins+and+their+position+in+the+next+wave+of+conventional+antibiotics.">Bacteriocins and their position in the next wave of conventional antibiotics.</a> Int J of Antimicrob Agents. 46 (5), 494-501 (2015).</li><li>Blaser, M. J., Cardon, Z. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Toward+a+Predictive+Understanding+of+Earth's+Microbiomes+to+Address+21st+Century+Challenges.">Toward a Predictive Understanding of Earth's Microbiomes to Address 21st Century Challenges.</a> MBio. 7 (3), e00714-e00716 (2016).</li><li>Hibbing, M. E., Fuqua, C., Parsek, M. R., Peterson, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bacterial+competition:+surviving+and+thriving+in+the+microbial+jungle.">Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle.</a> Nat Rev Microbiol. 8 (1), 15-25 (2010).</li><li>Michel-Briand, Y., Baysse, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pyocins+of+Pseudomonas+aeruginosa.">The pyocins of Pseudomonas aeruginosa.</a> Biochimie. 84 (5-6), 499-510 (2002).</li><li>Ghequire, M. G. K., De Mot, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ribosomally+encoded+antibacterial+proteins+and+peptides+from+Pseudomonas.">Ribosomally encoded antibacterial proteins and peptides from Pseudomonas.</a> FEMS Microbiol Rev. 38 (4), 523-568 (2014).</li><li>Cascales, E., Buchanan, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colicin+Biology.">Colicin Biology.</a> Microbiol and Mol Biol Rev. 71 (1), 158-229 (2007).</li><li>Brown, S. P., Le Chat, L., De Paepe, M., Taddei, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecology+of+Microbial+Invasions:+Amplification+Allows+Virus+Carriers+to+Invade+More+Rapidly+When+Rare.">Ecology of Microbial Invasions: Amplification Allows Virus Carriers to Invade More Rapidly When Rare.</a> Curr Biol. 16 (20), 2048-2052 (2006).</li><li>Grinter, R., Roszak, A. W., Cogdell, R. J., Milner, J. J., Walker, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Crystal+Structure+of+the+Lipid+II-degrading+Bacteriocin+Syringacin+M+Suggests+Unexpected+Evolutionary+Relationships+between+Colicin+M-like+Bacteriocins.">The Crystal Structure of the Lipid II-degrading Bacteriocin Syringacin M Suggests Unexpected Evolutionary Relationships between Colicin M-like Bacteriocins.</a> J Biol Chem. 287 (46), 38876-38888 (2012).</li><li>Hockett, K. L., Renner, T., Baltrus, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Independent+Co-Option+of+a+Tailed+Bacteriophage+into+a+Killing+Complex+in+Pseudomonas.">Independent Co-Option of a Tailed Bacteriophage into a Killing Complex in Pseudomonas.</a> MBio. 6 (4), (2015).</li><li>Iacobellis, N. S., Lavermicocca, P., Grgurina, I., Simmaco, M., Ballio, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Phytotoxic+properties+of+Pseudomonas+syringae+pv.+syringae+toxins.">Phytotoxic properties of Pseudomonas syringae pv. syringae toxins.</a> Physiol Mol Plant Pathol. 40 (2), 107-116 (1992).</li><li>Baltrus, D. A., Hendry, T. A., Hockett, K. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ecological+Genomics+of+Pseudomonas+syringae.">Ecological Genomics of Pseudomonas syringae.</a> Genomics of Plant-Associated Bacteria. , 59-77 (2014).</li><li>Gratia, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Numerical+Relationships+between+Lysogenic+Bacteria+and+Particles+of+Bacteriophage.">Numerical Relationships between Lysogenic Bacteria and Particles of Bacteriophage.</a> Ann Inst Pasteur. 57, 652 (1936).</li><li>King, E. O., Ward, M. K., Raney, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+simple+media+for+the+demonstration+of+pyocyanin+and+fluorescin.">Two simple media for the demonstration of pyocyanin and fluorescin.</a> J Lab Clin Med. 44, 301-307 (1954).</li><li>Heng, N. C. K., Wescombe, P. A., Burton, J. P., Jack, R. W., Tagg, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Diversity+of+Bacteriocins+in+Gram-Positive+Bacteria+.">The Diversity of Bacteriocins in Gram-Positive Bacteria .</a> Bacteriocins. (Chapter 4), 45-92 (2007).</li><li>Kawai, Y., Saito, T., Uemura, J., Itoh, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Rapid+Detection+Method+for+Bacteriocin+and+Distribution+of+Bacteriocin-producing+Strains+in+Lactobacillus+acidophilusGroup+Lactic+Acid+Bacteria+Isolated+from+Human+Feces.">Rapid Detection Method for Bacteriocin and Distribution of Bacteriocin-producing Strains in Lactobacillus acidophilusGroup Lactic Acid Bacteria Isolated from Human Feces.</a> Biosci Biotechnol Biochem. 61 (1), 179-182 (2014).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

