Name: isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood
Uploaded: 2017-01-06T11:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 3 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood at JoVE.com

The authors acknowledge Meike Schaffrinski for excellent technical assistance. We would like to thank the following people for their help in the collection of peripheral blood samples (all from University Medical Center G&#246;ttingen): Henrietta Vida (Dept. of Transfusion Medicine), Kia Homayounfar, Lena-Christin Conradi (Dept. of General, Visceral and Pediatric Surgery), Leila Siam, Bawarjan Schatlo (Dept. of Neurosurgery), Hendrik A. Wolff, Martin Canis (Dept. of Otorhinolaryngology, Head and Neck Surgery) as well as all employees of the interdisciplinary short-term oncology. We acknowledge Dirk Wenzel (Max Planck Institute for Biophysical Chemistry, G&#246;ttingen) for his help with the electron microscopy of MVs. 
The study was funded by the German Ministry of Education and Research (BMBF) project MetastaSys (grant no. 0316173) as well as the German Cancer Aid (grant no. 109615).

כל הניסויים בבני אדם כוללים אושרו על ידי ועדת האתיקה המקומית (אישור לא. 3/2/14). עבור הבחירה של חולים יש לציין כי מספר גורמים כמו גיל, מין, משטרי טיפול נוכחיים ועוד רבים עשויים להשפיע רכב MV בדם ולכן צריכים להילקח בחשבון לפני לדגום אוסף 22,23. 1. הכנת דוגמאות פלזמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צייר 1 - 2 צינורות הדם לכל התורם באמצעות מחט פרפר 21-מד לתוך צינור איסוף הדם Vacutainer המכיל EDTA (דם 1.6 מ&quot;ג / מ&quot;ל). הקפד להפוך את הצינור (ים) כמה פעמים כדי להבטיח קרישה בדם יעילה. הערה: נפח הדם מומלץ cytometry זרימת עוקבות וניתוח כתם המערבי הוא 5 - 15 מ&quot;ל. על מנת למנוע הידרדרות MV ואובדן, דגימות דם צריכים להיות מטופלים &lt;30 דק &#39;לאחר נסיגת הדם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו דגימות פלסמה ידי צנטריפוגה דגימות במשך 15 דקות ב 1200 XG בבטמפרטורת החדר (RT). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלת מסנן שסתום כדי לעזור הפרדת הפלזמה (= שכבה עליונה) מן הנותרים כדוריים דם (= שכבה תחתונה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את הפלזמה לתוך צינור 15 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 15 דקות ב 1500 XG, RT כדי גלולת פסולת תא גדולה ולהסיר טסיות נותרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את supernatant לתוך צינור 15 מ&quot;ל ולהמשיך ישירות עם דגימות לבידוד או חנות MV עד 6 חודשים ב -20 ° C. הערה: הפרוטוקול המובא יכול לשמש גם כדי לבודד MVS (ו Exos) מן supernatants תרבית תאים. על מנת לעשות זאת, לטפח תאים ב 60 - 80% confluency עבור 24 - 48 שעות במדיום התרבות בתוספת FCS שלפוחית ​​מדולדלת, ולאחר מכן לאסוף את supernatant. צנטריפוגה במשך 5 דקות ב 750 XG, 4 ° C כדי לרוקן תאים צפים שיורית, למלא את supernatant לתוך צינור צנטריפוגות 15 מ&quot;ל חדש שוב במשך 5 דקות ב 1500 XG, 4 ° C עד גלולה פסולת התא גדול יותר. supernatant אז זה יכול לשמש עבור בידוד של MVSכמתואר בשלב 2.1 - 2.16. </li></ol> בידוד 2. MVS <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעביר את מדגם הפלזמה בתוך שפופרת צנטריפוגה מתאימה. במידת הצורך, למלא את הצינור עם PBS כדי לדלל את המדגם ולמנוע קריסה של צינורות דקים קירות במהלך ההליך צנטריפוגה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה במשך 35 דקות ב 14,000 XG, 4 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> supernatant למזוג, לשמור צינורות מהופכים ולשים על מגבת נייר. חכה 3 - 5 דקות עד שכל supernatant הנותרים כבר נספג מגבת והוציא ובכך מן המדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה MV ב 1,000 μL PBS, והעברת צינור צנטריפוגות 1.5 מ&quot;ל במשך 35 דקות ב 14,000 XG, 4 ° C בצנטריפוגה השולחן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה MV ב 50 - 500 μL PBS, תלוי בגודל של גלולה. לחלופין, lyse MVS ישירות, למשל, במאגר ריפה (150 מ&quot;מ NaCl / 0.1% SDS / 0.5% Na-deoxycholate / 1% Triton X-100/50 מ&quot;מ טריס, pH 7.2)לניתוח כתם המערבי לאחר מכן. MVS החנות ב -20 מעלות צלזיוס. הם יישארו יציבים במשך כמה חודשים, אך להימנע להקפיא להפשיר מחזורים חוזרים ונשנים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אופציונלי: קביעת ריכוז חלבון MV עם assay חלבון (למשל, ברדפורד או שיטה לורי) על מנת להעריך תשואות MV או מינון MVS לניסויים הבאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם Exos נוספים הם להיות מבודדים מן דגימות פלזמה, למזוג supernatant משלב 2.3 לתוך צינור ultracentrifugation צנטריפוגות במשך 2 שעות ב 110,000 XG, 4 ° C. למזוג supernatant כמתואר בשלב 2.3, resuspend גלולה Exo ב 1,000 μL PBS ולהעביר לתוך קטן (1.5 מ&quot;ל) צינורות ultracentrifugation. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Ultracentrifuge עבור 2 שעות על 110,000 XG, 4 ° C, לשאוב supernatant גלולה Exo resuspend ב 50 - 75 μL PBS או חיץ Ripa. </li></ol></li></ol> אפיון 3. MVS ידי cytometry זרימה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 15 μL PBS + 1% נסיוב עגל עוברי מדולדל שלפוחית ​​(FCS) בצינור cytometry הזרימה. הערה: שלפוחיות מדולדל FCS הוא הוכן על ידי צנטריפוגה חום מומת (30 דקות ב 56 מעלות צלזיוס) FCS במשך 18 שעות ב 110,000 XG ו filtrating את supernatant דרך 0.2 מיקרומטר מסנן כפי שתואר לעיל 24. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 5 מיקרוגרם (במקרה של תשואות נמוכות 3 מיקרוגרם חלים גם) של MVS ב PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירת דגימות עבור 30 דקות ב RT על מנת לחסום אתרי קישור נוקבים על פני שטח MV ובכך להפחית מכתים רקע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת נוגדנים שכותרתו fluorescently נגד החלבון של העניין. לכייל את כמות הנוגדנים משמשת המכתים לפני השימוש כדי לקבוע את הריכוז האופטימלי ולהבטיח מנת אות לרעש נמוכה. ודא גם לכלול צינור אחד עם MVS בלא כתם כמו שליטה שלילי צינור אחד MVS מוכתם נוגדן אלוטיפ התאמת באותו ריכוז (למשל, אם 1 מיקרוגרם של הנוגדן משמש, גם להשתמש 1 מיקרוגרם של פקד אלוטיפtibody) לכמת מכתים רקע. הערה: אפשר גם לבצע זרימת ססגוניות cytometry ידי הוספת נוגדנים מרובים מצמידים fluorochromes שונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה במשך 20 דקות ב RT בחושך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 250 μL PBS והמשך עם המדידה של המדגם באמצעות cytometer זרימה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה כזה דגימות שלא ניתן למדוד באופן מיידי, להוסיף 150 μL PBS ו -50 paraformaldehyde μL 4% (PFA) כדי לתקן דגימות ולאחסן ב 4 ° C.. זהירות: PFA הוא רעיל. יש להשתמש בכפפות וציוד מגן אישי מתאים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיך את הסף של הזרימה cytometer לערך הנמוך ביותר האפשרי ולחפש אוכלוסיית MV באמצעות פיזור קדימה (FSC) לעומת פיזור צד (SSC) עלילת סולם לוגריתמים. שער על אוכלוסיית MV ולהעריך את אות ניאון היסטוגרמה מקביל. </li></ol> אפיון 4. של MVS ידי מערבי סופג <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה MV ישירותחיץ תמוגה מתאים (למשל, Ripa חיץ). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקרה גלולה MV כבר resuspended ב- PBS, לדלל אותו לפחות 1: 1 חיץ תמוגה מתאים (למשל, חיץ Ripa). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קביעת ריכוז החלבון של מדגם MV, למשל, על ידי assay לורי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כן 10 - 20 מיקרוגרם של MVS ב 22.5 חיץ μL ריפה. לאחר מכן מוסיפים 7.5 חיץ טעינת 4x Laemmli μL וחום במשך 5 דקות ב 95 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגימות טען על ג&#39;ל polyacrylamide ולבצע אלקטרופורזה ו immunoblotting פי פרוטוקולים סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר העברת החלבונים על הממברנה, לבצע מכתים Ponceau כביקורת טעינה על פי פרוטוקולים סטנדרטיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום destain ב TBST במשך 5 דקות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרום בלוק למשך 30 דקות עד 1 ש &#39;ב RT BSA 5% ב TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן ראשוני על 4 מעלות צלזיוס למשך הלילה או ל -2 שעות ב RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה עם דק TBST 3 x 5.</li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדן המשני מצמידים HRP בדילול של 1: 10,000 ב 5% BSA. הערה: במקרה של אותות רקע גבוהים, להשתמש באבקת חלב במקום BSA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הממברנה עם 5 דקות 3x TBST. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתח קרום עם מגיב זיהוי ECL וכדי לזהות אותות על סרטים chemiluminescence או מערכת הדמיה chemiluminescence. הערה: כדי להפלות MVS מ Exos, חלבונים כמו טובולין, actinin-4 או mitofilin ניתן להשתמש שאמור בעיקר להיות נוכח על MVS 16,25. שים לב שרוב נוגדני tetraspanin (למשל, CD9, CD81), משמשים סמנים עבור Exos, לא לעבוד בתנאי צמצום ולכן עליו להיות מוכן במאגר טעינה הלא צמצום ואחריו חימום במשך 10 דקות ב 70 מעלות צלזיוס. </li></ol>

