Name: use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds
Uploaded: 2017-01-14T14:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 38 s
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This research was supported by the Agriculture and Food Research Initiative competitive grant 2015-67012-22773 from the USDA National Institute of Food and Agriculture to K.L.H.

1. Herstellung von Supernatant sein, um nach Aktivität getestet <ol><li> Bereiten Sie eine 0,5 mg / ml Stammlösung von Mitomycin C durch die entsprechende Menge in sterile 0,1 M MgSO 4 Puffer Auflösung (zB 1 mg Mitomycin C / 2 ml Puffer). Shop Lager bei 4 ° C in einem lichtgeschützten Behälter (Mitomycin C ist lichtempfindlich). </li><li> Impfen eine einzige Kolonie von P. syringae in 3 ml Königs Medium B (KB) Brühe 14. Inkubieren über Nacht unter Schütteln (200 rpm) bei Raumtemperatur (21-25 ° C). </li><li> Am nächsten Morgen, verdünnen Sie die Brühe Kultur 1/100 in 3 ml frisches KB Brühe. Inkubieren für 3-4 Stunden mit Schütteln bei Raumtemperatur. In Mitomycin C (0,5 ug / ml, Endkonzentration). Inkubieren der Kultur über Nacht mit Schütteln bei Raumtemperatur. HINWEIS: Mitomycin C verursacht doppelsträngigen DNA-Brüche, wodurch die Reaktion SOS Zelle stimulierenden, was zur Produktion von sowohl Bakteriophagen und Bacteriocinen. </li><li> Pellet 1-2 ml Mitomycin C Kulturen durch Zentrifugation bei 20.000 × g für 5 min in einer Tischmikro induziert. </li><li> Entfernen und sterilisieren Kulturüberstand entweder durch den Überstand durch einen Filter von 0,22 um Porengröße vorbei oder durch den Überstand mit Chloroform Behandlung (100 ul Chloroform pro 1 ml Überstand). <ol><li> Wenn unter Verwendung von Chloroform, Strudel der Mischung für 15 Sekunden und lassen bei Raumtemperatur für 1 Stunde inkubiert. Nach der Inkubation Zentrifugation der Mischung bei 20.000 × g für 5 min. HINWEIS: Chloroform effizient tötet Zellen, die durch ihre Solubilisierung von Membranen. Der Vorteil von Chloroform über Filtersterilisation ist, daß es billiger und einfacher ist, zu einer Zeit, viele (&gt; 20) -Proben maßstabs-up, wenn die Verarbeitung. Es kann eine Möglichkeit sein, dass eine gegebene Tötungsaktivität nach Chloroformbehandlung als Folge der Unterteilung in die organische Phase verloren geht. </li><li> Entfernen Sie die obere, wässrige Phase mit einer 1-ml-Pipette in ein frisches, steriles 1,5 oder 2,0 mlMikrozentrifugenröhrchen. Seien Sie vorsichtig, nicht von der unteren Chloroformschicht zu übertragen (es ist besser, zu entfernen, weniger von der wässrigen Phase Übertrag zu vermeiden). </li><li> Inkubieren des übertragenen Überstand in einem Abzug nicht begrenzten das restliche Chloroform verdampfen zu lassen (mehrere Stunden). Store-Überstände bei 4 ° C. </li></ol></li></ol> 2. Trennung und Konzentration von hochmolekularem bakteriziden Verbindungen von Polyethylenglykol (PEG) Fällung <ol><li> Zum sterilen Überstand, fügen NaCl und PEG 8000 bis 1 M und 10% Endkonzentrationen sind. bis invertieren wiederholt die Probe sowohl das NaCl und PEG vollständig gelöst sind. Inkubieren Proben in einem Eisbad für 1 h oder über Nacht bei 4 ° C. </li><li> Zentrifuge Proben bei 16.000 xg für 30 min bei 4 ° C. Ein Pellet sollte am Boden des Zentrifugenröhrchens bilden. Den Überstand abgießen und das Pellet in gewünschte Volumen (wie 1/10 oder 1/100 des ursprünglichen Überstand volUME) der Puffer (10 mM Tris, 10 mM MgSO 4, pH 7,0) durch wiederholtes Pipettieren. </li><li> Entfernung des restlichen PEG durch zwei aufeinanderfolgende