Name: isolation of exosomes from the plasma of hiv-1 positive individuals
Uploaded: 2016-01-05T15:00:01.000+00:00
Duration: 6 min 46 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals at JoVE.com

We thank the following people: Jane Chu, Cameron Tran, James Lillard, Mafuz Khan, Masebonang Albert, Ken Rogers, and Syed A. Ali. Kateena Addae-Konadu was supported by UNCF/Merck Graduate Research Fellowship, American Medical Association Foundation, CRECD Grant 8R25MD007589-10, and NIH NIGMS MBRS Grant R25 GM058268. This work was supported by NIMHD grants 8G12MD007602, and 8U54MD007588, NIAID grant 1R21AI095150-01A1, Georgia Research Alliance grant GRA.VAC08.W, and Emory CFAR grant P30 A1050409.

תרשים כללי של הליך בידוד exosome וטיהור מסופק באיור 1. שלם דם שהתקבל מתורמים מתנדבים בריאים ומאנשים עם HIV אינו מקבלים theraoy התרופתי השתתפות מרפאת התקווה של אוניברסיטת אמורי ותכנית מחלות מדבקות של מערכת בריאות גריידי באטלנטה, ג&#39;ורג&#39;יה. מחקר זה אושר על ידי לוחות הסקירה המוסדיים של אוניברסיטת אמורי ובית הספר לרפואה מורהאוס. כל האנשים שהשתתפו במחקר נתנו בכתב והסכמה מדעת. 1. הכנת Exosomes מפלסמת הדם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף דם אדם ועיבוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 10 מיליליטר של דם היקפי על ידי venipuncture בצינורות איסוף דם EDTA (המכילים אשלגן 18 מ&quot;ג EDTA), בעדינות להפוך חמש פעמים כדי לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות איסוף דם XG ב 1000 עבור 20 דקות ב RT לגלולת תאי דם. השתמש pipet סטריליte להעביר את החלק היחסי פלזמה (4-5 מיליליטר) לצינור חרוטי 25 מיליליטר. לדלל את הפלזמה עם 10 מיליליטר של 1 X PBS. בטל תאי דם (תאי דם אדום ותאים לבנים, הידוע גם בPBMC) במכל כראוי מסומן לפסולת ביולוגית מסוכנת. הערה: במקרה של דגימות דם תורם נגוע, PBMC ניתן להזמין לשימוש נוסף (ראה הליך IV.2, להלן). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחסן את דגימות הפלזמה בC o 4 לטווח קצר (2-3 ימים) או בC o -80 לאחסון לטווח ארוך יותר. הערה: תביא כל דגימות פלזמה קפוא עד 4 מעלות צלזיוס לפני עיבוד נוסף. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת שבר Exosome מפלסמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפלזמה צנטריפוגה ב 10,000 XG במשך 30 דקות ב 4 ° C כדי להסיר פסולת הסלולר. השתמש פיפטה סרולוגיות סטרילי להעביר את supernatant הפלזמה פינה לצינור ultracentrifuge 25 מיליליטר נקי. זורק את הכדור במכל Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הפלזמה פינתה ב100,000 XG במשך 2שעות על 4 מעלות צלזיוס להסרת שלפוחית ​​גדולה. הסר את supernatant 100,000 XG בקפידה על ידי pipetting, ולהשליך בפסולת ביולוגית מסוכנת. Resuspend גלולה 100,000 XG ב 1 מיליליטר של 1X PBS בצינור נקי ולדגור על RT למשך 30 דקות, בעדינות כדי לסלק מתערבל וחלקיקים נפרדים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את כדור exosome / וירוס 100,000 XG הושעה על ידי הוספת 25 מיליליטר של PBS. בעדינות להפוך את הצינור חמש פעמים כדי לערבב, אז צנטריפוגות שוב ב100,000 XG לשעה 2 ב 4 מעלות צלזיוס. מחק את הפתרון לשטוף PBS במכל הפסולת הביולוגית המסוכנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה 100,000 XG ב 1 מיליליטר של 1 X PBS לדגור על RT למשך 30 דקות מתערבלות בעדינות כדי לסלק ולפזר את גלולה. הערה: אם לא ניתן להמשיך ישירות לצעד שיפוע iodixanol, לאחסן גלולה, המכילים exosomes וחלקיקי נגיף, על 4 מעלות צלזיוס במשך 1-2 ימים עד שלב שיפוע iodixanol. </li></ol></li></ol> 2. טיהור Exosomes <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור 6% veloc -18%מילויים ity של iodixanol באמצעות מנגנון לשעבר שיפוע כפול קאמרי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות 6% ו -18% של מגיב iodixanol, מסופקים כפתרון 60% במים, על ידי דילול ב PBS. 5.5 מיליליטר pipet של פתרון 18% לתא עורר, וpipet 5.5 מיליליטר של פתרון 6% לתא המאגר. הפעל את הבוחש, פתח את השסתום, ולאפשר לכל שיפוע לזרום לתוך צינור ultracentrifuge 14 מיליליטר. הערה: או להשתמש מייד או לאחסן הדרגתיים מוכן O / N ב 4 ° C לפני שימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שכבה בזהירות 1 מיליליטר של פתרון exosome / וירוס על החלק העליון של כל שיפוע 11 מיליליטר. מילויים צנטריפוגה ב 250,000 XG לשעה 2 ב 4 ° C, באמצעות הרוטור דלי מתנדנד SW40Ti. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית עשר (12) 1.5 מיליליטר צינורות microcentrifuge. הסר 1.0 מיליליטר מהחלק העליון של השיפוע ולהעביר לצינור # 1. העבר את השברים 1ml נותרים לצינורות 2-12 בסדר רציף. הערה: כך החלק העליון יהיה מס &#39;1, החלק התחתון, # 12. רחובבצר השברים השיפוע ב 4 מעלות צלזיוס. Exosomes המטוהר, שאמורה להיות בברים 1-3 בחלק העליון של השיפוע, יציב במשך 3-4 שבועות, כאשר הם מאוחסנים על 4 מעלות צלזיוס. </li></ol></li></ol> 3. Exosome אפיון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Acetylcholinesterase Assay פעילות (AChE) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מניית מצע 100 מ&quot;מ על ידי ערבוב acetylthiocholine מ&quot;ג 28.9 יודיד ב 1 מיליליטר של 1X PBS. מניית מצע חנות ב -20 ° C עד חודש 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מניית מחוון צבע 10 מ&quot;מ על ידי הערבוב ביקרבונט 39.6mg החומצה ונתרן benzoic 15 מ&quot;ג ב 10 מיליליטר של 1X PBS. מניית חנות מחוון צבע על 4 מעלות צלזיוס עד שבועיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן מגיב assay ידי 1X PBS ערבוב, מצע, ומחוון צבע ביחס של 100: 2: 5 (לדוגמא, 10 מיליליטר 1X PBS + 200 מחוון צבע μl מצע + 500 μl). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברה 50 μl מצינור 1.5 מיליליטר שיפוע חלק (שכותרת 1-12, מIII.3 ההליך) לבארות של microtite 96-היטבצלחת r. הכן בארות כפולות עבור כל דגימת שיפוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להכין סט של סטנדרטים על ידי ביצוע מניית μU / מיליליטר AChE 2,000 הראשון בPBS. הפוך עשר (11) 2-לקפל דילולים סידוריים של מניות זה ולהוסיף 50 μl של כל דילול וליחיד של צלחת microtiter, כך ש# סטנדרטי 1 = 2,000 μU / מיליליטר, מס &#39;2 = 1,000 μU / מיליליטר, # 3 = 500 μU / מיליליטר, וכו &#39;עד # 12 = 0.98 μU / מיליליטר. שנים עשר תקני כאב ובכך יתפסו שורה אחת של צלחת assay 96-היטב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של תערובת מגיב assay לכל היטב דגירה 20 דקות (בחושך) ב RT כדי לאפשר פיתוח של מוצר תגובה בצבע. למדוד את פעילות AChE באורך גל של 450 ננומטר באמצעות קורא microplate ניאון. הערה: אחוז החומר המוצא שנותר לאחר טיהור exosome מוערך על ידי assay כאב של הפלזמה unfractionated. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ניתוח immunoblot <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חלבונים נפרדים בשברי שיפוע 1-12 (מprocedיור 2.1.3) על ידי SDS-עמוד בג&#39;לים טרומי 4-20% טריס-HCl ב100V x 1 שעות. העבר את החלבונים בג&#39;ל לקרום nitrocellulose באמצעות תא העברה סופג-אלקטרו-פי הוראות היצרן. לאפשר ההעברות למחוק ל12-16 שעות (O / N) ב350V. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסיר את הקרום מהמנגנון הסופג ולשטוף בטריס שנאגרו מלוח (TBS) במשך 5 דקות. לחסום עם 5% שומן חלב בTTBS (TBS עם 0.1% Tween 20) במשך שעה 1 על ידי טלטול על RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הממברנה עם נוגדנים ראשוניים ספציפיים לexosomes (CD9, CD45, CD63) או חלבון HIV-1 קפסיד (p24) ב 5% חלב ללא שומן עם הרעד ב 4 מעלות צלזיוס במשך 12-16 שעות (O / N). דילולים של נוגדנים עיקריים לimmunoblots נעים בין 1: 2,000 -1: 5000. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הכתם בTTBS במשך 20 דקות, ואחריו דגירה עם דילול 1: 2,000 של peroxidase חזרת (HRP) -conjugated לאנטי-IgG (נוגדנים משני), 5% חלב ללא שומן לשעה 1 ב RT. לשטוף את הכתם 3 פעמים עם TTBS, 10 דקות לכל לשטוף. </li><li&gt; דגירה הכתם עם מגיב מצע לומינול לפי הוראות היצרן, כדי ליצור אות chemiluminescent מהחלבונים שכותרת HRP זיהוי אות chemiluminescent באמצעות מערכת הדמיה אלקטרונית עם מצלמת CCD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את התמונות כקבצי TIFF שניתן לראות ב- Adobe Photoshop. ביצוע ניתוח צפיפות של להקות באמצעות תוכנת ImageJ (המכון הלאומי לבריאות, Bethesda, MD). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Assay ציטוקין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני assay ציטוקינים, לשבש מתחמים חיסוניים שהם בדרך כלל נוכחים בפלזמה אנושית על ידי ניתוק חומצה וlyse exosomes על ידי טיפול חומר ניקוי. Assay שני דגימות הפלזמה מתחילות והכנות exosome מטוהרות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפלזמה אנושית 100 μl להוסיף 100 μl 0.33 N HCL ולדגור על 37 מעלות צלזיוס במשך שעה 1. הוספת 100 μl 0.33 N NaOH לנטרל פלזמה שטופלה חומצה. להוסיף דגימות שתי פלזמה מנוטרלת וexosome המטוהר לTriton X-100, לFiריכוז סופי של 1%, לגרום תמוגה של exosomes. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור assay זה (הליך המבוסס על חרוז ניאון), משתמשים בחרוזים מגנטיים מראש מצופים בנוגדנים על ידי היצרן. השתמש בלוח מעוצב מותאם אישית של חרוזים מצופים נוגדן ציטוקינים אנטי-אנושיים; מפורט בטבלה 1. ורטקס חרוזים מגנטיים מצופה נוגדן מערכת assay ציטוקינים למשך 30 שניות ולהוסיף 50 חרוזים μl היטב בכל צלחת 96-היטב לשימוש בassay. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן סדרת דילול של סטנדרטים במאגר סטנדרטי פלזמה (שני כלולים בערכת assay ציטוקינים) כפי שמתוארת במדריך הוראות לערכת assay ציטוקינים, כדי ליצור עקומת סטנדרט 8 נקודות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 μl של חיץ לשטוף 1X (מערכה) היטב כל אחד ולשטוף את החרוזים באמצעות מכונת כביסה חרוז מגנטית, כפי שמתואר במדריך. הוסף 25 חיץ assay μl הפלזמה (מערכה) היטב כל אחד. הוסף 25 μl של סטנדרטים ודוגמאות לכל הבארות בשימוש assay. הוסף 25 μl של פלזמהמאגר מדגם לבארות שליטה שליליות. לאטום ולנער את הצלחת ב 700 סל&quot;ד במשך 60 דקות ב RT ודגירת O / N ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 150 μl של חיץ לשטוף 1X היטב כל אחד ולשטוף את הצלחת (כמו בשלב 3.3.4, לעיל). הוסף 25 μl של נוגדני זיהוי לכל טוב, חותם ולנער את הצלחת ב 700 סל&quot;ד במשך 30 דקות ב RT. חזור על שלב הכביסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 μl של פתרון streptavidin (SAPE, מערכה) לכל אחד גם, חותם ולנער את הצלחת ב 700 סל&quot;ד במשך 30 דקות ב RT. שוטף צלחת חזור כמו ב3.3.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 120 μl של חיץ קריאה (מערכה) לכל היטב ולנער על שייקר שולחן מעבדה ב 700 סל&quot;ד במשך 5 דקות ב RT כדי לאפשר את אות הניאון לפתח. קראו צלחת על קורא הצלחת לפי הוראות היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להסביר את כמות exosomes איבד במהלך הליך הבידוד, להשתמש במשוואה הבאה: [(מקורי קריאה / נפח פלזמה) x 66.6 = קריאת ציטוקינים הותאמה]. </li></ol></li></ol> 4. Assay עבור פוטנציאל מערכת חיסוני <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכנת תרבות בינונית עם סרום שור עוברי מדולדל-Exosome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה 500 מיליליטר של סרום שור עוברי (FBS) ב100,000 XG במשך 20 שעות ב 4 ° C עד גלולה זיהום exosomes וmicrovesicles. מוציא בזהירות ולשמור את supernatant FBS המדולדל exosome. זורק את הכדור בפסולת הביולוגית המסוכנת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב 20% מsupernatant FBS המדולדל exosome עם 500 מיליליטר של רוזוול פרק זיכרון מכון 1640 (RPMI 1640) בינונית. סינון הבינוני דרך פילטר קרום 0.45 מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף סטרפטומיצין (100 U / ml), פניצילין (100 U / ml), L- גלוטמין (2 מ&quot;מ), תמיסת מלח HEPES שנאגר (10 מיקרומטר), ו- IL-2 (20 U / ml) למדיום המסונן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבית תאים וחשיפת Exosome <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשוף exosomes לתאי תורם היקפיים mononuclear הדם (PBMC) מתקבלים ממתנדבי מרפאת בריאים. להשעות PBMC בהכין מדיום התרבות ולספור את התאים באמצעות דלפק תא / חלקיקים (על פי השיטה סטנדרטית של היצרן). הערה: PBMC מתקבל במהלך תקופת הכנת הפלזמה שתוארה לעיל (שלב 1.2). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מדיום מוכן מהליך 4.1.3 שיתוף תרבות, 3.0 x 10 6 (PBMC) עם 1 מיקרוגרם / מיליליטר של exosomes אספו משלושה (3) HIV-1 נגוע מחשבה או משלושה (3) HIV-1 אנשים seronegative בסך הכל נפח של 1 מיליליטר בבארות של צלחת 12 גם תרבות (עם מכסה). דגירה תרבויות במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תרבויות שלא טופלו PBMC ותרבויות שטופלו בconcanavalin (קון; 5 מיקרוגרם / מיליליטר) לשרת בקרות שליליות וחיוביות כ, בהתאמה, כפי שתואר לעיל (4.2.2). דגירה כל תרבויות PBMC במשך 48 שעות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד לפני קצירת התאים, להכין דילולים של הנוגדנים הבאים fluorochrome מצומדות חד שבטיים: אלקסה פלואוריד 700 שכותרתו אנטי-CD3 (1: 400 דילול), allophycocyעאנין (APC) / cyanine 7 (Cy7) -labeled אנטי CD4 (1: 400), peridinin חלבון כלורופיל אנטי CD4 (1: 400) שכותרתו מורכבת, שכותרתו V450 אנטי CD8 (1: 400), biotin- כותרתו אנטי-CD45RA (1: 1000), Phycoerythrin (PE) / Cy7 שכותרתו אנטי-CD62L (1: 1000), PE / cyanine 5 (Cy5) -labeled אנטי-CD38 (1: 200), PE-טקסס אדומית אנטי-streptavidin שכותרתו (1: 2000), ושליטה שכותרתו Cy5 PE / העכבר IgG1K אלוטיפ (1: 200). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תקופת הדגירה 48 שעות, לקצור את PBMC. לשטוף PBMC בPBS להסיר exosomes ולהכתים את התאים על ידי דגירה של 1 שעות ב 4 ° C עם נוגדנים מתויג fluorochrome בודדים. נתח את PBMC המוכתם על ידי cytometry זרימה לכמת את הביטוי של כמוקינים (כמתואר 21). </li></ol></li></ol>