<ol>
	<li>Raposo, G., Stoorvogel, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+Exosomes,+microvesicles,+and+friends.">Extracellular vesicles: Exosomes, microvesicles, and friends.</a> J Cell Biol. 200 (4), 373-383 (2013).</li><li>Y&#225;&#241;ez-M&#243;, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biological+properties+of+extracellular+vesicles+and+their+physiological+functions.">Biological properties of extracellular vesicles and their physiological functions.</a> J Extracell Vesicles. 4, (2015).</li><li>Guescini, M., Genedani, S., Stocchi, V., Agnati, L. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Astrocytes+and+Glioblastoma+cells+release+exosomes+carrying+mtDNA.">Astrocytes and Glioblastoma cells release exosomes carrying mtDNA.</a> J Neural Transm (Vienna). 117 (1), 1-4 (2010).</li><li>Balaj, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+microvesicles+contain+retrotransposon+elements+and+amplified+oncogene+sequences.">Tumour microvesicles contain retrotransposon elements and amplified oncogene sequences.</a> Nat Commun. 2, 180 (2011).</li><li>Lee, T. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oncogenic+ras-driven+cancer+cell+vesiculation+leads+to+emission+of+double-stranded+DNA+capable+of+interacting+with+target+cells.">Oncogenic ras-driven cancer cell vesiculation leads to emission of double-stranded DNA capable of interacting with target cells.</a> Biochem Biophys Res Commun. 451 (2), 295-301 (2014).</li><li>Chi, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tumour+trail+left+in+blood.">The tumour trail left in blood.</a> Nature. 532 (7598), 269-271 (2016).</li><li>Pisitkun, T., Shen, R. -. F., Knepper, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+proteomic+profiling+of+exosomes+in+human+urine.">Identification and proteomic profiling of exosomes in human urine.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 101 (36), 13368-13373 (2004).</li><li>Harrington, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+morphology+and+biochemistry+of+nanostructures+provide+evidence+for+synthesis+and+signaling+functions+in+human+cerebrospinal+fluid.">The morphology and biochemistry of nanostructures provide evidence for synthesis and signaling functions in human cerebrospinal fluid.</a> Cerebrospinal Fluid Res. 6, 10 (2009).</li><li>Admyre, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+with+Immune+Modulatory+Features+Are+Present+in+Human+Breast+Milk.">Exosomes with Immune Modulatory Features Are Present in Human Breast Milk.</a> J Immunol. 179 (3), 1969-1978 (2007).</li><li>Caby, M. -. P., Lankar, D., Vincendeau-Scherrer, C., Raposo, G., Bonnerot, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomal-like+vesicles+are+present+in+human+blood+plasma.">Exosomal-like vesicles are present in human blood plasma.</a> Int Immunol. 17 (7), 879-887 (2005).</li><li>Nieuwland, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+origin+and+procoagulant+properties+of+microparticles+in+meningococcal+sepsis.">Cellular origin and procoagulant properties of microparticles in meningococcal sepsis.</a> Blood. 95 (3), 930-935 (2000).</li><li>Mfonkeu, J. B. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+Cell-Specific+Microparticles+Are+a+Biological+Marker+for+Cerebral+Dysfunctions+in+Human+Severe+Malaria.">Elevated Cell-Specific Microparticles Are a Biological Marker for Cerebral Dysfunctions in Human Severe Malaria.</a> PLoS One. 5 (10), e13415 (2010).</li><li>Parker, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Suppression+of+inflammation+reduces+endothelial+microparticles+in+active+systemic+lupus+erythematosus.">Suppression of inflammation reduces endothelial microparticles in active systemic lupus erythematosus.</a> Ann Rheum Dis. 73 (6), 1144-1150 (2014).</li><li>Nozaki, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+value+of+endothelial+microparticles+in+patients+with+heart+failure.">Prognostic value of endothelial microparticles in patients with heart failure.</a> Eur J Heart Fail. 12 (11), 1223-1228 (2010).</li><li>Galindo-Hernandez, O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+concentration+of+microvesicles+isolated+from+peripheral+blood+in+breast+cancer+patients.">Elevated concentration of microvesicles isolated from peripheral blood in breast cancer patients.</a> Arch Med Res. 44 (3), 208-214 (2013).</li><li>Menck, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor-derived+microvesicles+mediate+human+breast+cancer+invasion+through+differentially+glycosylated+EMMPRIN.">Tumor-derived microvesicles mediate human breast cancer invasion through differentially glycosylated EMMPRIN.</a> J Mol Cell Biol. 7 (2), 143-153 (2015).</li><li>Moon, P. -. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Developmental+Endothelial+Locus-1+on+Circulating+Extracellular+Vesicles+as+a+Novel+Biomarker+for+Early+Breast+Cancer+Detection.">Identification of Developmental Endothelial Locus-1 on Circulating Extracellular Vesicles as a Novel Biomarker for Early Breast Cancer Detection.</a> Clin Cancer Res. 22 (7), 1757-1766 (2016).</li><li>Melo, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glypican-1+identifies+cancer+exosomes+and+detects+early+pancreatic+cancer.">Glypican-1 identifies cancer exosomes and detects early pancreatic cancer.</a> Nature. 523 (7559), 177-182 (2015).</li><li>Kahlert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Double-stranded+Genomic+DNA+Spanning+All+Chromosomes+with+Mutated+KRAS+and+p53+DNA+in+the+Serum+Exosomes+of+Patients+with+Pancreatic+Cancer.">Identification of Double-stranded Genomic DNA Spanning All Chromosomes with Mutated KRAS and p53 DNA in the Serum Exosomes of Patients with Pancreatic Cancer.</a> J Biol Chem. 289 (7), 3869-3875 (2014).</li><li>Shao, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+typing+of+circulating+microvesicles+allows+real-time+monitoring+of+glioblastoma+therapy.">Protein typing of circulating microvesicles allows real-time monitoring of glioblastoma therapy.</a> Nat Med. 18 (12), 1835-1840 (2012).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes.">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J Vis Exp. (59), (2012).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracell Vesicles. 2, (2013).</li><li>Gustafson, C. M., Shepherd, A. J., Miller, V. M., Jayachandran, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Age-+and+sex-specific+differences+in+blood-borne+microvesicles+from+apparently+healthy+humans.">Age- and sex-specific differences in blood-borne microvesicles from apparently healthy humans.</a> Biol Sex Differ. 6, (2015).</li><li>Shelke, G. V., L&#228;sser, C., Gho, Y. S., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Importance+of+exosome+depletion+protocols+to+eliminate+functional+and+RNA-containing+extracellular+vesicles+from+fetal+bovine+serum.">Importance of exosome depletion protocols to eliminate functional and RNA-containing extracellular vesicles from fetal bovine serum.</a> J Extracell Vesicles. 3, (2014).</li><li>Kowal, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomic+comparison+defines+novel+markers+to+characterize+heterogeneous+populations+of+extracellular+vesicle+subtypes.">Proteomic comparison defines novel markers to characterize heterogeneous populations of extracellular vesicle subtypes.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 113 (8), E968-E977 (2016).</li><li>Dignat-George, F., Boulanger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Many+Faces+of+Endothelial+Microparticles.">The Many Faces of Endothelial Microparticles.</a> Arterioscler Thromb Vasc Biol. 31 (1), 27-33 (2011).</li><li>Esser, M. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+Incorporation+of+CD45,+CD80+(B7-1),+CD86+(B7-2),+and+Major+Histocompatibility+Complex+Class+I+and+II+Molecules+into+Human+Immunodeficiency+Virus+Type+1+Virions+and+Microvesicles:+Implications+for+Viral+Pathogenesis+and+Immune+Regulation.">Differential Incorporation of CD45, CD80 (B7-1), CD86 (B7-2), and Major Histocompatibility Complex Class I and II Molecules into Human Immunodeficiency Virus Type 1 Virions and Microvesicles: Implications for Viral Pathogenesis and Immune Regulation.</a> J Virol. 75 (13), 6173-6182 (2001).</li><li>Canellini, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Red+blood+cell+microparticles+and+blood+group+antigens:+an+analysis+by+flow+cytometry.">Red blood cell microparticles and blood group antigens: an analysis by flow cytometry.</a> Blood Transfus. 10 (2), s39-s45 (2012).</li><li>Scholz, T., Temmler, U., Krause, S., Heptinstall, S., L&#246;sche, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transfer+of+tissue+factor+from+platelets+to+monocytes:+role+of+platelet-derived+microvesicles+and+CD62P.">Transfer of tissue factor from platelets to monocytes: role of platelet-derived microvesicles and CD62P.</a> Thromb Haemost. 88 (6), 1033-1038 (2002).</li><li>Berckmans, R. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-derived+microparticles+circulate+in+healthy+humans+and+support+low+grade+thrombin+generation.">Cell-derived microparticles circulate in healthy humans and support low grade thrombin generation.</a> Thromb Haemost. 85 (4), 639-646 (2001).</li><li>Rupp, A. -. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Loss+of+EpCAM+expression+in+breast+cancer+derived+serum+exosomes:+role+of+proteolytic+cleavage.">Loss of EpCAM expression in breast cancer derived serum exosomes: role of proteolytic cleavage.</a> Gynecol Oncol. 122 (2), 437-446 (2011).</li><li>Taylor, D. D., Gercel-Taylor, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA+signatures+of+tumor-derived+exosomes+as+diagnostic+biomarkers+of+ovarian+cancer.">MicroRNA signatures of tumor-derived exosomes as diagnostic biomarkers of ovarian cancer.</a> Gynecol Oncol. 110 (1), 13-21 (2008).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