טכניקת הכיסוי הרך אגר המתוארת כאן יושמה נרחבת במשך עשרות שנים רבות על ידי חוקרים מעוניינים ופאג&#39;ים או bacteriocins. היתרונות העיקריים של גישה זו הם כי הוא פשוט, זול יחסית קל לפרש. על ידי שילוב של כיסוי רך אגר עם ממטרים PEG ו דילול סדרתי, סוכני מיקרוביאלית ניתן לחלק גבוה לעומת סוכנים משקל מולקולרי נמוך, בשכפול הדנ&quot;א לעומת סוכנים שאינם בשכפול הדנ&quot;א (כלומר בקטריופאג לעומת tailocin, בהתאמה). לבסוף, שילוב של מניפולציה גנטית ממוקדת (מחיקות שלמות) של bacteriocin המשוערת או לוקוסי prophage יכול לקבוע את זהותה בתקיפות של תרכובת נתונה אנטגוניסטית. השתמשנו לאחרונה בשיטה זו כדי לתאר בקטריופאג הנגזרות חדש bacteriocin הרווחת בקרב Pseudomonas syringae זנים 9. תקשורת הצמיחה ותנאים מצוינים עבודה בפרוטוקול זה גם עבור Pseudomonas סאיםringae ו יספיק סביר עבור חיידקים גראם-שלילי אחרים הגדלים במרץ בתנאים אלה. עם זאת, חוקרים בשיטה זו ירצו לייעל את העיתוי, בינוני התרבות, שיטת אינדוקציה, וטמפרטורת דגירה של המערכת שלהם. הפרמטרים הקריטיים כוללים גרימת התרבות לייצר תוך בשלב צמיחת הלוגריתמים, כמו גם זריעת הכיסוי רך אגר עם תרבות בשלב לוגריתמים מספיק כדי להבטיח חלוקת חיידקים אחידה, אבל לא התרבות יתר, אשר מטשטשת אזורי סליקה פוטנציאליים. ישנם bacteriocins רב שאינם מושרים במסגרת תגובת ה- SOS, אלא הם המושרה באמצעות מערכות חישה קוורום מבוסס פפטיד (במיוחד bacteriocins גראם חיובי 15), ובכך, חוקר אולי כדאי להקרין כמה שיטות אינדוקציה שונות (כגון שינוי תוכן תזונתי של גרימה בינונית, או המאפשרים דגירה ממושכת של זן הייצור). בעת שימושבטכניקה זו, הכיסוי רך אגר חייב להיות נמס ביסודיות ומתוחזק על 55-60 מעלות צלזיוס לפני התוספת של זן הזריעה. היו לנו כמה בניסויים שבם-אגר הרך לא הותך ביסודיות (אם כי מבחינה ויזואלית זה נראה) וגרם שכבה עם מראה מגורען. תוצאות מ שכבה מגורענת עדיין יכולות להיות וניתנות לפרשנות בדרך כלל, עם זאת, זה תלוי את הכח של העיכוב (עיכוב החלש יהיה קשה יותר כדי לצפות). השתנו סופי, בלבול שיש להביא בחשבון בעת ​​השימוש בטכניקה זו היא שהטמפרטורה של אגר המותך מותרת מספיק זמן להתקרר לפני חיסון עם זן הזריעה, כדי למנוע הרג את מתח הזריעה. כדי למנוע בעיה זו, אנו להבטיח את אגר רך חם, אבל לא חם, לגעת. ברוח דברים אלה, יש לנו גם ציינו כי אם אנחנו נותנים זמן מספיק בשביל תרבות זריעה להסתגל אגרתי המותך, לפני מזיגת הכיסוי, אנחנו מחלצים גרמו חיידקי עניים בדרך כללrowth, מה שהופך פרשנות של עיכוב ספציפי קשה או בלתי אפשרי לפרש. זו הסיבה שאנו מאפשרים 10-15 שניות נוספות של דגירה בין vortexing ושופך השכבה. Trade-off בין השמירה על אגר במצב מותך לחלוטין (חם עדיף) אך לא חשף את מתח הזריעה (חם הוא לא טוב יותר) הוא אחת כי סביר להניח שאתה צריך להיקבע על ידי חוקר באמצעות ניסוי וטעייה. אם צעד ממטרי PEG משמש, זה יהיה מועיל לכלול שליטה שלילית שבו מדיום מרק סטרילית מעובד זהה supernatant התרבות. פעולה זו תבטיח כי הרג הפעילות אינה תוצאה של PEG שיורית או כלורופורם בתוך supernatant המדגם. כפי שניהם ופאג&#39;ים ו bacteriocins נוטים להיות מאוד ספציפי, אין זה נדיר להיתקל אין פעילות הרג לכאורה עם שילוב של זנים נתונים. זה יכול לנבוע ממגוון מחדש זן ספציפימנגנוני sistance, אחד להיות כי המתח הבוחן או חסר או יש גרסה לא מוכרת של הקולטן דרושי מיקוד ידי bacteriocin או bacteriophage נתונים. שיטה חלופית, שיטת הקרנת bacteriocin תוארה על ידי קאוואי et al. , אבל סובל חסרונות ולא אומצה 16 נרחב. באופן ספציפי, טכניקה זו מחייבת התבוננות דגימות מרק במרווחי זמן שיכול להיות מעיק, ואינה מאפשרת לאפליה בין פעילויות הרג בקטריופאג נגזרות bacteriocin הנגזרת. המגבלות העיקריות של טכניקה זו היא כי הוא אינו מתאים גם עבור אורגניזמים שאינם גדלים וחסון (ובכך יחסרו אזורי סליקה להבחין בקלות) או כי prophages הנמל או bacteriocins שלא מיוצרים וחסונה בתנאי מעבדה. לאימוצו של הטכניקה הזו כדי לזהות bacteriocins מיוצר דגימות סביבתיות הן ירחיב את תוכנית השירותבטכניקה זו ולהקל להבין טוב יותר את התפקיד של bacteriocins בתוך סביבה טבעית.