<ol>
	<li>Joint United Nations Programme on HIV/AIDS(UNAIDS). <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> UNAIDS Report on the Global AIDS Epidemic. , (2013).</li><li>Levacher, M., Hulstaert, F., Tallet, S., Ullery, S., Pocidalo, J. J., Bach, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+significance+of+activation+markers+on+CD8+lymphocytes+in+human+immunodeficiency+syndrome:+staging+and+prognostic+value.">The significance of activation markers on CD8 lymphocytes in human immunodeficiency syndrome: staging and prognostic value.</a> Clin Exp Immun. 90, 376-382 (1992).</li><li>Giorgi, J. V., Liu, Z., Hultin, L. E., Cumberland, W. G., Hennessey, K., Detels, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+levels+of+CD38++CD8++T+cells+in+HIV+infection+add+to+the+prognostic+value+of+low+CD4++T+cell+levels:+results+of+6+years+of+follow-up.+The+Los+Angeles+Center,+Multicenter+AIDS+Cohort+Study.">Elevated levels of CD38+ CD8+ T cells in HIV infection add to the prognostic value of low CD4+ T cell levels: results of 6 years of follow-up. The Los Angeles Center, Multicenter AIDS Cohort Study.</a> J Acq Immun Def Synd. 6, 904-912 (1993).</li><li>Bofill, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Increased+numbers+of+primed+activated+CD8+CD38+CD45RO++T+cells+predict+the+decline+of+CD4++T+cells+in+HIV-1-infected+patients.">Increased numbers of primed activated CD8+CD38+CD45RO+ T cells predict the decline of CD4+ T cells in HIV-1-infected patients.</a> AIDS. 10, 827-834 (1996).</li><li>Liu, Z., Cumberland, W. G., Hultin, L. E., Prince, H. E., Detels, R., Giorgi, J. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Elevated+CD38+antigen+expression+on+CD8++T+cells+is+a+stronger+marker+for+the+risk+of+chronic+HIV+disease+progression+to+AIDS+and+death+in+the+Multicenter+AIDS+Cohort+Study+than+CD4++cell+count,+soluble+immune+activation+markers,+or+combinations+of+HLA-DR+and+CD38+expression.">Elevated CD38 antigen expression on CD8+ T cells is a stronger marker for the risk of chronic HIV disease progression to AIDS and death in the Multicenter AIDS Cohort Study than CD4+ cell count, soluble immune activation markers, or combinations of HLA-DR and CD38 expression.</a> J Acq Immun Def Synd. 16, 83-92 (1997).</li><li>Douek, D. C., Roederer, M., Koup, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Emerging+concepts+in+the+immunopathogenesis+of+AIDS.">Emerging concepts in the immunopathogenesis of AIDS.</a> Annu Rev Med. 60, 471-484 (2009).</li><li>Roberts, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasma+cytokine+levels+during+acute+HIV-1+infection+predict+HIV+disease+progression.">Plasma cytokine levels during acute HIV-1 infection predict HIV disease progression.</a> AIDS. 24, 819-831 (2010).</li><li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interleukin-15+increases+effector+memory+CD8++T+cells+and+NK+Cells+in+simian+immunodeficiency+virus-infected+macaques.">Interleukin-15 increases effector memory CD8+ T cells and NK Cells in simian immunodeficiency virus-infected macaques.</a> J Virol. 79, 4877-4885 (2005).</li><li>Picker, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+induces+CD4+effector+memory+T+cell+production+and+tissue+emigration+in+nonhuman+primates.">IL-15 induces CD4 effector memory T cell production and tissue emigration in nonhuman primates.</a> J Clin Invest. 116, 1514-1524 (2006).</li><li>Mueller, Y. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=IL-15+treatment+during+acute+simian+immunodeficiency+virus+(SIV)+infection+increases+viral+set+point+and+accelerates+disease+progression+despite+the+induction+of+stronger+SIV-specific+CD8++T+cell+responses.">IL-15 treatment during acute simian immunodeficiency virus (SIV) infection increases viral set point and accelerates disease progression despite the induction of stronger SIV-specific CD8+ T cell responses.</a> J Immunol. 180, 350-360 (2008).</li><li>O'Brien, M., Manches, O., Bhardwaj, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plasmacytoid+dendritic+cells+in+HIV+infection.">Plasmacytoid dendritic cells in HIV infection.</a> Adv Exp Med Biol. 762, 71-107 (2013).</li><li>Chihara, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+proteins+preferentially+activate+anti-inflammatory+M2-type+macrophages.">HIV-1 proteins preferentially activate anti-inflammatory M2-type macrophages.</a> J Immunol. 188, 3620-3627 (2012).</li><li>Johnstone, R. M., Adam, M., Hammond, J. R., Orr, L., Turbide, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vesicle+formation+during+reticulocyte+maturation.">Vesicle formation during reticulocyte maturation.</a> J Bio Chem. 262, 9412-9420 (1987).</li><li>Meckes Jr, D. G., Raab-Traub, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microvesicles+and+viral+infection.">Microvesicles and viral infection.</a> J. Virol. 85, 12844-12854 (2011).</li><li>Campbell, T. D., Khan, M., Huang, M. B., Bond, V. C., Powell, M. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV-1+Nef+protein+is+secreted+into+vesicles+that+can+fuse+with+target+cells+and+virions.">HIV-1 Nef protein is secreted into vesicles that can fuse with target cells and virions.</a> Ethn. Dis. 18 (2 Suppl 2), S2-S9 (2008).</li><li>Muratori, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Massive+Secretion+by+T+Cells+Is+Caused+by+HIV+Nef+in+Infected+Cells+and+by+Nef+Transfer+to+Bystander+Cells.">Massive Secretion by T Cells Is Caused by HIV Nef in Infected Cells and by Nef Transfer to Bystander Cells.</a> Cell Host. Microbe. 6, 218-230 (2009).</li><li>Lenassi, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Nef+is+Secreted+in+Exosomes+and+Triggers+Apoptosis+in+Bystander+CD4+T+Cells.">HIV Nef is Secreted in Exosomes and Triggers Apoptosis in Bystander CD4 T Cells.</a> Traffic. 11, 110-122 (2009).</li><li>Raymond, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HIV+Type+1+Nef+Is+Released+from+Infected+Cells+in+CD45++Microvesicles+and+Is+Present+in+the+Plasma+of+HIV-Infected+Individuals.">HIV Type 1 Nef Is Released from Infected Cells in CD45+ Microvesicles and Is Present in the Plasma of HIV-Infected Individuals.</a> AIDS Res Hum Retrovir. 27, 167-178 (2011).</li><li>James, C. O., Huang, M. B., Khan, M., Garcia-Barrio, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Nef+Protein+Targets+CD4++T+Cells+for+Apoptosis+by+Interacting+with+CXCR4+Surface+Receptors.">Extracellular Nef Protein Targets CD4+ T Cells for Apoptosis by Interacting with CXCR4 Surface Receptors.</a> Journal of Virology. 78, 3099-3109 (2004).</li><li>Huang, M. B., Jin, L. L., James, C. O., Khan, M., Powell, M. D., Bond, V. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+of+Nef-CXCR4+Interactions+Important+for+Apoptosis+Induction.">Characterization of Nef-CXCR4 Interactions Important for Apoptosis Induction.</a> Journal of Virology. 78, 11084-11096 (2004).</li><li>Konadu, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Association+of+cytokines+with+exosomes+in+the+plasma+of+HIV-1-seropositive+individuals.">Association of cytokines with exosomes in the plasma of HIV-1-seropositive individuals.</a> Journal of Infectious Diseases. , (2014).</li><li>Cantin, R., Diou, J., Belanger, D., Tremblay, A. M., Gilbert, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discrimination+between+exosomes+and+HIV-1:+purification+of+both+vesicles+from+cell-free+supernatants.">Discrimination between exosomes and HIV-1: purification of both vesicles from cell-free supernatants.</a> J Immunol Methods. 338, 21-30 (2008).</li><li>Witwer, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+of+sample+collection,+isolation+and+analysis+methods+in+extracellular+vesicle+research.">Standardization of sample collection, isolation and analysis methods in extracellular vesicle research.</a> J Extracellular Vesicles. 2, 20360 (2013).</li><li>L&#228;sser, C., Eldh, M., L&#246;tvall, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+Characterization+of+RNA-Containing+Exosomes.">Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (59), e3037 (2012).</li><li>McDonald, M. K., Capasso, K. E., Ajit, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purification+and+microRNA+Profiling+of+Exosomes+Derived+from+Blood+and+Culture+Media.">Purification and microRNA Profiling of Exosomes Derived from Blood and Culture Media.</a> J. Vis. Exp. (76), e50294 (2013).</li><li>Kanchi Ravi, R., Khosroheidari, M., DiStefano, J. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Modified+Precipitation+Method+to+Isolate+Urinary+Exosomes.">A Modified Precipitation Method to Isolate Urinary Exosomes.</a> J. Vis. Exp. (95), e51158 (2015).</li><li>L&#246;tvall, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Minimal+experimental+requirements+for+definition+of+extracellular+vesicles+and+their+functions:+a+position+statement+from+the+International+Society+for+Extracellular+Vesicles.">Minimal experimental requirements for definition of extracellular vesicles and their functions: a position statement from the International Society for Extracellular Vesicles.</a> J Extracell Vesicles. 3, 26913 (2014).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