Extraktionen mit einem gleichen Volumen an Chloroform. <ol><li> Kombinieren Chloroform mit dem resuspendierten Pellets und Vortex für 10 bis 15 Sekunden, Zentrifuge dann die Mischung bei 20.000 xg für 5 min. Übertragen Sie die obere, wässrige Phase in ein frisches Mikrozentrifugenröhrchen. Diese Extraktion, bis keine weißen Schnittstelle zwischen der wässrigen und der organischen Phase sichtbar ist (in der Regel zwei Extraktionen insgesamt). Lassen Rest Chloroform extrahiert aus Überstand in einem Abzug verdampfen. </li></ol></li></ol> 3. Herstellung von Overlay und Testüberstände auf Aktivität <ol><li> Impfen eine einzelne Kolonie von einer P. syringae - Stamm für die Empfindlichkeit in 3 ml KB getestet werden, Inkubation über Nacht mit Schütteln bei Raumtemperatur. </li><li> Am nächsten Morgen, verdünnen wieder die Kultur 1/100 in frischer KB. Inkubieren 3-4 h mit Schütteln bei Raum temperatuRe. </li><li> Bereiten sterilisiertem Wasser agar indem man eine Suspension von 0,35 bis 0,7% Autoklavierung (w / v) Agar in Reinstwasser. HINWEIS: Ein Vorrat an weichem Wasser Agar kann wiederholt in einer Mikrowelle und wiederverwendet werden geschmolzen, frisch Overlay muss nicht für jedes Experiment vorbereitet zu sein. Wenn Wasser Agar wieder verwendet wird, ist es von entscheidender Bedeutung, um sicherzustellen, wird folgende microwaving vollständig geschmolzen. Wenn nicht, wird das Overlay eine körnige Textur auf erstarrenden die Interpretation schwierig machen wird. Wenn dies geschieht, schmilzt das Agar für einige Minuten länger in der Mikrowelle als bisher durchgeführt. </li><li> Pflegen Sie das geschmolzene Weichagar in einem 60 ° C Wasserbad vor der Verwendung. Mit einer sterilen serologischen Pipette Transfer 3 ml Weichagar in ein steriles Kulturröhrchen. Liefert die Kulturröhrchen auf Wasserbad in einem geschmolzenen Zustand zu halten. </li><li> Um das Overlay gießen, zuerst das geschmolzene Agar abkühlen lassen (es sollte sich warm, aber nicht heiß zum Anfassen), aber nicht zulassen, sich zu verfestigen. </li><li> In einer sterilen Haube, impfen 100 uldie Teststammkultur in den weichen Agar und Wirbel zu mischen. Drehen Sie Kultur mit der Hand für 10 bis 15 Sekunden, dann gieße auf einem Boden-Agar (KB-Agar). Kippen Sie die Platte in alle Richtungen der Soft-Agar, um sicherzustellen, gleichmäßig den Boden Agar abdeckt. HINWEIS: Die untere Agar kann jeder verfestigt sein (1,5% Agar) Medium, auf dem die Teststamm kräftig wächst. Für einen Standard-Durchmesser von 100 mm Petrischale, verwenden Sie ~ 20 ml geschmolzene Medium. Der untere Agar kann mehrere Wochen vor der Zeit vorbereitet werden (bei 4 ° C ohne Trocknung gehalten) oder kann am gleichen Tag hergestellt werden. Wenn am gleichen Tag hergestellt, wie das Overlay durchgeführt wird, ist es am besten so vor tun 3.4 zu treten. </li><li> Decken Sie die Platte und lassen Sie es 20-30 Minuten zu verfestigen. Achten Sie darauf, die Platte nicht zu stören, während erstarrt. </li><li> Einmal verfestigt, beschmutzen 2-5 &amp; mgr; l Überstand (erzeugt in den Abschnitten 1 und 2, oben) auf das Overlay. Lassen Sie die Platten zur Inkubation über Nacht bei Raumtemperatur. Beobachten Sie und ein Rekordergebnis am nächsten Morgen. Notiere eskann nützlich sein aus einer Reihenverdünnung des Überstands durchzuführen und beschmutzen. Auf diese Weise können die Forscher zwischen Bakteriophagen und Bacteriocin Clearing-Aktivität zu unterscheiden. In diesem Fall ist es empfehlenswert, 1 auszuführen: 5 oder 01.10 Verdünnungen. </li></ol>