לאחרונה, חלה התעניינות משמעותית להעמקת ההבנה שלנו של אקולוגיה של חיידקים (בעיקר microbiomes של סביבות שונות), כמו גם תרכובות אנטיבקטריאלי חדשות להשתמש במאבק פתוגנים עמידים לאנטיביוטיקה 1,2. נושא מקשר בין האינטרסים אלה הוא הבנת אינטראקציות אנטגוניסטית בין זני חיידקים בסביבתם הטבעית. ישנן דרכים רבות בהן חיידקים להרגיז המתחרים 3. Bacteriocins, קבוצה מגוונת של תרכובות חלבוניים, אנטיבקטריאלי, נחקרו ארוכות על תפקידם בתיווך אנטגוניזם interbacterial, עם שני המינים הנחקרים ביותר להיות Pseudomonas aeruginosa 4,5 ו Escherichia coli 6, פתוגנים אנושיים חשובים. בנוסף bacteriocins, המושרה prophages יכול גם פועלים כסוכני anticompetitor, המאפשר זן לפלוש לתוך נישה כי כבר יישבו 7. Pseudomonas syringae הוא פתוגן צמח ידוע לייצר מערך סוכני מיקרוביאלית, כולל bacteriocins חלבון היחיד 8, נגזרות זנב בקטריופאג bacteriocins 9 (המכונה tailocins), כמו גם מטבוליטים משניים שאינם חלבוניים 10. לאחרונה חלה התעניינות בהבנה כיצד antimicrobials אלה משפיע על האקולוגיה של האורגניזם הזה, כמו גם איך הם יכולים להיות רתומים לשלוט צמח מחלה 11. שיטת שימוש נרחבת ללימוד הוא bacteriocins ו בקטריופאג היא טכניקת הכיסוי הרכה-אגר. שיטה זו תוארה לראשונה על ידי Gratia בשנת 1936 על מנת לסייע בתהליך ספירת 12,13 bacteriophage. כאן אנו מתארים את יישום שיטת הכיסוי הרך-אגר, בשילוב עם מניפולציה גנטית ממוקדת פוליאתילן גליקול (PEG) ממטרים, שחר להבחנה בתוך שלושה סוכנים מיקרוביאלית שונים (א בקטריופאג, bact משקל מולקולרי גבוהeriocin, וכן bacteriocin משקל מולקולרי נמוך) המיוצר על ידי זן חיידקים אחד. היתרון של גישה זו הוא כי זה יחסית פשוט וזול, וזו הסיבה, למרות היותו זה בהחלט &quot;לואו-טק&quot;, הוא עדיין שימוש נרחב.