הפעלה כרונית חיסונית (CIA) ודלדול של תאי CD4 + שני סימני ההיכר חשובים של זיהום HIV-1. הם הוקמו כמנבאים לפתוגנזה, עם ה- CIA להיות המנבא הטוב ביותר. עם זאת, מנגנוני נהיגה הפעלה כרונית מערכתית חיסונית וירידה של תאי CD4 + עדיין לא הובהרו במלואו. אנחנו ומעבדות אחרות פיתחנו ראיות מוצקות שexosomes מופרש מHIV-1 תאים נגועים לשחק תפקיד בשני סימני ההיכר. העניין המתמשך בשני ההרכב והתפקוד של שלפוחית ​​תאית הוביל לפרסום של שיטות שונות לבידוד exosome משתי תקשורת תרבית התאים ונוזלים ביולוגיים 24-26. עם זאת, מכשול לחקירת תפקידו של exosomes בפתוגנזה HIV-1 היה ההפרדה היעילה של exosomes מHIV-1 חלקיקים תוך השמירה על היכולת לחקור שני תוכן exosome ופעילות פונקציונלית. פיתחנו פרוטוCOL לטיהור exosomes מHIV-1 חלקיקים בפלזמה אנושית, תוך ניצול מהירות הדרגתיים iodixanol. תורמי הנישאים HIV ששמשו במחקר זה לא קיבלו טיפול תרופתי ודגימות פלזמה המשמשות לניסויים אלה הכילו בין 1500 ל -400,000 חלקיקי וירוס / מ&quot;ל עם ממוצע של 206,000 חלקיקי וירוס / מיליליטר 21. לפיכך, אנו מראים כי exosomes בפלזמה של HIV-1 אנשים נגועים ניתן להפריד ביעילות מחלקיקי נגיף HIV-1, גם כאשר עומסי הווירוס הם גבוהים. למרות שדומה בגודל ובצפיפות, exosomes הפרדה בצפיפות נמוכה / השברים העליונים של מילויים iodixanol בהשוואה לחלקיקים נגיפיים, שהופרדו בצפיפות הגבוהה / נמוכים שברים. Exosomes שהוכן על ידי שיטת שיפוע iodixanol הם מטוהרים ונקיים מזיהום חלבונים תאיים מאוד. טוהר האוכלוסייה המבודדת exosomes אושר באמצעות p24 ELISA וניתוח כתם מערבי לחלבון p24 קפסיד HIV-1כמו גם ניתוח מערבי לסמני exosomal, כאב, CD9, CD45, CD63 ו. שימוש בסמנים אלה עולים בקנה אחד עם הנחיות שפורסמו לאחרונה לזיהוי exosome 27. יותר רלוונטי מבחינה פיזיולוגית להפעלה חיסונית, exosomes המטוהר מHIV-1 אנשים נגועים נמצא מכיל ציטוקינים / כמוקינים בריכוזים גבוהים יותר באופן משמעותי מexosomes מHIV-1 בקרות seronegative. יתר על כן, exosomes מHIV-1 אנשים נגועים היו פעיל מבחינה ביולוגית, המציג את יכולתו להשפיע על רמות מוגברות של סמן ההפעלה, CD38, על פני השטח של תאי זיכרון נאיבי ומרכזי מסוג CD4 + CD8 + T ו. באופן קולקטיבי, נתונים אלה מצביעים על מנגנון שיכול לנהוג הפעלה חיסונית מתמשכת במהלך ההדבקה ב- HIV. התוצאות היינו יכול להשיג באמצעות התהליך שלנו exosome טיהור, המשלב צנטריפוגה ההפרש והפרדת שיפוע מהירות iodixanol להראות את הערךשל שימוש exosomes נקי במיוחד עבור bioassays הפיזיולוגי והתפקודי. ההליך זה יש חסרונות ומגבלות מסוימים. כמות ניכרת של exosomes, לעתים קרובות רוב החומר המוצא כפי שמחושב על ידי מדידות של פעילות AChE, הולכת לאיבוד בתהליך. בנוסף, ההליך הוא גם זמן רב ודורש גישה לציוד יקר. לבסוף, הדור של מילויים iodixanol באמצעות מנגנון פרומר השיפוע דורש תרגול רב כדי להבטיח שחזור. שיטה חלופית לדור שיפוע יכולה להיות להכין סדרה מדורגת של פתרונות iodixanol, ואחריו שכבות זהירות של הפתרונות לצינורות צנטריפוגה ודוגר O / N כדי לאפשר הדרגתיים ליצירת. עם זאת, אנחנו לא צריכים לבדוק חלופה זו. פרוטוקול הניסוי המתואר כאן לבידוד והפרדה של exosomes מHIV-1 חלקיקים בפלזמה אנושית הוא שיטה יעילה כדי להבטיח את טוהר לשעברosomes. שימוש בשיטה זו הובילה לאפיקים מרגשים לחקירה עתידית בנוגע לתפקידו של exosomes בפתוגנזה HIV-1 ויכול באותה מידה להיות בשימוש בפניות לתהליכים ביולוגיים אחרים.