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The authors have nothing to disclose.

Die Soft-Agar-Overlay-Technik hier beschrieben ist seit vielen Jahrzehnten von den Forschern interessiert in Bakteriophagen oder bacteriocins weit verbreitet. Die wichtigsten Vorteile dieses Ansatzes sind, dass es ist einfach, billig und relativ einfach zu interpretieren. Durch die Kombination der Soft-Agar - Deckschicht mit PEG - Fällung und serielle Verdünnung können antimikrobielle Mittel in hohem bzw. niedrigem Molekulargewicht Mittel getrennt werden, und replikative vs. nicht replikativen Mittel (dh Bakteriophagen gegen tailocin, beziehungsweise). Schließlich kann Inkorporation von gezielte genetische Manipulation (Deletion und Komplementation) putativer Bacteriocin oder Prophagen loci fest um die Identität einer bestimmten antagonistische Verbindung herzustellen. Wir haben diese Methode vor kurzem eine neue Bakteriophagen abgeleiteten Bakteriocin weit verbreitet unter den Pseudomonas syringae - Stämmen 9 zu beschreiben. Die Wachstumsmedien und in diesem Protokoll Arbeit angegebenen Bedingungen gut für Pseudomonas syringae und würden für andere gramnegative Bakterien wahrscheinlich ausreichen , das kräftig unter diesen Bedingungen wachsen. Jedoch Forscher dieses Verfahren verwendet werden soll das Timing, Kulturmedium, Induktionsverfahren und Inkubationstemperatur für ihr System zu optimieren. Die kritischen Parameter sind die Produktionskultur zu induzieren, während in der logarithmischen Wachstumsphase sowie Impfen der Soft-Agar-Deckschicht mit einer ausreichenden logarithmischen Phase Kultur eine einheitliche Bakterienverteilung zu gewährleisten, aber nicht übermäßige Kultur, die potentiellen Klärungszonen verdunkeln wird. Es gibt viele Bakteriocine, die nicht als Teil der SOS - Antwort induziert , sondern werden durch peptidbasierte Quorum sensing - Systeme induziert (insbesondere Gram-positive Bacteriocine 15), damit ein Forscher möchte kann mehrere verschiedene Induktionsverfahren zu screenen (wie Modifizieren Nährstoffgehalt von Medium zu induzieren, oder so dass für längere Inkubation des produzierenden Stamm). Beim BenutzenDiese Technik muss der Weichagar overlay gründlich vor der Zugabe des seeding Dehnung bei 55-60 ° C geschmolzen und gehalten werden. Wir haben mehrere Experimente hatten, wo die Soft-Agar nicht gründlich geschmolzen war (wenn auch visuell es zu sein schien) und führte zu einer Überlagerung mit einem körniges Aussehen. Die Ergebnisse einer körnig Overlay kann im Allgemeinen noch interpretierbar sein, aber dies auf die Stärke der Hemmung (schwächere Hemmung wird schwieriger zu beobachten) abhängig ist. Eine letzte, Verwechselung Variable zu berücksichtigen, wenn mit dieser Technik ist, dass die Temperatur des geschmolzenen Agar wird ausreichend Zeit gelassen, bevor sie mit dem Aussäen Stamm der Inokulation zu kühlen, um die Tötung der Seeding-Stamm zu vermeiden. Um dieses Problem zu vermeiden, stellen wir sicher, die Soft-Agar ist warm, aber nicht heiß, zu berühren. In dieser Richtung haben wir auch festgestellt, dass, wenn wir nicht ausreichend Zeit für eine seeding Kultur geben zum geschmolzenen Agar zu akklimatisieren, bevor die Überlagerungs Ausgießen gewinnen wir im allgemeinen eine schlechte bakterielle growth, die Auslegung der spezifischen Hemmung schwierig oder unmöglich zu interpretieren ist. Aus diesem Grund wir 10-15 zusätzliche Sekunden Inkubation zwischen Verwirbelung und Gießen der Overlay ermöglichen. Die Trade-off der Agar in einem vollständig geschmolzenen Zustand zwischen der Aufrechterhaltung (heißer ist besser), aber nicht tödlich für die Aussaat Stamm (heißer ist nicht besser) ist eine, die wahrscheinlich von einem Forscher durch Versuch und Irrtum bestimmt werden müssen. Wenn ein PEG-Fällungsschritt verwendet wird, wäre es vorteilhaft, eine negative Kontrolle enthalten, wo eine sterile Broth-Medium identisch zu dem Kulturüberstand verarbeitet wird. Dadurch wird sichergestellt, dass die Aktivität Töten ist nicht das Ergebnis von Rest PEG oder Chloroform innerhalb des Probenüberstand. Da beide Bakteriophagen und bacteriocins neigen hoch spezifisch zu sein, ist es nicht ungewöhnlich, mit einer bestimmten Kombination von Stämmen keinen offensichtlichen Tötungsaktivität zu begegnen. Dies kann aus einer Vielzahl von stammspezifischen re führenResistenz-Mechanismen, wobei man, dass der Stamm-Tester entweder fehlt oder hat eine unbekannte Version des von einem bestimmten Bacteriocin oder Bakteriophagen benötigt Rezeptor für das Targeting. Ein alternatives Verfahren, Bacteriocin Screeningverfahren wurde von Kawai et al beschrieben worden. , Leidet aber unter Nachteile und hat weit 16 nicht verabschiedet. Insbesondere erfordert diese Technik broth Proben in Zeitintervallen beobachtet, die lästig sein kann und nicht für die Unterscheidung zwischen Bakteriophagen abgeleiteten Bakteriocin und abgeleitete Abtötung Aktivitäten erlaubt. Die wichtigsten Einschränkungen dieser Technik ist, dass es nicht gut für Organismen geeignet ist, die wachsen nicht robust (und wird somit leicht unterscheidbare Klärungszonen fehlt), oder dass Hafen Prophagen oder Bakteriocine, die nicht robust unter Laborbedingungen hergestellt. Adaption dieser Technik bacteriocins zu erkennen, in Umweltproben erzeugt würde sowohl den Nutzen erweiterndieser Technik und einen besseren Einblick in die Rolle der bacteriocins in natürlicher Umgebung erleichtern.