<html> מחקרים שנעשו לאחרונה על כלי רכב חשמליים בדם הוכיחו כי הרכב וספירת EV להשתנות במהלך הגורם מספר מחלות. לכן, הניתוח ואפיון נוסף של כלי הרכב חשמליים האלה הם של ריבית גבוהה עוד יותר להעריך פוטנציאל השימוש שלהם כסמנים ביולוגיים המחלה לאבחון ופרוגנוזה או להעריך תגובות טיפול. הפרוטוקול אנו מציגים כאן מאפשר בידוד של שלפוחית ​​בקוטר של עד 600 ננומטר אשר אינם כוללים כל האברונים בתא. תצפיות אלו עולים בקנה אחד עם ההגדרה הנוכחית של MVS ואינן כוללות נוכחות של גופים אפופטוטיים 2. שימוש המערבי סופג, הצלחנו להוכיח כי MVS מבודדים להראות ביטוי גבוה של טובולין, בעוד tetraspanins CD9 ו- CD81 המשמשים לעתים קרובות כסמנים Exo היו רק מעט לידי ביטוי. זו מאשרת כי MVS נבדל Exos ומתאים לאפיון מעמיק האחרון והשוואה של שתי אוכלוסיות EV ידי פרוטאומיקה 25. תוכן &quot;&gt; במהלך הרכישה של דגימות דם, חשוב לשמור את הזמן בין venipuncture והכין פלזמה קצרה ככל האפשר על מנת למנוע הידרדרות MV. יתר על כן, אחסון ממושך של דגימות דם יכול להוביל ההפעלה של תאי דם גורמת MV משופרת משיל ובסופו של הדבר אפופטוזיס אשר גורם לשחרור של גופים אפופטוטיים. שיקול חשוב נוסף עבור בידוד MV הוא למנוע זיהומים של הכנות MV עם חלבוני פלזמה או Exos הקטן. לכן, חשוב להסיר כמה שיותר supernatant ככל האפשר לאחר שצנח MVS ב g 14,000 x. מאחר הגלולה גלויה כרגיל במהודק אל הקיר של הצינור, supernatant ניתן להסיר בקלות עם קצה פיפטה. בניגוד Exos אשר נוטה ליצור אגרגטים במהלך ההכנה ידי ultracentrifugation במהירות גבוהה לעתים קרובות קשה resuspend, בעיה זו אינה מתרחשת עם MVS. המחקר שלנו מראה שזה possible לאפיין תת-אוכלוסיות MV נוכח הדם על ידי cytometry הזרימה. למרות גבול הגילוי של cytometers הזרימה ביותר הוא סביב 200 - 300 ננומטר, MVS נמדד reproducibly ב תורם וכן דגימות תרבית תאים עם אותם הפרמטרים של ניתוח והשערים שאפשרו ההבחנה שלהם בבירור מפני אותות רקע. חשוב לוודא לפני המדידות כי PBS המשמש בניתוחים אינו מכיל חלקיקים מזהמים שעלולים לגרום רקע גבוה במהלך cytometry זרימה (איור 3). למרות שחלק MVS קטן אולי לא ליפול בפח גישה תזרים cytometric, זיהינו MVS מכל אוכלוסיות תאים הדם הגדולים (למשל, טסיות, תאי דם אדומים, כדוריות דם לבנות, תאי אנדותל). בניתוחים שלנו השתמשנו סמנים סטנדרטיים עבור תאי הדם השונים אשר כבר נמצאו בעבר על MVS 26 - 29. יצוין כי על מנת להשיג את התוצאות הטובות ביותר על ידי זרימת cytometry, tהוא להסתכם וריכוז כל הנוגדנים יש טיטרציה על מדגם MV לבטא את האנטיגן של עניין. אם תת-אוכלוסיות MV ספציפיות בדם תזוהינה עם ייחוד גבוה, ניתן לבצע צביעה כפולה כנגד שני אנטיגנים שונים המצויים על גבי MVS בהתאמה ורק לשקול כל MVS הכפול החיובי לאחר מנתח 23. נכון לעכשיו, יש מאמצים כדי להגדיר טווח רמה תת-אוכלוסיות MV בדם של אנשים בריאים 23,30. מחקרים אלה הראו כבר כי MVS-derived טסיות מהווים את האוכלוסייה הגדולה ביותר של MVS בדם שנמצא התכתבות עם התצפיות שלנו. אחד יתרונות של cytometry זרימה לאפיין דגימות MV שהשיטה הזאת היא הוקמה כבר היטב למטרות אבחון ברוב מרכזי הקלינית אשר תאפשרנה את השימוש האפשרי של MVS כסמנים ביולוגיים אבחון קליני יומיומי. מחקרים קודמים על כלי רכב חשמליים בדם אשר יש בעיקר להתמקדאד על Exos הקטן, להסתמך על נהלים ספציפיים מיון או לנתח את אוכלוסיית יעד Exo הרצויה סלקטיבי 31,32 או דורש זמן רב (2 ימים) תהליך בידוד עם צימוד של Exos לטקס חרוזים לפני ניתוח 18. התצפיות לא פורסמו שלנו מראות כי ניתוח התזרים cytometric של MVS מן הכנות דם כולו ואף מאפשר זיהוי של MVS כגון MVS נגזרות גידול ללא כל תהליכי מיון כזה. יחדיו, הפרוטוקול המובא כאן מאפשר הבידוד המהיר של MVS מדגים דם היקפי עם ציוד מעבדה סטנדרטי והאפיון הבא שלהם באמצעות cytometry זרימה ו מערבי סופג. התהליך כולו יכול להתבצע סביב 2 שעות אשר יקל במחקרים עתידיים על פרופילים MV ב &#39;הדם החולים נדרשים להעריך את הפוטנציאל של MVS כסמנים ביולוגיים למחלה.