<table><tbody><tr><td>Mitomycin C</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3514</td><td>Carcinogenic. use appropriate PPE (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34854</td><td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol (PEG)</td><td>Amresco</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological grade agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

הטכניקה כיסוי רך אגר פותחה במקור לפני למעלה מ -70 שנה ויש בו נעשה שימוש נרחב מספר תחומי מחקר מיקרוביולוגי, כולל עבודה עם ופאג&#39;ים ו bacteriocins, סוכנים אנטיבקטריאלי חלבוניים. גישה זו היא זולה יחסית, עם דרישות משאבים מינימאליות. טכניקה זו מורכב תצפית supernatant מן זן תורם (מחסה פוטנציאל תרכובת רעילה (ים)) על גבי כיסוי אגר רך הקרושה כי הוא זרע עם זן מבחן בקטריאלי (שעשוי להיות רגיש אל התרכובת הרעילה (ים)). ניצלנו בטכניקה זו כדי להקרין ספריה של Pseudomonas syringae זנים להרג intraspecific. על ידי שילוב גישה זו עם צעד ממטר ומחיקות גן ממוקדות, תרכובות רעילות מרובות המיוצרות על ידי הזן הזהה יכולות להיות מובחנות. שני הסוכנים אנטגוניסטית התאוששו בדרך כלל באמצעות טכניקה זו הם ופאג&#39;ים ו bacteriocins. סוכנים שני אלה יכולים להיות מובחנים באמצעותשתי בדיקות נוספות פשוט. ביצוע דילול סדר על supernatant המכיל בקטריופאג יגרום הפלאק בודד אהיה פחות במספרים עם דילול גדול יותר, ואילו דילול סדרה של supernatant המכיל bacteriocin יגרום אזור קרחת הופך אחיד יותר עכור עם דילול גדול יותר. בנוסף, בקטריופאג יפיק אזור סליקה כאשר הבחין על שכבה אגרה רכה טריה זורעת עם הזן הזהה, ואילו bacteriocin לא יצר אזור סליקה כאשר הועבר מדשאה אגרה רכה טריה, בשל הדילול של bacteriocin.