מגיפת HIV-1 ממשיכה להשפיע באופן משמעותי בכל העולם. נכון לשנת 2013, כ -35 מיליון אנשים ברחבי העולם חיים עם HIV, ו -2.1 מיליון מהם היו אנשים נגועים חדש 1. אסטרטגיות מניעה וגישה משופרת לטיפול התרופתי היו מועילות בהפחתת הרכישה הכוללת של HIV. עם זאת, אוכלוסיות בודדות עדיין חווים עליות ברכישת 1 HIV. לפיכך, יש צורך במאמצים המשיכו לטפל במגיפה זו. אחד המנבאים החזקים ביותר להתקדמות המחלה HIV הוא הפעלה חיסונית כרונית (CIA) 2-10. שהוגדר על ידי רמות גבוהות של ציטוקינים בהתמדה לזיהוי סמני ביטוי גבוהים על פני השטח של לימפוציטים מסוג T, ה- CIA יוחס ל: i) ייצור תאים דנדריטים רציף של סוג אני IFN 11; (Ii) הפעלה חיסונית ישירה מונעת על ידי חלבוני HIV טאט, Nef וgp120 12; (Iiiטרנסלוקציה) של חלבונים חיידקיים בתאי מערכת חיסון במעיים הקשורים 6. עם זאת, המנגנון המדויק (ים) כרוני, הפעלה חיסונית מערכתית בהידבקות ב- HIV להישאר להיות הובהר במלואו. קבוצת המחקר שלנו ואחרים הוכיחו תפקיד של exosomes בפתוגנזה של HIV 15-18. הקבוצה שלנו קבעה כי חלבון Nef מופרש מהתאים נגועים בexosomes 15, וexosomal Nef (exNef) נמצא בפלזמה של אנשים שנדבקו ב- HIV ברמות ננוגרם 18. הראינו עובר אורח שCD4 + T-תאים שנחשפו לexNef הסתיימו במוות תא מושרה הפעלה תלויה במסלול CXCR4 19, 20. לחלופין, מונוציטים / מקרופאגים היו עקשן לאפופטוזיס המושרה exNef, אבל הצגתי פונקציות סלולריות שינו וביטוי ציטוקינים. exosomes לאחרונה, הקבוצה שלנו הראתה מבודד מהפלזמה של אנשים שנדבקו ב- HIV מכיל מגוון של ציטוקינים פרו-דלקתיים. פוrther, תאי mononuclear נאיביים דם היקפי נחשפו לexosomes המופק מפלזמה מחולים נגועים באיידס נגרמים ביטוי של CD38 על תאי זיכרון נאיבי ומרכזי מסוג CD4 + CD8 + T ו. זה סביר תורם לדלקת מערכתית והתפשטות נגיפית באמצעות תא עובר אורח הפעלה 21, ומצביע על כך שexosomes לשחק תפקיד משמעותי בפתוגנזה HIV. בחקירת תפקידו של exosomes בפתוגנזה HIV, אתגר אחד הוא פיתוח טכניקות לexosomes יעילות נפרדת מחלקיקי HIV תוך שמירה על תוכן exosomal כמו גם יכולת modulatory התפקודית החיסונית. כמה שיטות שתוארו לבידוד exosomes מתרבית תאים ונוזלים ביולוגיים 22,23. בגלל גודלם הקטן והצפיפות נמוכה (exosomes לצוף בצפיפות של 1.15-1.19 g / מיליליטר), ultracentrifugation ההפרש ו / או אולטרה הן הטכניקות הנפוצות ביותר לבידוד exosome 23.עם זאת, supernatants תרבית תאים נגוע ב- HIV והפלזמה של החולים מכילים את שני exosomes וHIV-1 חלקיקים נגיפיים. Exosomes וHIV-1 חלקיקים דומים מאוד בגודל וצפיפות. לחלופין, לנצל את הביטוי של סמני exosomal ייחודיים כגון CD63, CD45, CD81 ו, exosomes היה מבודד בשיטות לכידה immunoaffinity 23. הליך זה יכול להפריד בין וירוס מexosomes. עם זאת, החסרון של שיטה זו הוא הקובץ המצורף ההדוק של נוגדנים לexosomes המטוהר, אשר יכול להפריע להערכת הפוטנציאל של המערכת החיסונית exosomes בתרבות. כדי לטפל במגבלות אלה, פיתחנו הליך טיהור exosomes מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית שונה מCantin ועמיתים לעבודה באמצעות 22 הדרגתיים מהירות iodixanol. Exosomes נמצא להפריד בצפיפות נמוכה / שברים העליונים של מילויים iodixanol, ואילו חלקיקי נגיף הפרדה בגבוהצפיפות / שברים נמוכים יותר. חלקיקי נגיף זוהו על ידי p24 ELISA וexosomes זוהו באמצעות סמני exosome AChE, CD9, CD63, CD45 ו. שברים בצפיפות נמוכה העליונים נאספו הכילו exosomes שהיו שליליים לזיהום p24 HIV-1. הטיהור וההפרדה היעילה של exosomes מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית מאפשרת בדיקה מדויקת של התוכן של exosomes נגזר מפלסמה אנושית, כמו גם החקירה של פוטנציאל modulatory החיסון שלהם וערך האבחון ופרוגנוסטיים של exosomes בפתוגנזה של HIV-1.