בשנים האחרונות רבים במבחנה הוכיח כי שלפוחית תאית (EVS) ממלא תפקיד חשוב בתקשורת בין תאית. תאים חיים לשפוך כל הזמן שלפוחית ​​אשר שונים בגודלם, תוכן biogenesis. כלי הרכב החשמליים למדו הטוב ביותר הם exosomes שמקורם במערכת endosomal שבו הם מאוחסנים כמו שלפוחית ​​intraluminal בגופי multivesicular. לאחר הפתיל האחרון עם קרום הפלזמה, השלפוחית הכלולה משתחררת כמו exosomes (Exos, בקוטר 30 - 100 ננומטר 1). אוכלוסייה שנייה של EV אשר צבר תשומת לב גוברת בשנים האחרונות הם microvesicles גדול (MVS, בקוטר 100 - 1,000 ננומטר) אשר יוצאים מגוף ישירות מן קרום הפלזמה 2. שני סוגים של שלפוחית מוקפי bilayer שומנים ומכילים חומצות גרעין, למשל, דנ&quot;א, רנ&quot;א שליח או מירנה 3 - 5, וכן שפע של חלבונים אשר הם יכולים להעביר ג שכנהאמות. בעוד בכלל רכב החלבון של השלפוחית משקף את מצב התא ממוצא, כמה חלבונים נראים ממוקדים סלקטיבי מועשר ב -1 EVS. אינטרס מחקר עיקרי הוא לאפיין כלי רכב חשמליים מתאיים נורמלית וחולה על מנת להגדיר חתימות EV ספציפיות עלולים לאפשר את השימוש של כלי רכב חשמלי כסמנים ביולוגיים רומן. במיוחד בסרטן, שבו לעתים קרובות בגידול עצמו אינו נגיש בקלות, ביופסיות נוזלות מיקוד מכוניות חשמליים-גידולים ספציפיים בדם עשויות לאפשר ניטור של תגובות לטיפול או לעזור המאפיינות את הגידול הראשוני ללא צורך הליכים פולשניים 6. ואכן, EVS כבר בודדו בהצלחה נוזלים שונים בגוף, כולל שתן 7, CSF 8, השד חלב 9 או דם 10. מספר מחקרים זיהו שינויים במצבת EV וקומפוזיצית מחל אנושיות שונות. לדוגמא, בחולי אלח דם במספר MVS פרו-קרישה הואהגדיל משמעותית לעומת אנשים בריאים 11. גם בחולים עם מלריה מוחין חמור עלייה MVS הכולל בדם ניתן לצפות וספירות של MVS-derived טסיות לתאם עם תרדמת עומק תרומבוציטופניה 12. מחקרים אחרים מדווחים על מספרים גבוהים של שלפוחית נגזרות האנדותל בחולים עם זאבת אדמנתית מערכתית או אי ספיקת לב, ובמקרה של האחרון, זה עולה בקנה אחד עם הסתברות גבוהה יותר של אירועים קרדיווסקולריים 13,14. במיוחד בסרטן, EVS בדם נדון כעת כסמנים ביולוגיים רומן עם ערך דיאגנוסטיים ופרוגנוסטיים. רמות של MVS לבטא חלבוני גידולים הקשורים כגון MUC1, EGFR או FAK נראות מורמות בדמם של חולי סרטן השד 15,16. גם עבור Exos, מחקרים שנעשו לאחרונה הראו כי Exos דם הנגזרות נושאת אנטיגנים ספציפיים הגידול כגון Glypican-1 לסרטן הלבלב או דל-1 לסרטן השד לאפשר דה המחלה בשלב מוקדםtection עם גבוהה סגולית ורגישה 17,18. בנוסף, הגידול הנגזרות בסרום Exos עשוי להכיל DNA אשר ניתן להשתמש בהם לצורך זיהוי של מוטציות כגון KRAS ו- p53 אשר מצביע על השימוש שלהם על מנת לבצע חיזוי טיפול 19. ההתקדמות שחלה באחרונה הראו כי ניתוח של Exos בדם של חולי גליובלסטומה באמצעות שבב microfluidic ספציפי המאפשר ניטור של טיפול 20. יחדיו, ממצאים אלה מרמזים כי ניתוח של תת-אוכלוסיות ספציפיות מחלות של שלפוחית ​​נותן מידע רב ערך על האבחנה, הפרוגנוזה, כמו גם אפשרויות טיפוליות והצלחה. עם זאת, בידוד וניתוח Exos מדם הוא גוזל זמן, דורש ציוד מעבדה מיוחד ולכן הוא עדיין לא מתאים לאבחון קליני שיגרתי. לעומת זאת, MVS ניתן לבודד הרבה יותר מהר, בשל גודלן, ניתן לנתח בקלות על ידי cytometry זרימה ללא הצורך להזדווג להם חרוזי לטקס כפי שהוא הכרחי Exos 18, 21. לכן, כאן אנו מציגים פרוטוקול שיכול לשמש עבור הבידוד הסטנדרטי של MVS מדגימה דם ואת האפיון הבא של תת-אוכלוסיות MV ידי cytometry זרימה. פרוטוקול זה יאפשר מחקר נוסף ובאפיון עומק פרופילים MV בקבוצות גדולות של מטופלים אשר יידרש על מנת להשתמש MVS לדיאגנוסטיקה רפואית היומיום.