Vor kurzem gab es in unser Verständnis der mikrobiellen Ökologie wesentlichem Interesse (insbesondere die microbiomes verschiedener Umgebungen), sowie neue antibakterielle Verbindungen bei der Bekämpfung von Antibiotika - resistenten Erregern 1,2 zu verwenden. Ein Verbindungs ​​Thema zwischen diesen Interessen ist das Verständnis antagonistische Wechselwirkungen zwischen Bakterienstämmen in ihrer natürlichen Umgebung. Es gibt zahlreiche Wege , auf denen Bakterien Konkurrenten 3 antagonisieren. Bacteriocins, eine heterogene Gruppe von protein-, antibakterielle Verbindungen, wurden für ihre Rolle längst bei der Vermittlung interbakterieller Antagonismus, mit zwei der am meisten untersuchten Spezies ist von Pseudomonas aeruginosa 4,5 und Escherichia coli 6, wichtige menschliche Krankheitserreger untersucht. Neben bacteriocins können, induzierte Prophagen auch als anticompetitor Mittel wirken, so dass ein Stamm in eine Nische zu erobern , die bereits 7 besiedelt ist. Pseudomonas syringae ist eine bekannte Pflanze Pathogen eine Reihe von antimikrobiellen Mitteln zu erzeugen, einschließlich einzelnes Protein bacteriocins 8, Bakteriophagenschwanz abgeleitete bacteriocins 9 (genannt tailocins) sowie Nicht-Protein - Sekundärmetaboliten 10. In letzter Zeit hat das Interesse gewesen zu verstehen , wie diese antimikrobiellen Substanzen , die Ökologie dieses Organismus beeinflussen, und wie können sie genutzt werden , um Pflanzenkrankheiten 11 steuern. Eine weit verwendete Methode sowohl bacteriocins und Bakteriophagen für die Untersuchung ist die Soft-Agar-Overlay-Technik. Diese Methode wurde zum ersten Mal in das Aufzählen Bakteriophagen 12,13 von Gratia 1936 zu Hilfe beschrieben. Hier wir die Anwendung der weich Agar-Overlay-Verfahren in Kombination mit gezielten genetischen Manipulation und Polyethylenglycol (PEG) Fällung, bei der Unterscheidung zwischen drei verschiedenen antimikrobiellen Mitteln (ein Bakteriophage beschreiben, ein hochmolekulares bacteriocin, und ein niedermolekulares Bacteriocin) durch eine einzelne Bakterienstamm produziert. Der Vorteil dieses Ansatzes ist, dass es relativ einfach ist und billig, weshalb, obwohl es entschieden &quot;Low-Tech&quot; zu sein, wird immer noch weit verbreitet genutzt.

<table><tbody><tr><td>Mitomycin C</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-3514</td><td>Carcinogenic. use appropriate PPE (&lt;em&gt;i.e.&lt;/em&gt; gloves, eye protection, and face mask), particularly when preparing the stock solution.</td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>34854</td><td>Acutely toxic, respiratory hazard. Use appropriate PPE (glove and eye shield), handle open containers within a chemical fume hood.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Polyethylene Glycol (PEG)</td><td>Amresco</td><td>0159</td><td></td></tr><tr><td>Bacteriological grade agar</td><td>Genesee Scientific</td><td>20-274</td><td></td></tr></tbody></table>

use of the soft-agar overlay technique to screen for bacterially produced inhibitory compounds