<table><tbody><tr><td>BD Vacutainer EDTA tubes (10ml)&amp;nbsp;</td><td>Becton Dickinson</td><td>368589</td><td>pink top tubes</td></tr><tr><td>Lymphoprep Ficoll reagent</td><td>Cosmo Bio</td><td>AXS-1114545</td><td></td></tr><tr><td>Optiprep iodixanol reagent</td><td>Sigma</td><td>D1556</td><td></td></tr><tr><td>14ml ultracentrifuge tubes</td><td>Beckman Coulter</td><td>344060</td><td>ultraclear tubes</td></tr><tr><td>Gradient Former Model 485</td><td>BIO-RAD</td><td>165-4120</td><td></td></tr><tr><td>Acetylthiocholine iodide</td><td>Sigma</td><td>1480</td><td></td></tr><tr><td>Benzoic Acid</td><td>Sigma</td><td>D8130</td><td></td></tr><tr><td>Sodium Bicarbonate</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td></td></tr><tr><td>Acetyl Cholinesterase</td><td>Sigma</td><td>C3389</td><td></td></tr><tr><td>96-well clear microtiter plate</td><td>Medical Supply Partners</td><td>TR5003</td><td></td></tr><tr><td>SpectraMax 190 microplate reader</td><td>Molecular Devices</td><td>190</td><td>Fluorescent plate reader</td></tr><tr><td>Criterion Gel Electrophoresis Cell</td><td>BIO-RAD</td><td>165-6001</td><td></td></tr><tr><td>Transblot Gel&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-3910</td><td></td></tr><tr><td>Transfer Cell</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl Criterion precast gels</td><td>BIO-RAD</td><td>567-1093</td><td></td></tr><tr><td>Anti-CD45 antibody&amp;nbsp;</td><td>Abcam&amp;nbsp;</td><td>Ab10558</td><td></td></tr><tr><td>CD63 Antibody (H-193)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-15363</td><td></td></tr><tr><td>CD9 Antibody (H-110)</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-9148</td><td></td></tr><tr><td>Rabbit pAb p24 HIV-1&amp;nbsp;</td><td>ImmunoDX, LLC</td><td>1303</td><td></td></tr><tr><td>Nitrocellulose membrane&amp;nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>G1472430</td><td></td></tr><tr><td>Tris Buffered Saline</td><td>BIO-RAD</td><td>170-6435</td><td></td></tr><tr><td>HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>31460</td><td>Goat-Anti-Rabbit</td></tr><tr><td>HRP-conjugated IgG (H+L) secondary antibody</td><td>Thermo Scientific</td><td>31430</td><td>Goat-Anti-Mouse</td></tr><tr><td>Western Blotting Luminol Reagent</td><td>Santa Cruz Biotech, Inc.</td><td>SC-2048</td><td></td></tr><tr><td>GE LAS-4010 Imager</td><td>GE Healthcare</td><td>LAS-4010</td><td></td></tr><tr><td>Human Procarta Cytokine Immunoassay Kit</td><td>Affymetrix&amp;nbsp;</td><td>N/A</td><td>Custom immunoassay panel</td></tr><tr><td>Bio-Plex 200 Immunobead Reader</td><td>BIO-RAD</td><td>171-000201</td><td></td></tr><tr><td>Coulter Z2 Particle Counter</td><td>Beckman Coulter</td><td>383552</td><td>Cell counter</td></tr><tr><td>Alexa Fluor 700-labeled anti-CD3</td><td>BD Bioscience (UCHT1)</td><td>300424</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled anti-CD4</td><td>Biolegend (OKT4)</td><td>317418</td><td></td></tr><tr><td>PerCP-labeled anti-CD4</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>550631</td><td></td></tr><tr><td>V450-labeled anti-CD8</td><td>BD Bioscience (RPA-T8)</td><td>560347</td><td></td></tr><tr><td>Biotin-labeled anti-CD45RA</td><td>BD Bioscience (HI100)</td><td>555487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy7-labeled anti-CD62L</td><td>Biolegend (DREG-56)</td><td>304822</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-labeled anti-CD38</td><td>Biolegend (HIT2)</td><td>303508</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled anti-HLADR</td><td>Biolegend (L243)</td><td>307618</td><td></td></tr><tr><td>PE-Texas Red-labeled anti-streptavidin</td><td>BD Bioscience</td><td>551487</td><td></td></tr><tr><td>PE/Cy5-labeled mouse IgG1K</td><td>Biolegend (MOPC-21)</td><td>400116</td><td></td></tr><tr><td>APC/Cy7-labeled mouse IgG2aK</td><td>Biolegend (MOPC-173)</td><td>400229</td><td></td></tr></tbody></table>

isolation of exosomes from the plasma of hiv-1 positive individuals

Exosomes הוא שלפוחית ​​קטנה החל בגודל 30 ננומטר ל -100 ננומטר שפורסמו constitutively והן על גירוי ממגוון רחב של סוגי תאים. הם נמצאים במספר הנוזלים ביולוגיים וידועים לבצע מגוון רחב של חלבונים, שומנים, ומולקולות של חומצות גרעין. חשב במקור להיות קצת יותר ממאגרים לסלולריים פסולת, את התפקידים של exosomes ויסות תהליכים ביולוגיים ובמחלות מוערכות יותר ויותר. כמה שיטות שתוארו לבידוד exosomes מתקשורת והתרבות התאית ונוזלים ביולוגיים. בשל גודלם הקטן וצפיפות נמוכה, ultracentrifugation ההפרש ו / או אולטרה הן הטכניקות הנפוצות ביותר לבידוד exosome. עם זאת, פלזמה של HIV-1 אנשים נגועים מכילה שני exosomes וחלקיקים נגיפיים HIV, אשר דומה בגודל ובצפיפות. כך, הפרדה יעילה של exosomes מחלקיקים נגיפיים HIV בפלזמה אנושית הייתהאתגר. כדי לטפל במגבלה זו, פיתחנו הליך שונה מCantin et. al., 2008 לטיהור exosomes מחלקיקי HIV בפלזמה אנושית. מילויים מהירות iodixanol שמשו להפרדת exosomes מHIV-1 חלקיקים בפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים. חלקיקי נגיף זוהו על ידי p24 ELISA. Exosomes זוהו על בסיס acetylcholinesterase סמני exosome (AChE), ואנטיגנים CD9, CD63, CD45 ו. הליך השיפוע שלנו הניב הכנות exosome חופשיות של חלקיקי נגיף. הטיהור היעילה של exosomes מפלסמה אנושית אפשרה לנו לבחון את התוכן של exosomes המופק מפלזמה ולחקור את הפוטנציאל שלהם חיסוני modulatory ופונקציות ביולוגיות אחרות.