<table><tbody><tr><td>butterfly needle (21 gauge)</td><td>Hospira Deutschland GmbH</td><td>490P29201</td><td></td></tr><tr><td>Bovine serum albumin Fraction V</td><td>Roth</td><td>8076.3</td><td>For 10x TBS weigh 24.2 g Tris base and 80 g NaCl, ad 1 L H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and adjust pH to 7.6</td></tr><tr><td colspan="4">For 1x TBS-T mix 100 mL 10x TBS with 900 mL H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O and add 1 mL Tween-20</td></tr><tr><td>CD235a-PE</td><td>Beckman Coulter</td><td>A07792</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD45-FITC</td><td>Beckman Coulter</td><td>7782</td><td>use 5 &amp;micro;l for staining</td></tr><tr><td>CD62E-PE</td><td>Biolegend</td><td>336008</td><td>use 0.8 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD62P-PE</td><td>Biolegend</td><td>304905</td><td>use 0.1 &amp;micro;g for staining</td></tr><tr><td>CD81 antibody</td><td>Biolegend</td><td>349501</td><td>1:2,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>CD9 antibody</td><td>Immunotools</td><td>21270091</td><td>1:1,000 in 5% BSA in TBS-T; use non-reducing conditions for Western Blotting</td></tr><tr><td>Chemiluminescence imager ImageQuant LAS-4000</td><td>Fujitsu Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DC protein assay kit II</td><td>Bio-Rad</td><td>5000112</td><td></td></tr><tr><td>ECL detection reagent</td><td>GE Healthcare</td><td>RPN2232</td><td></td></tr><tr><td>EDTA vacutainers for blood collection</td><td>Sarstedt</td><td>01.1605.001</td><td></td></tr><tr><td>FACSCanto II</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>fetal calf serum (FCS)</td><td>Invitrogen</td><td>10091148</td><td>heat-inactivated (30 min, 56 &amp;deg;C)</td></tr><tr><td>filter 0.22 &amp;micro;m</td><td>Sarstedt</td><td>83.1826.001</td><td></td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-mouse secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2005</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>HRP-coupled anti-rabbit secondary antibody</td><td>santa cruz</td><td>sc-2004</td><td>use 1:10,000 in 5% milk powder in TBS-T</td></tr><tr><td>4x Laemmli loading buffer, Roti-Load 1</td><td>Roth</td><td>K929.1</td><td></td></tr><tr><td>microfuge SIGMA 1-15K</td><td>Sigma Laborzentrifugen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>milk powder (Blotting-Grade Blocker, nonfat dry milk)</td><td>BioRad</td><td>170-6404</td><td></td></tr><tr><td>multifuge 3 L-R</td><td>Heraeus</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NanoSight LM10</td><td>NanoSight Ltd.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>PBS, w/o Ca and Mg</td><td>Pan biotech</td><td>P04-36500</td><td></td></tr><tr><td>perfusor syringe 50 mL</td><td>Braun</td><td>8728844F</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau-S staining solution</td><td>PanReac AppliChem</td><td>A2935,0500</td><td></td></tr><tr><td>rotor Sw32.1 Ti for ultracentrifugation (6 x 17 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>rotor TLA-120.2 for ultracentrifugation (10 x 1.5 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>tubes for flow cytometry (5 mL, round-bottom)</td><td>BD Biosciences</td><td>352054</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (15 mL)</td><td>Beckman Coulter</td><td>344061</td><td></td></tr><tr><td>tubes for ultracentrifugation (11* 34 mm)</td><td>Beckman Coulter</td><td>343778</td><td></td></tr><tr><td>Tubulin antibody</td><td>Millipore</td><td>05-829</td><td>1:5,000 in 5%BSA in TBST</td></tr><tr><td>ultracentrifuge Optima L-80 XP</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ultracentrifuge TL-100</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>valve filter Seraplas V15</td><td>Sarstedt</td><td>53,428</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation and characterization of microvesicles from peripheral blood

שחרור השלפוחית ​​התאית (EVS) כולל exosomes נגזר endosomal הקטן (Exos, קוטר &lt;100 ננומטר) microvesicles נגזרות הממברנה פלזמה גדולה (MVS, בקוטר&gt; 100 ננומטר) הוא תהליך הסלולר בסיסי המתרחש בכל תאי החיים. חלבוני תחבורת שלפוחית אלה, שומני גרעין חומצות ספציפיים תא מוצאם במבחנה הדגישו את חשיבותם כמתווכים של תקשורת בין תאית. מכוניות חשמליות היו מבודדות בהצלחת נוזלי גוף שונים ובעיקר כלי רכב חשמליים בדם זוהו מבטיח סמנים לסרטן או מחלות זיהומיות. על מנת לאפשר את הלימוד תת-אוכלוסיות MV בדם, אנו מציגים פרוטוקול עבור הבידוד הסטנדרטי והאפיון של MVS מדגים דם היקפי. MVS הם pelleted ממדגמים פלזמה anticoagulated EDTA על ידי צנטריפוגה ההפרש ובדרך כלל בעל קוטר של 100 - 600 ננומטר. בשל הגודל הגדול שלהם, הם יכוליםבקלות להיחקר על ידי cytometry זרימה, טכניקה המשמשת באופן שיגרתי לדיאגנוסטיקה רפואית זמינה ברוב המעבדות. כמה דוגמאות עבור מבחני בקרת איכות של MVS מבודד תינתן וסמנים שיכולים לשמש אפליית subpopulations MV שונים בדם יוצגו.