Die Soft-Agar-Overlay-Technik wurde ursprünglich vor mehr als 70 Jahren entwickelt und in verschiedenen Bereichen der mikrobiologischen Forschung, einschließlich der Arbeit mit Bakteriophagen und bacteriocins, proteinhaltiges antibakterielle Mittel in großem Umfang eingesetzt worden. Dieser Ansatz ist relativ kostengünstig, mit geringem Ressourcenbedarf. Diese Technik besteht Überstand von einem Spenderstamm von Spek (möglicherweise eine toxische Verbindung Beherbergung (n)) auf eine verfestigte weiche Agar-Deckschicht, die mit einem bakteriellen Teststamm (potentiell empfindlich gegenüber der toxischen Verbindung (en)) ausgesät wird. Wir nutzten diese Technik eine Bibliothek von Pseudomonas syringae zu screenen für innerartliche Tötung Stämme. Durch die Kombination dieser Ansatz mit einem Fällungsschritt und gezielte Gen-Deletionen, mehrere toxische Verbindungen, die durch den gleichen Stamm hergestellt werden, können unterschieden werden. Die beiden antagonistischen Mittel häufig diese Technik gewonnen verwenden, sind Bakteriophagen und bacteriocins. Diese beiden Mittel können differenziert werden unter Verwendung vonzwei einfache zusätzliche Tests. Durchführen einer seriellen Verdünnung auf einen Überstand Bakteriophagen enthält, wird in den einzelnen Plaques führen weniger an der Zahl mit größerer Verdünnung zu werden, während serielle Verdünnung eines Überstand Bacteriocin enthält eine Klärungszone führen, die mit einer größeren Verdünnung gleichmäßig mehr trüb wird. Darüber hinaus wird ein Bakteriophage eine Klärungszone erzeugen, wenn sie auf eine frische Soft-Agar-Overlay ausgesät mit dem gleichen Stamm entdeckt, während ein Bakteriocin wird keine Klärungszone erzeugen, wenn sie zu einem frischen Weichagar Rasen übertragen, um die Verdünnung des Bakteriocin zurückzuführen ist.

Die Kombination des weichen Agar-Deckschicht und PEG-Fällung kann verwendet werden, um verschiedene antimikrobielle Mittel durch die gleiche Stamm produziert zu identifizieren und zu charakterisieren. Figur 1 zeigt zwei Stämme von P. syringae (A und B) , die durch eine dritte Stamm der gleichen Spezies inhibiert werden. Die beiden Stämme sind jedoch durch verschiedene bacteriocins gehemmt. Die Klärungszone auf Stamm A weist eine scharfe Kante, während die Klärungszone auf Stamm B größer ist, und weist eine nicht scharfe Grenze. Genetische Manipulationen innerhalb des produzierenden Stammes, der spezifisch entweder die tailocin (tailocin mangelhaft) oder niedermolekularen Bacteriocin (bacteriocin mangelhaft) bestätigen zu inaktivieren, die A- und B-Stämme sind empfindlich auf unterschiedliche bacteriocins. 2 zeigt , dass Bakteriophagen-vermittelten Abtötung kann durch Vergleichen einer Verdünnungsreihe von anderen nicht-replikativen antimikrobiellen Mitteln unterschieden werden. Da beide bacteriocins undProphagen kann durch Mitomycin C-Behandlung, Aktivitäten dieser beiden Mittel können einander sehr ähnlich induziert werden (insbesondere, wenn die aktivierte Phagen reichlich vorhanden ist). Im Falle der Bakteriophagen-vermittelten Clearing, Verdünnung des Überstandes wird in einzelne Plaques (Clearing-Zonen) lösen, während Bacteriocin-vermittelte Clearing nicht in eine solche Plaques lösen wird. <img alt="Abbildung 1" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig1.jpg" /> Abbildung 1: Die phänotypische Unterscheidung mehrerer antimikrobieller Mittel durch den gleichen Stamm produziert. Stamm A ist empfindlich gegenüber einem hochmolekularen Bacteriocin (tailocin), aber keine Alternative mit niedrigem Molekulargewicht Bacteriocin, wie durch das Fehlen von belegt in der tailocin defizienten Stamm löschen, jedoch nicht die Bacteriocin-defiziente Stamm. Umgekehrt ist der Stamm B zum tailocin insensitive, ist jedoch empfindlich gegenüber der niedermolekularen Bakteriocin. Die tailocin ist efficiently folgende PEG Fällung gewonnen, während mit niedrigerem Molekulargewicht bacteriocins nicht. WT = Wildtyp. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55064/55064fig1large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a> <img alt="Figur 2" src="/files/ftp_upload/55064/55064fig2.jpg" /> Abbildung 2: Die Unterscheidung zwischen nicht-replikativen antimikrobielle Substanzen und Bakteriophagen. (A) Verdünnung von einem hohen Titer von Bakteriophagen Ergebnisse in einzelnen Plaques , die weniger zahlreich geworden (hohe Titer oben, niedrige Titer unten). (B) Verdünnung von bacteriocins Ergebnisse in gleichmäßig weniger Lichtung , die nicht in einzelne Plaques löst. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">Bitte klicken Sie hier</a> , um <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55064/55064fig2large.jpg" target="_blank">eine größere Version dieser Figur zu sehen.</a>

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Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria.