השילוב של הכיסוי אגר הרך ממטרי PEG יכול לשמש כדי לזהות ולאפיין סוכני מיקרוביאלית שונים המיוצרים על ידי אותו הזן. איור 1 מציג שני זנים של פ syringae (A ו- B) כי מעוכבים על ידי זן שלישי מאותו המין. שני הזנים, לעומת זאת, מעוכבים על ידי bacteriocins השונה. אזור סליקת זן מפגין קצה חד, ואילו אזור סליקת B מתח הוא גדול, והוא מציג גבול הלא חדה. מניפולציות גנטיות בתוך הזן לייצר באופן ספציפי להשבית גם את tailocin (tailocin לקוי) או משקל מולקולרי נמוך bacteriocin (bacteriocin לקוי) לאשר כי זני A ו- B רגישים bacteriocins הברור. איור 2 מראה כי הרג בתיווך בקטריופאג ניתן להבחין בין antimicrobials הלא בשכפול הדנ&quot;א האחר על ידי השוואת סדרת דילול. מכיוון שגם bacteriocins וprophage יכול להיגרם על ידי טיפול C mitomycin, פעילותם של שני חומרים אלה יכולים להידמות הדוק זה לזה (במיוחד אם הפאג מופעל בשפע). במקרה של סליקה בתיווך בקטריופאג, דילול של supernatant יפתור לתוך הפלאק בודד (אזורי סליקה) בעוד סליקת bacteriocin בתיווך לא תפתור לתוך הפלאק כזה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> איור 1: הבחנה פנוטיפי של סוכני מיקרוביאלית מרובים המיוצרים על ידי הזן הזהה. זן הוא רגיש bacteriocin משקל מולקולרי גבוה (tailocin) אך לא משקל מולקולרי נמוך אלטרנטיבה bacteriocin, כפי שמעידים חוסר סליקת זן tailocin הלקוי, אך לא זן bacteriocin הלקוי. לעומת זאת, זן B הוא חסר רגישות tailocin, אבל הוא רגיש bacteriocin המשקל המולקולרי הנמוך. Tailocin הוא efficiently התאושש הבאים ממטרים PEG, בעוד bacteriocins משקל מולקולרי נמוך אינם. WT = סוג בר. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> איור 2: הבחנה בין אי-בשכפול הדנ&quot;א antimicrobials ופאג&#39;ים. (א) דילול של כייל גבוה של תוצאות ופאג&#39;ים פלאק הבודד שהופכים פחות רב (למעלה כייל גבוה, בתחתית כייל נמוכה). (ב) דילול של תוצאות bacteriocins בסליקה פחות אחיד כי אינו פותר לתוך הפלאק בודד. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds at JoVE.com

Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

use-soft-agar-overlay-technique-to-screen-for-bacterially-produced

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.1K Views.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

Video: Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

באמצעות assay הכיסוי למדוד את הייצור בקטריאלי ורגישות לדלקת הריאות Bacteriocins איכותי

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

הקמת הגדרת תפוקה גבוהה להקרנה מולקולות קטנות לווסת ג-di-GMP איתות<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

מתודולוגיות לימוד<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilms כמודל לאפיון מולקולה קטנה Biofilm מעכבי

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

טכניקות מעבדה אספטיים: שיטות ציפוי

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biology

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

הקרנת תפוקה גבוהה של תרכובות כימיות כדי להבהיר את השפעתם על התמדה חיידקית

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

צמיחה נדחית Assay העיכוב לכמת את ההשפעה של antimicrobials הנגזר חיידקים על תחרות

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

שיטה להעריך אפקטים Bacteriocin על מיקרוביוטה המעיים של עכברים

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Soft Agar Colony Formation Assay: A Method to Test Effects of Novel Compounds on Cancer Cell Proliferation

Source: Horibata A. et. al., <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52727/utilization-soft-agar-colony-formation-assay-to-identify-inhibitors"> Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video describes a soft agar colony formation assay to test the effects of a PADI enzyme inhibitor and BB-Cl-amidine on breast cancer tumorigenicity in vitro. This assay also enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations.

בדיקת היווצרות מושבת אגר רכה: שיטה לבדיקת השפעות של תרכובות חדשות על התפשטות תאים סרטניים

Source: Horibata A. et. al.,  Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells. J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Cancer Research

Breast Cancer

In vitro studies

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

Source: Dalecki, A. G., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53925">Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm&#39;s metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

בדיקת ביופילם של צלחת יתד להקרנת חומרים אנטיבקטריאליים

1. Biofilm Initiation

	Grow a culture of biofilm-producing organisms in a nutrient-rich medium. Inoculate&#160;Staphylococcus aureus&#160;strain Newman ...

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Deferred Growth Inhibition Assay to Evaluate the Effect of Bacteria-Derived Antimicrobial Compounds

Source: Moran, J. C. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54437">Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video showcases the deferred growth inhibition assay, used to investigate how antimicrobial compounds produced by one type of bacteria affect another competing bacterial strain.

בדיקת עיכוב גדילה נדחית להערכת ההשפעה של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות שמקורן בחיידקים

The following method is adapted&#160;to test competitor strains with inhibitor-producing strains.
NOTE: This protocol involves aerosol generation with ...

השימוש בטכניקת הכיסוי הרך-אגר למסך תרכובות מעכבות הופקו bacterially

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video