על מנת לכמת את התשואה של MVS כי ניתן לבודד בעקבות הפרוטוקול המתואר, חישבנו את כמות MVS מבודד דגימות דם של 10 תורמים. התשואה MV, אשר הוערכה ב assay חלבון לורי, נע בין 10 עד 30 מיקרוגרם עם ממוצע של 19.2 מיקרוגרם MVS לכל מ&quot;ל דם (טבלה 1). ריכוז החלקיקים שנקבעו על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיקים (נ.ת.ע) נע בין 1.66 x 10 9 כדי 2.36 x 10 10 עם ממוצע של 5.9 x 10 9 חלקיקים לדגימה פלזמה מ&quot;ל (טבלה 2). אפיון נוסף של MVS ידי מיקרוסקופי אלקטרוני הילוכים חשף אוכלוסייה של שלפוחית עם ננומטר בקוטר&gt; 100 כי היו מוקפות bilayer שומנים ולא מכילה אברונים בתא (איור 1 א). נ.ת.ע אשר כי גודל MVS המבודד נע בין 100 עד 600 ננומטר (איור 1 ב &#39;) ואת גודל MV הממוצע היה 201ננומטר (איור 1 ג). מכתים עבור סמני MV ו Exo טיפוסיים על ידי מערבי סופג הוכיח כי MVS המבודד היו חיוביים עבור טובולין ורק הראה ביטוי קל של CD9 ו- CD81, תוך Exos היו שלילי עבור טובולין ו מועשר CD9 ו- CD81 (איור 2). הניתוח של MVS מבודד על ידי cytometry זרימה (איור 3 א) חשף אוכלוסיית שלפוחית מוגדרת שאפשר מגודרת באמצעות אותם הפרמטרים המשמשים בדרך כלל עבור MVS המבודד supernatants תרבית תאים וזה היה שונה בעליל מן אות הרקע מתקבלת על ידי מדידת PBS + 1% שלפוחית מדולדלת FCS ללא תוספת של MVS (איור 3 ב). על מנת לנתח את אוכלוסיות MV השונות נוכח דם, MVS הוכתם סמנים הוקמו עבור אוכלוסיות תאי דם השונות, למשל, CD62P עבור MVS מטסיות CD45 עבור MVS הנגזרות לויקוציטים, CD235a עבורדם אדום תא נגזר MVS ו CD62E עבור MVS תא נגזרות האנדותל (איור 4). אפיון זה הראה כי אחוז subpopulations MV שונה בין דגימות דם התורם נחקר, בעוד שרוב MVS נראה להישפך על ידי טסיות כל הדגימות. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig1.jpg" /> איור 1: התפלגות גודל של MVS המבודדת מן הדם היקפי. A, MVS מבודד היו דמיינו ידי מיקרוסקופית אלקטרונים הילוכים. B, ניתוח מעקב nanoparticle הנציג (נ.ת.ע) של MVS הממחישה את התפלגות הגודל של השלפוחית. C, גודל MV הממוצע מתחייל 10 הכנות עצמאיות נמדד על ידי נ.ת.ע (ממוצע). <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55057/55057fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן על מנת לצפות אל</a>גרסת arger של נתון זה. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig2.jpg" /> איור 2: אפיון של MVS מבודדת על ידי המערב סופג. ביטוי חלבון דיפרנציאלי על MVS מבודד Exos משני תורמים היה דמיין ידי מערבי סופג. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55057/55057fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig3.jpg" /> איור 3: ניתוח של MVS ידי cytometry זרימה. A, MVS הם מדמיינים ראשונים על קדימה (FSC) לעומת sidescatter (SSC) מגרשי שער על אוכלוסיית MV בהתאמה. בהמשך לכך, MVS אלה מאופיינים עבור האנטיגן של עניין על ידי<html> באמצעות נוגדנים שכותרתו fluorescently מכוונים נגד אנטיגן. B, טיפוסית FSC לעומת מגרשים SSC עבור MVS מבודד מן הפלזמה של שני תורמים. בתור השוואה, מגרש אופייני MVS-derived תאים סרטניים מתאי סרטן ריאות A549 מבודד supernatant תרבית תאים כמו גם כביקורת שלילית רק באמצעות PBS + 1% שלפוחית ​​מדולדל FCS ללא MVS מוצגים בצד ימין. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55057/55057fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/55057/55057fig4.jpg" /> איור 4: אפיון MVS מבודד על ידי cytometry זרימה. MVS משלושה תורמים התאפיין עבור הביטוי של סמני תא הדם הוקמו (אדום) על ידי cytometry זרימה. הפקדים אלוטיפ בהתאמה מוצגים באפור.https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/55057/55057fig4large.jpg &quot;target =&quot; _ blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לִטעוֹם </td><td> MVS / מ&quot;ל דם [מיקרוגרם] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 29.4 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 10.3 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 15.2 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 31.1 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 18.8 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 22.7 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 19.1 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 18.7 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 15.0 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 11.9 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: תשואת חלבון MV מדגים דם היקפי. </strאונג &lt;גלוי היא הכמות MVS לכל דם היקפי מיליליטר, שהוצאה מסך 10 תורמים. תשואות MV כומתו על ידי assay לורי. <table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> לִטעוֹם </td><td> MVS / פלזמה מ&quot;ל [ספירת חלקיקים] </td></tr><tr><td> # 1 </td><td> 6.42E + 09 </td></tr><tr><td> # 2 </td><td> 2.36E + 10 </td></tr><tr><td> # 3 </td><td> 1.88E + 09 </td></tr><tr><td> # 4 </td><td> 6.51E + 09 </td></tr><tr><td> # 5 </td><td> 3.48E + 09 </td></tr><tr><td> # 6 </td><td> 4.57E + 09 </td></tr><tr><td> # 7 </td><td> 2.09E + 09 </td></tr><tr><td> # 8 </td><td> 1.66E + 09 </td></tr><tr><td> # 9 </td><td> 2.54E + 09 </td></tr><tr><td> # 10 </td><td> 6.20E + 09 </td></tr></tbody></table> טבלה 2: MV חלקיקי תשואה מן הדם היקפי דוגמאות. </stרונג&gt; MV בודד מדגים פלזמה של 10 תורמי מוני חלקיקים נקבעו על ידי ניתוח מעקב ננו-חלקיקים. המוצג הוא הערך הממוצע משלוש מדידות בלתי תלויות.

Watch this Scientific Journal Video about Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood at JoVE.com

Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting.

בידוד ואפיון של Microvesicles מן הדם היקפי

The release of extracellular vesicles (EVs) including small endosomal-derived exosomes (Exos, diameter &#60; 100 nm) and large plasma membrane-derived ...

isolation-and-characterization-of-microvesicles-from-peripheral-blood

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

22.9K Views.  University Medical Center Göttingen. Extracellular vesicles present in blood have been suggested as novel biomarkers for various diseases. Here, we present a protocol for the isolation of large plasma membrane-derived microvesicles from peripheral blood samples and their subsequent analysis by conventional flow cytometry and Western Blotting. 