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

The soft-agar overlay technique was originally developed over 70 years ago and has been widely used in several areas of microbiological research, ...

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Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

32.1K Aufrufe.  University of Arizona. We describe a simple method for screening bacterial cultures for the production of compounds inhibitory towards other bacteria. 

Serie: Use of the Soft-agar Overlay Technique to Screen for Bacterially Produced Inhibitory Compounds

Using the Overlay Assay to Qualitatively Measure Bacterial Production of and Sensitivity to Pneumococcal Bacteriocins

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms. We have shown that bacterially produced antimicrobial peptides (bacteriocins) dictate the outcome of these competitive interactions. All fully-sequenced pneumococcal strains harbor a bacteriocin-like peptide (blp) locus. The blp locus encodes for a range of diverse bacteriocins and all of the highly conserved components needed for their regulation, processing, and secretion. The diversity of the bacteriocins found in the bacteriocin immunity region (BIR) of the locus is a major contributor of pneumococcal competition. Along with the bacteriocins, immunity genes are found in the BIR and are needed to protect the producer cell from the effects of its own bacteriocin. The overlay assay is a quick method for examining a large number of strains for competitive interactions mediated by bacteriocins. The overlay assay also allows for the characterization of bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides. The assay is performed by pre-inoculating an agar plate with a strain to be tested for bacteriocin production followed by application of a soft agar overlay containing a strain to be tested for bacteriocin sensitivity. A zone of clearance surrounding the stab indicates that the overlay strain is sensitive to the bacteriocins produced by the pre-inoculated strain. If no zone of clearance is observed, either the overlay strain is immune to the bacteriocins being produced or the pre-inoculated strain does not produce bacteriocins. To determine if the blp locus is functional in a given strain, the overlay assay can be adapted to evaluate for peptide pheromone secretion by the pre-inoculated strain. In this case, a series of four lacZ-reporter strains with different pheromone specificity are used in the overlay.

Competition in Streptococcus pneumoniae is mediated by bacteriocins, small antimicrobial peptides with inhibitory activity towards pneumococcus and other related species.&#160; Here we describe an optimized bacterial overlay assay that allows for the characterization of bacteriocin activity and inhibitory spectrum, bacteriocin-specific immunity, and detection of secreted quorum sensing peptides.

Verwendung des Overlay-Assay zur qualitativen Messung bakterielle Produktion und die Sensibilität für Pneumokokken Bacteriocine

Streptococcus pneumoniae colonizes the highly diverse polymicrobial community of the nasopharynx where it must compete with resident organisms.  We have ...

Forschung

Immunologie und Infektion

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. Regulatory systems that utilize intracellular cyclic di-GMP (c-di-GMP) as a second messenger are one such class of target. c-di-GMP is a signaling molecule found in almost all bacteria that acts to regulate an extensive range of processes including antibiotic resistance, biofilm formation and virulence. The understanding of how c-di-GMP signaling controls aspects of antibiotic resistant biofilm development has suggested approaches whereby alteration of the cellular concentrations of the nucleotide or disruption of these signaling pathways may lead to reduced biofilm formation or increased susceptibility of the biofilms to antibiotics. We describe a simple high-throughput bioreporter protocol, based on green fluorescent protein (GFP), whose expression is under the control of the c-di-GMP responsive promoter cdrA, to rapidly screen for small molecules with the potential to modulate c-di-GMP cellular levels in Pseudomonas aeruginosa (P. aeruginosa). This simple protocol can screen upwards of 3,500 compounds within 48 hours and has the ability to be adapted to multiple microorganisms.

Establishment of a High-throughput Setup for Screening Small Molecules That Modulate c-di-GMP Signaling in Pseudomonas aeruginosa

This article describes the high-throughput assay that has been successfully established to screen large libraries of small molecules for their potential ability to manipulate cellular levels of cyclic di-GMP in Pseudomonas aeruginosa, providing a new powerful tool for antibacterial drug discovery and compound testing.

Einrichtung eines Setup-Hochdurchsatz-Screening für kleine Moleküle, die Modulate c-di-GMP-Signalisierung in<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em

Bacterial resistance to traditional antibiotics has driven research attempts to identify new drug targets in recently discovered regulatory pathways. ...