Exosomes הם מטוהרים ביעילות מHIV-1 בפלזמה אנושית חיובית. Exosomes מבודד שנוצר על ידי acetylcholinesterase פעילות (AChE), הפרדה בשברי צפיפות נמוכה 1-3 בחלק העליון של מילויים iodixanol, ואילו חלקיקי נגיף שנוצר על ידי p24 אנטיגן-1 HIV , הפרדה בשברים גבוהה יותר בצפיפות (10-12, קרוב לתחתית). הנוכחות של exosomes אושרה עוד יותר על ידי זיהוי immunoblot של סמני exosome AChE, CD9, CD45, CD63 ו, ועל ידי מיקרוסקופי אלקטרונים (איור 2). ציטוקינים וכמוקינים פרו-דלקתיים המשויכים וגבוהים באופן משמעותי בexosomes של HIV-1 אנשים נגועים מחשבה. exosomes מזוקק ופלזמה unfractionated מHIV-1 נגוע וHIV-1 אנשים seronegative נותחו במשך 21 ציטוקינים / כמוקינים ידי assay זמנית. כל 21 ציטוקינים / הכימותרפיה<html> kines אותר בexosomes מבודד מHIV-1 אנשים חיוביים. בנוסף, הרמות שלהם היו גבוהות באופן משמעותי בהשוואה לפלזמה וexosomes מHIV-1 בקרות seronegative (טבלת 1). ביטוי CD38 הוגדל על פני השטח של תאים שנחשפו לexosomes מHIV-1 אנשים נגועים מחשבה. PBMCs מתורמים אנושיים נגוע נחשף במשך 48 שעות לexosomes אספו מHIV-1 נגוע מחשבה או יחידים seronegative והעריך לרמות של CD38 סמן הפעלה ב CD4 + CD8 + ותאי T באמצעות cytometry זרימה. הבחנו כי על ידי 48 שעות לאחר חשיפה, ביטוי CD38 על פני השטח של זיכרון נאיבי ומרכזי תאי CD4 + וCD8 + T היו גבוהים באופן משמעותי בתאי T נחשפו לexosomes מHIV-1 אנשים חיוביים בהשוואה לטיפול exosome נישאי HIV ולא טופל בקרות (איור 3). בתוך עמודים = &quot;1&quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53495/53495fig1.jpg" /> איור 1. ייצוג סכמטי של בידוד exosome מHIV-1 בפלזמה אנושית חיובית. () 10 מיליליטר של דם היקפי נאסף מseropositve HIV-1 ואנשי seronegative. צינורות איסוף דם EDTA (ב) היו centrifuged XG ב 1000 עבור 20 דקות ב RT. פלזמה (C) פרודה הועברה 50 מיליליטר צינורות חרוטי ומדולל ½ עם 1x PBS ו( ד) centrifuged 10,000 XG למשך 30 דקות. (ה) supernatant הועבר לultracentrifuge צינורות ו( F) centrifuged על 10,000 XG לשעה 2. (G, H) supernatant הושלך וגלול exosome מחדש תלוי ורחץ ב 1 מיליליטר של 1X PBS. (אני) בעקבות צנטריפוגה, supernatant הושלך וגלול מחדש תלוי 1ml 1x PBS ומעולף על 6-18% שיפוע מהירות iodixanol ו( J) centrifuged ב250,000 XG לשעה 2. (K) בעקבות צנטריפוגה, 1 מיליליטר שברים מלמעלה למטה של ​​השיפוע היו transferred לצינורות 1.5 מיליליטר ונותח לתוכן AChE וניתוח immunoblot. ברים (L) 2 ו- 3 היו יותר בשילוב ובדילול מלא עם 4 מיליליטר של 1X PBS ו( M) centrifuged ב400,000 XG לשעה 2. (N) בעקבות צנטריפוגה, supernatant הושלך וגלול מחדש תלוי 1 מיליליטר של 1X PBS לניתוח ביטוי ציטוקינים וchemokine פרו-דלקתי. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53495/53495fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53495/53495fig2.jpg" /> Exosomes 2. איור הם מטוהרים ביעילות מפלסמה אנושית. שברים שיפוע מהירות iodixanol פרט מאנשים HIV-נגועים מחשבה או seronegative היו נתונים ל() assay האנזימטית לacetylcholinesterase (AChE), ו- (ב) ניתוח כתם מערבי לסמני exosomal CD9, CD45, וCD63 וp24 הנגיפי החלבון והיו (C) immunolabeled עם אנטי CD63 ובדק עם מיקרוסקופ אלקטרונים כדי לאשר הכנת exosomes מטוהר (C). (איור מKonadu אל et 2014 21, בשימוש על ידי רשות). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53495/53495fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53495/53495fig3.jpg" /> איור 3. Assay עבור פוטנציאל מערכת חיסוני. PBMCs מHIV-1 האנשים seronegative נחשפו לשני exosomes אספו מפלסמה של נגוע מחשבת HIV-1 (HIV + Exo) או seronegative אנשים (HIV- Exo), אינו מטופל, או שטופלו ב5 מיקרוגרם / מיליליטר של concanavalin (קון) כביקורת חיובית. לאחר 48 שעות חשיפה, נאיבי (CD45RA + / CD62L +), מרכזי (TCM; CD45RA- / CD62L +) ומפעיל (TEM; CD45RA- / CD62L-) זיכרון מסוג CD4 + ו CD8 + תאי T נותחו לביטוי CD38 ידי cytometry זרימה. ריכוז Exosome היה מנורמל על ידי חלבון כולל והוסיף ב1 מיקרוגרם / מיליליטר. ברים שגיאה מייצגים ממוצע +/- SEM של שישה תורמים עצמאיים. הבדל בין הקבוצות נבדק למובהקות סטטיסטיות על ידי מבחן ANOVA דרך אחת. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001, **** p &lt;0.0001. (איור מאל ואח Konadu 2014 21,, בשימוש על ידי רשות). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53495/53495fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="שולחן 1" src="/files/ftp_upload/53495/53495table1.jpg" /> שולחן ניתוח 1. של exosomes מטוהר וכל פלזמה מנגועה מחשבת HIV-1 ואנשים seronegative לציטוקינים פרו-דלקתיים וביטוי chemokine. </strong&gt; Exosomes מטוהרים מנגועים מחשבה HIV-1 או יחידים seronegative נותח לציטוקינים פרו-דלקתיים וביטוי chemokine. כל 21 ציטוקינים פרו-דלקתי וכמוקינים נמדדו היו קשורים עם והיו גבוהים באופן משמעותי בexosomes של HIV-1 אנשים נגועים מחשבת השוואה לקבוצת ביקורת seronegative. בנוסף, IL-1 א, IFNa2, וCXCL10 היו גבוה באופן משמעותי בפלסמת unfractionated של HIV-1 אנשים נגועים מחשבת השוואה לקבוצת ביקורת seronegative. הבדל בין הקבוצות נבדק למובהקות סטטיסטיות על ידי מבחן U מאן-וויטני. * P &lt;0.05, ** p &lt;0.01, *** p &lt;0.001, **** p &lt;0.0001. (איור מKonadu אל et 2014 21, בשימוש על ידי רשות). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53495/53495table1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals at JoVE.com