Video: Isolation and Characterization of Microvesicles from Peripheral Blood

Rapid Fluorescence-based Characterization of Single Extracellular Vesicles in Human Blood with Nanoparticle-tracking Analysis

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released from many cell types and play a pivotal role in regulating cell-cell communication and a diverse range of biological processes. Many different methods for the characterization of EVs have been described. However, most of these methods have the disadvantage that the preparation and characterization of the samples are very time-consuming, or it is extremely difficult to analyze specific markers of interest due to their small size and due to the lack of discrete populations. While methods for analysis of EVs have been considerably improved over the last decade, there is still no standardized method for characterization of single EVs. Here, we demonstrate a semi-automated method for characterization of single EVs by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The protocol that is presented addresses the common problem of many researchers in this field and provides the complete workflow for rapid isolation of EVs and characterization with PKH67, a general cell membrane linker, as well as with specific surface markers such as CD63, CD9, vimentin, and lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP-1). The presented results show a high level of reproducibility, as confirmed by other methods, such as Western blotting. In the conducted experiments, we exclusively used EVs isolated from human serum samples, but this method is also suitable for plasma or other body fluids and can be adjusted for characterization of EVs from cell culture supernatants. Irrespective of the future progress of research on EV biology, the protocol that is presented here provides a rapid and reliable method for rapid characterization of single EVs with specific markers.

In this protocol, we describe the complete workflow for rapid isolation of extracellular vesicles from human whole blood and characterization of specific markers by fluorescence-based nanoparticle-tracking analysis. The presented results show a high level of reproducibility and can be adjusted to cell culture supernatants.

אפיון מבוסס על-ידי קרינה פלואורסצנטית מהירה של יחיד חוץ-תאית שלפוחית בדם אנושי עם ניתוח מעקב ננו-חלקיק

Extracellular vesicles (EVs), including exosomes, are specialized membranous nano-sized vesicles found in bodily fluids that are constitutively released ...

Biochemistry

Isolating Human Peripheral Blood Mononuclear Cells and CD4+ T cells from S&#233;zary Syndrome Patients for Transcriptomic Profiling

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides (MF) and S&#233;zary syndrome (SS) represent the most common subtypes. Despite a number of studies on characterizing gene expression, genetic alterations, and epigenetic abnormalities of CTCL, the molecular pathogenesis of MF/SS remains unclear. MF refers to the more common CTCL with a skin-predominance, and is usually limited to skin, whereas&#160;SS is an aggressive leukemic variant of CTCL with widespread skin involvement and is characterized by neoplastic distribution mainly involving blood, skin, and lymph node. Focusing on clinical practice, the identification of gene expression biomarkers has&#160;enormous potential to improve diagnosis and treatment of MF/SS. Indeed, recent transcriptomic studies have identified potential diagnostic biomarkers from differences in gene expression between normal and malignant T cells, which may improve our understanding of SS biology, and reveal potential therapeutic targets. This manuscript describes a detailed reproducible protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from fresh whole blood from patients diagnosed with SS, selection of CD4+ memory T cells (CD4+CD45RO+ T cells), chemical stimulation, and preparation of RNA suitable for transcriptomic profiling to discover novel prognostic molecular markers to gain additional insight in disease etiology. The stimulation using chemical agonist to activate nuclear regulation provides more specific assessment for pathways important in the dynamic transcription regulation and gene expression and eliminates confounding defects that may arise from upstream signaling defects arising from TCR antigen loss at the cell membrane. The data obtained from comparison of transcriptome of unstimulated to stimulated SS T cells unmasks functional regulatory gene expression defects not evident from analysis of quiescent unstimulated cells. Furthermore, the method outlined from this approach can be adapted for studying T cell gene expression defects in other T cell immune diseases.

We present a simple protocol for the isolation of peripheral blood mononuclear cells from whole blood obtained from patients diagnosed with S&#233;zary Syndrome, followed by selection of CD4+ T cells, their stimulation with phorbol12-myristate13-acetate and A23187 ionophore, and preparation of RNA for transcriptomic profiling.

בידוד תאים חד-גרעיניים של דם היקפי אנושי ותאי T מסוג CD4+ מחולי תסמונת סזארי לצורך פרופיל תעתיק

Cutaneous T-cell lymphomas (CTCL) are derived from the transformation and uncontrolled proliferation of mature skin-homing T cells, and mycosis fungoides ...

Cancer Research

Paper-based Devices for Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain nucleic acid and protein cargo and are increasingly recognized as a means of intercellular communication utilized by both eukaryote and prokaryote cells. However, due to their small size, current protocols for isolation of EVs are often time consuming, cumbersome, and require large sample volumes and expensive equipment, such as an ultracentrifuge. To address these limitations, we developed a paper-based immunoaffinity platform for separating subgroups of EVs that is easy, efficient, and requires sample volumes as low as 10 &#956;l. Biological samples can be pipetted directly onto paper test zones that have been chemically modified with capture molecules that have high affinity to specific EV surface markers. We validate the assay by using scanning electron microscopy (SEM), paper-based enzyme-linked immunosorbent assays (P-ELISA), and transcriptome analysis. These paper-based devices will enable the study of EVs in the clinic and the research setting to help advance our understanding of EV functions in health and disease.

This protocol details a method to isolate extracellular vesicles (EVs), small membranous particles released from cells, from as little as 10 &#956;l serum samples. This approach circumvents the need for ultracentrifugation, requires only a few minutes of assay time, and enables the isolation of EVs from samples of limited volumes.

מכשירים מבוססי נייר לבידוד ואפיון של תאית שלפוחית

Extracellular vesicles (EVs), membranous particles released from various types of cells, hold a great potential for clinical applications. They contain ...

Bioengineering

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. They are found in a number of biological fluids and are known to carry a variety of proteins, lipids, and nucleic acid molecules. Originally thought to be little more than reservoirs for cellular debris, the roles of exosomes regulating biological processes and in diseases are increasingly appreciated.
Several methods have been described for isolating exosomes from cellular culture media and biological fluids. Due to their small size and low density, differential ultracentrifugation and/or ultrafiltration are the most commonly used techniques for exosome isolation. However, plasma of HIV-1 infected individuals contains both exosomes and HIV viral particles, which are similar in size and density. Thus, efficient separation of exosomes from HIV viral particles in human plasma has been a challenge.
To address this limitation, we developed a procedure modified from Cantin et. al., 2008 for purification of exosomes from HIV particles in human plasma. Iodixanol velocity gradients were used to separate exosomes from HIV-1 particles in the plasma of HIV-1 positive individuals. Virus particles were identified by p24 ELISA. Exosomes were identified on the basis of exosome markers acetylcholinesterase (AChE), and the CD9, CD63, and CD45 antigens. Our gradient procedure yielded exosome preparations free of virus particles. The efficient purification of exosomes from human plasma enabled us to examine the content of plasma-derived exosomes and to investigate their immune modulatory potential and other biological functions.