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and resilience of Bacillus subtilis biofilms. First, methods are presented that select for small molecule inhibitors with biofilm-specific targets in order to separate the effect of the small molecule inhibitors on planktonic growth from their effect on biofilm formation. Next, we focus on how inoculation conditions affect the sensitivity of multicellular, floating B. subtilis cultures to small molecule inhibitors. The results suggest that discrepancies in the reported effects of such inhibitors such as D-amino acids are due to inconsistent pre-culture conditions. Furthermore, a recently developed protocol is described for evaluating the contribution of small molecule treatments towards biofilm resistance to antibacterial substances. Lastly, scanning electron microscopy (SEM) techniques are presented to analyze the three-dimensional spatial arrangement of cells and their surrounding extracellular matrix in a B. subtilis biofilm. SEM facilitates insight into the three-dimensional biofilm architecture and the matrix texture. A combination of the methods described here can greatly assist the study of biofilm development in the presence and absence of biofilm inhibitors, and shed light on the mechanism of action of these inhibitors.

Methodologies for Studying B. subtilis Biofilms as a Model for Characterizing Small Molecule Biofilm Inhibitors

This study presents the development of reproducible methodologies to study biofilm inhibitors and their effects on Bacillus subtilis multicellularity.

Methodologien für das Studium<em&gt; B. subtilis</em&gt; Biofilme als Modell für kleine Molekül-Inhibitoren Biofilm Charakterisieren

This work assesses different methodologies to study the impact of small molecule biofilm inhibitors, such as D-amino acids, on the development and ...

Aseptic Laboratory Techniques: Plating Methods

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies on the ability of a scientist to sterilize work surfaces and equipment as well as prevent contact of sterile instruments and solutions with non-sterile surfaces. Here we present the steps for several plating methods routinely used in the laboratory to isolate, propagate, or enumerate microorganisms such as bacteria and phage. All five methods incorporate aseptic technique, or procedures that maintain the sterility of experimental materials. Procedures described include (1) streak-plating bacterial cultures to isolate single colonies, (2) pour-plating and (3) spread-plating to enumerate viable bacterial colonies, (4) soft agar overlays to isolate phage and enumerate plaques, and (5) replica-plating to transfer cells from one plate to another in an identical spatial pattern. These procedures can be performed at the laboratory bench, provided they involve non-pathogenic strains of microorganisms (Biosafety Level 1, BSL-1). If working with BSL-2 organisms, then these manipulations must take place in a biosafety cabinet. Consult the most current edition of the Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories (BMBL) as well as Material Safety Data Sheets (MSDS) for Infectious Substances to determine the biohazard classification as well as the safety precautions and containment facilities required for the microorganism in question. Bacterial strains and phage stocks can be obtained from research investigators, companies, and collections maintained by particular organizations such as the American Type Culture Collection (ATCC). It is recommended that non-pathogenic strains be used when learning the various plating methods. By following the procedures described in this protocol, students should be able to: 
 
&#9679; Perform plating procedures without contaminating media. 
&#9679; Isolate single bacterial colonies by the streak-plating method. 
&#9679; Use pour-plating and spread-plating methods to determine the concentration of bacteria. 
&#9679; Perform soft agar overlays when working with phage. 
&#9679; Transfer bacterial cells from one plate to another using the replica-plating procedure. 
&#9679; Given an experimental task, select the appropriate plating method.

When working with media and reagents used to culture microorganisms, aseptic technique must be practiced to ensure contamination is minimized. A variety of plating methods are routinely used to isolate, propagate, or enumerate bacteria and phage, all of which incorporate procedures that maintain the sterility of experimental materials.

Aseptische Labortechnik: Überzug Methoden

Microorganisms are present on all inanimate surfaces creating ubiquitous sources of possible contamination in the laboratory. Experimental success relies ...

Biologie

High-throughput Screening of Chemical Compounds to Elucidate Their Effects on Bacterial Persistence

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. They are an important health concern as they have been associated with recurrent chronic infections. Although stochastic and deterministic dynamics of stress-related mechanisms are known to play a significant role in persistence, mechanisms underlying the phenotypic switch to/from the persistence state are not completely understood. While persistence factors triggered by environmental signals (e.g., depletion of carbon, nitrogen and oxygen sources) have been extensively studied, the impacts of osmolytes on persistence are yet to be determined. Using microarrays (i.e., 96 well plates containing various chemicals), we have designed an approach to elucidate the effects of various osmolytes on Escherichia coli persistence in a high throughput manner. This approach is transformative as it can be readily adapted for other screening arrays, such as drug panels and gene knockout libraries.

In this method paper, we present a high-throughput screening strategy to identify chemical compounds, such as osmolytes, that have a significant impact on bacterial persistence.

Hochdurchsatz-Screening chemischer Verbindungen zur Aufklärung ihrer Auswirkungen auf die bakterielle Persistenz

Bacterial persisters are defined as a small subpopulation of phenotypic variants with the capability of tolerating high concentrations of antibiotics. ...

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

Latente Growth Inhibition Assay zur Quantifizierung der Wirkung von Bakterien abgeleitete Antimikrobielle auf Wettbewerb

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

A Method to Assess Bacteriocin Effects on the Gut Microbiota of Mice

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the factors that contribute to maintaining the population balance. However, there are limited available methodologies to evaluate these factors. Bacteriocins are antimicrobial peptides produced by many bacteria that may confer a competitive advantage for food acquisition and/or niche establishment. Many probiotic lactic acid bacteria (LAB) strains have great potential to promote human and animal health by preventing the growth of pathogens. They can also be used for immuno-modulation, as they produce bacteriocins. However, the antagonistic activity of bacteriocins is normally determined by laboratory bioassays under well-defined but over-simplified conditions compared to the complex gut environment in humans and animals, where bacteria face multifactorial influences from the host and hundreds of microbial species sharing the same niche. This work describes a complete and efficient procedure to assess the effect of a variety of bacteriocins with different target specificities in a murine system. Changes in the microbiota composition during the bacteriocin treatment are monitored using compositional 16S rDNA sequencing. Our approach uses both the bacteriocin producers and their isogenic non-bacteriocin-producing mutants, the latter giving the ability to distinguish bacteriocin-related from non-bacteriocin-related modifications of the microbiota. The fecal DNA extraction and 16S rDNA sequencing methods are consistent and, together with the bioinformatics, constitute a powerful procedure to find faint changes in the bacterial profiles and to establish correlations, in terms of cholesterol and triglyceride concentration, between bacterial populations and health markers. Our protocol is generic and can thus be used to study other compounds or nutrients with the potential to alter the host microbiota composition, either when studying toxicity or beneficial effects.

Bacteriocins are believed to play a key role in defining microbial diversity in different ecological niches. Here, we describe an efficient procedure to assess how bacteriocins affect gut microbiota composition in an animal model.

Eine Methode zur Beurteilung von Bakteriocin-Wirkungen auf die Gut-Mikrobiota von Mäusen

Very intriguing questions arise with our advancing knowledge on gut microbiota composition and the relationship with health, particularly relating to the ...

Soft Agar Colony Formation Assay: A Method to Test Effects of Novel Compounds on Cancer Cell Proliferation

Source: Horibata A. et. al., <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52727/utilization-soft-agar-colony-formation-assay-to-identify-inhibitors"> Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video describes a soft agar colony formation assay to test the effects of a PADI enzyme inhibitor and BB-Cl-amidine on breast cancer tumorigenicity in vitro. This assay also enables the quantitative assessment of cell transformation potential within the context of genetic perturbations.

Assay zur Bildung von Weichagar-Kolonien: Eine Methode zum Testen der Auswirkungen neuartiger Verbindungen auf die Proliferation von Krebszellen

Source: Horibata A. et. al.,  Utilization of the Soft Agar Colony Formation Assay to Identify Inhibitors of Tumorigenicity in Breast Cancer Cells. J. Vis. ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Krebsforschung

Breast Cancer

In vitro studies

A Peg Plate Biofilm Assay for Screening Antibacterial Agents

Source: Dalecki, A. G., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53925">Targeting Biofilm Associated Staphylococcus aureus Using Resazurin Based Drug-susceptibility Assay.</a> J. Vis. Exp. (2016)
This video demonstrates an assay for screening antimicrobial compounds that efficiently eliminate biofilms using a peg-plate. The methodology monitors the biofilm&#39;s metabolic state after treatment with antimicrobial compounds, facilitating the determination of the minimum biofilm eradication concentration.

Ein Peg-Platten-Biofilm-Assay für das Screening antibakterieller Wirkstoffe

1. Biofilm Initiation

	Grow a culture of biofilm-producing organisms in a nutrient-rich medium. Inoculate&#160;Staphylococcus aureus&#160;strain Newman ...

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Deferred Growth Inhibition Assay to Evaluate the Effect of Bacteria-Derived Antimicrobial Compounds

Source: Moran, J. C. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54437">Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video showcases the deferred growth inhibition assay, used to investigate how antimicrobial compounds produced by one type of bacteria affect another competing bacterial strain.

Ein Assay zur verzögerten Wachstumshemmung zur Bewertung der Wirkung von antimikrobiellen Verbindungen aus Bakterien

The following method is adapted&#160;to test competitor strains with inhibitor-producing strains.
NOTE: This protocol involves aerosol generation with ...

Die Nutzung der Soft-Agar-Overlay-Technik zur Leinwand für bakteriell Hemmstoffe Produziert

Zusammenfassung

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