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

Immunology and Infection

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Medicine

Isolation and Characterization of Extracellular Vesicles Produced by Iron-limited Mycobacteria

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) containing immunologically active molecules. Knowledge regarding the molecular mechanisms of vesicle biogenesis, the content of the vesicles, and their functions at the pathogen-host interface is very limited. Addressing these questions requires rigorous procedures for isolation, purification, and validation of EVs. Previously, vesicle production was found to be enhanced when M. tuberculosis was exposed to iron restriction, a condition encountered by Mtb in the host environment. Presented here is a complete and detailed protocol to isolate and purify EVs from iron-deficient mycobacteria. Quantitative and qualitative methods are applied to validate purified EVs.

Mycobacterium tuberculosis shows increased production and release of extracellular vesicles in response to low iron conditions. This work details a protocol for generating low iron conditions and methods for the purification and characterization of mycobacterial extracellular vesicles released in response to iron deficiency.

בידוד ואפיון מסחטות ושלפוחיות מתוצרת ברזל-בקטריה מוגבלת

Mycobacteria, including Mycobacterium tuberculosis (Mtb), the causative agent of human tuberculosis, naturally release extracellular vesicles (EVs) ...

Isolation of Splenic Microvesicles in a Murine Model of Intraperitoneal Bacterial Infection

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular effectors. In rats, spleen MVs (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. Previous in vitro studies demonstrated that Porphyromonas gingivalis (P. gingivalis), a major periodontal pathogen, enables&#160;the endothelial shedding and apoptosis while lipopolysaccharide (LPS) favors the shedding of splenocyte-derived microvesicles (SMVs). In vivo studies showed the feasibility of pharmacological control of SMV shedding. The present protocol establishes a standardized procedure for isolating splenic SMVs from the P. gingivalis acute murine infection model.&#160;P. gingivalis infection was induced in young C57BL/6 mice by intraperitoneal injection (three injections of 5 x 107 bacteria/week). After two weeks, the spleens were collected, weighed, and the splenocytes were counted. SMVs were isolated and quantified by protein, RNA, and prothrombinase assays. Cell viability was assessed by either propidium iodide or trypan blue exclusion dyes. Following splenocyte extraction, neutrophil counts were obtained by flow cytometry after 24 h of splenocyte culture. In P. gingivalis-injected mice, a 2.5-fold increase in spleen weight and a 2.3-fold rise in the splenocyte count were observed, while the neutrophils count was enhanced by 40-folds. The cell viability of splenocytes from P. gingivalis-injected mice ranged from 75%-96% and was decreased by 50% after 24 h of culture without any significant difference compared to unexposed controls. However, splenocytes from injected mice shed higher amounts of MVs by prothrombinase assay or protein measurements. The data demonstrate that the procoagulant SMVs are reliable tools to assess an early spleen response to intraperitoneal&#160;P. gingivalis infection.

Microvesicles shed from the plasma membrane act as cellular effectors. Spleen microvesicles (SMVs) are surrogate markers of pathophysiological conditions. In rats and mice, SMV content and properties characterize aging or inflammation and are altered by cytoprotective treatments, making them a valuable yet abundant monitoring tool for preclinical research.

Microvesicles (MVs) are submicron fragments released from the plasma membrane of activated cells that act as proinflammatory and procoagulant cellular ...

Isolation and Analysis of Traceable and Functionalized Extracellular Vesicles from the Plasma and Solid Tissues

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important players in the maintenance of organismal homeostasis and the progression of a wide spectrum of diseases. While the current research focuses on the characterization of endogenous exosomes with the endosomal origin, microvesicles blebbing from the plasma membrane have gained increasing attention in health and sickness, which are featured by an abundance of surface molecules recapitulating the membrane signature of parent cells. Here, a reproducible procedure is presented based on differential centrifugation for extracting and characterizing EVs from the plasma and solid tissues, such as the bone. The protocol further describes subsequent profiling of surface antigens and protein cargos of EVs, which are thus traceable for their derivations and identified with components related to potential function. This method will be useful for correlative, functional, and mechanistic analysis of EVs in biological, physiological, and pathological studies.

The present protocol describes a method to extract extracellular vesicles from the peripheral blood and solid tissues with subsequent profiling of surface antigens and protein cargos.

בידוד וניתוח של שלפוחיות חוץ-תאיות ניתנות למעקב ומתפקדות מהפלזמה והרקמות המוצקות

Circulating and tissue-resident extracellular vesicles (EVs) represent promising targets as novel theranostic biomarkers, and they emerge as important ...

Isolation, Characterization, and Therapeutic Application of Extracellular Vesicles from Cultured Human Mesenchymal Stem Cells

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological regulators of organismal homeostasis and important indicators of pathologies; in the meantime, their immense potential to establish accessible and controllable disease therapeutics is emerging. Mesenchymal stem cells (MSCs) can release large amounts of EVs in culture, which have shown promise to jumpstart effective tissue regeneration and facilitate extensive therapeutic applications with good scalability and reproducibility. There is a growing demand for simple and effective protocols for collecting and applying MSC-EVs. Here, a detailed protocol is provided based on differential centrifugation to isolate and characterize representative EVs from cultured human MSCs, exosomes, and microvesicles for further applications. The adaptability of this method is shown for a series of downstream approaches, such as labeling, local transplantation, and systemic injection. The implementation of this procedure will address the need for simple and reliable MSC-EVs collection and application in translational research.

The present protocol describes the differential centrifugation for isolating and characterizing representative EVs (exosomes and microvesicles) from cultured human MSCs. Further applications of these EVs are also explained in this article.

בידוד, אפיון ויישום טיפולי של שלפוחיות חוץ-תאיות מתאי גזע מזנכימליים אנושיים בתרבית

Extracellular vesicles (EVs) are heterogeneous membrane nanoparticles released by most cell types, and they are increasingly recognized as physiological ...

<meta charset="utf8"></head><body>מחקרי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים באמצעות פרוטאום שלפוחית חוץ-תאית בפלזמה

Isolation, Characterization, and Proteomic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicles for Cardiovascular Biomarker Discovery

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research due to their role in regulating intercellular communication, potentially serving as valuable biomarkers for cardiovascular disease. However, the EV proteome and its potential as a biomarker in cardiovascular diagnostics remain poorly understood. This protocol presents a standardized method for the isolation and quantification of plasma-derived EV and the analysis of their protein cargo using plasma samples from patients presenting to the Chest Pain Unit of a large university hospital. Following routine phlebotomy, EV are isolated from plasma by differential ultracentrifugation. The enrichment of specific EV marker proteins in EV isolates is visualized by immunoblotting, and average size distribution and plasma EV concentrations are quantified by nanoparticle tracking analysis. Finally, ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry is employed for label-free analysis of the EV proteome. This protocol thus provides a comprehensive approach to study and use plasma-derived EV as potential carriers of critical biological information as well as to explore their potential as novel biomarkers.

<meta charset="utf8"></head><body>זרקור המחבר: קידום הניתוח של פרוטאום שלפוחית חוץ-תאית בפלזמה למחקרי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים

This article describes a methodology for the isolation, characterization, and quantification of human plasma-derived extracellular vesicles (EV) and presents a workflow for label-free analysis of the EV proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

בידוד, אפיון וניתוח פרוטאומי של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה לגילוי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research ...