בידוד של אקסוזומים מהפלזמה של אנשים חיוביים ל-HIV-1 | אינמונולוגיה וזיהום | וִידֵאוֹ

Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

בידוד של Exosomes מהפלזמה של HIV-1 אנשים חיוביים

Exosomes are small vesicles ranging in size from 30 nm to 100 nm that are released both constitutively and upon stimulation from a variety of cell types. ...

isolation-of-exosomes-from-the-plasma-of-hiv-1-positive-individuals

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Immunology and Infection

Cellular Processes

Cell Structure and Function

SCIENTISTS IN ACTION

17.3K Views.  Morehouse School of Medicine. Techniques describing a gradient procedure to separate exosomes from human immunodeficiency virus (HIV) particles are described. This procedure was used to isolate exosomes away from HIV particles in human plasma from HIV-infected individuals. The isolated exosomes were analyzed for cytokine/chemokine content.

Video: Isolation of Exosomes from the Plasma of HIV-1 Positive Individuals

Isolation of High-density Lipoproteins for Non-coding Small RNA Quantification

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most interestingly, sRNAs are also found outside of cells and are stably present in all biological fluids. As such, extracellular sRNAs represent a novel class of disease biomarkers and are likely involved in cell signaling and intercellular communication networks. To assess their potential as biomarkers, sRNAs can be quantified in plasma, urine, and other fluids. Nevertheless, to fully understand the impact of extracellular sRNAs as endocrine signals, it is important to determine which carriers are transporting and protecting them in biological fluids (e.g., plasma), which cells and tissues contribute to extracellular sRNA pools, and cells and tissues capable of accepting and utilizing extracellular sRNA. To accomplish these goals, it is critical to isolate highly pure populations of extracellular carriers for sRNA profiling and quantification. We have previously demonstrated that lipoproteins, particularly high-density lipoproteins (HDL), transport functional microRNAs (miRNA) between cells and HDL-miRNAs are significantly altered in disease. Here, we detail a new protocol that utilizes tandem HDL isolation with density-gradient ultracentrifugation (DGUC) and fast-protein-liquid chromatography (FPLC) to obtain highly pure HDL for downstream profiling and quantification of all sRNAs, including miRNAs, using both high-throughput sequencing and real-time PCR approaches. This protocol will be a valuable resource for the investigation of sRNAs on HDL.

This protocol describes the isolation and quantification of high-density lipoprotein small RNAs.

בידוד של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה עבור Non-קידוד RNA קטנים כימות

The diversity of small non-coding RNAs (sRNA) is rapidly expanding and their roles in biological processes, including gene regulation, are emerging. Most ...

Biochemistry

Protein Digestion, Ultrafiltration, and Size Exclusion Chromatography to Optimize the Isolation of Exosomes from Human Blood Plasma and Serum

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and RNAs, are unique to the cells from which they are derived and can be used as indicators of disease. Several common enrichment protocols, including ultracentrifugation, yield exosomes laden with soluble protein contaminants. Specifically, we have found that the most abundant proteins within blood often co-purify with exosomes and can confound downstream proteomic studies, thwarting the identification of low abundance biomarker candidates. Of additional concern is irreproducibility of exosome protein quantification due to inconsistent representation of non-exosomal protein levels. The protocol detailed here was developed to remove non-exosomal proteins that co-purify along with exosomes, adding rigor to the exosome purification process. Five methods were compared using paired blood plasma and serum from five donors. Analysis using nanoparticle tracking analysis and micro bicinchoninic acid protein assay revealed that a combined protocol utilizing ultrafiltration and size exclusion chromatography yielded the optimal vesicle enrichment and soluble protein removal. Western blotting was used to verify that the expected abundant blood proteins, including albumin and apolipoproteins, were depleted.

Here, we present a protocol to purify exosomes from both plasma and serum with reduced co-purification of non-exosomal blood proteins. The optimized protocol includes ultrafiltration, protease treatment, and size exclusion chromatography. Enhanced purification of exosomes benefits downstream analyses, including more accurate quantification of vesicles and proteomic characterization.

עיכול חלבון אולטראפילטרציה, גודל אי-הכללה של כרומטוגרפיה כדי למטב את ניתוקה של Exosomes פלזמה דם אנושי, סרום

Exosomes, a type of nanovesicle released from all cell types, can be isolated from any bodily fluid. The contents of exosomes, including proteins and ...

SILAC Based Proteomic Characterization of Exosomes from HIV-1 Infected Cells

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can characterize thousands of proteins at a time. These powerful techniques allow us to have a systemic understanding of cellular changes, especially when cells are subjected to various stimuli, such as infections, stresses, and specific test conditions. Even with recent developments, analyzing the exosomal proteome is time-consuming and often involves complex methodologies. In addition, the resultant large dataset often needs robust and streamlined analysis in order for researchers to perform further downstream studies. Here, we describe a SILAC-based protocol for characterizing the exosomal proteome when cells are infected with HIV-1. The method is based on simple isotope labeling, isolation of exosomes from differentially labeled cells, and mass spectrometry analysis. This is followed by detailed data mining and bioinformatics analysis of the proteomic hits. The resultant datasets and candidates are easy to understand and often offer a wealth of information that is useful for downstream analysis. This protocol is applicable to other subcellular compartments and a wide range of test conditions.

Here, we describe a quantitative proteomics method using the technique of stable isotope labeling by amino acids in cell culture (SILAC) to analyze the effects of HIV-1 infection on host exosomal proteomes. This protocol can be easily adapted to cells under different stress or infection conditions.

אפיון proteomic SILAC מבוסס של Exosomes מ- HIV-1 תאים נגועים

Proteomics is the large-scale analysis of proteins. Proteomic techniques, such as liquid chromatography tandem mass spectroscopy (LC-MS/MS), can ...

Isolation and Profiling of MicroRNA-containing Exosomes from Human Bile

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic uses.
Exosomes have recently been shown to contain microRNAs (miRs). MiRs themselves have arisen as valuable biomarkers for diagnostic purposes. As specimen collection in clinics and hospitals is quite variable, miRNA isolation from whole bile varies substantially. To achieve robust, accurate and reproducible miRNA profiles from collected bile samples in a simple manner required the development of a high-quality protocol to isolate and characterize exosomes from bile. The method requires several centrifugations and a filtration step with a final ultracentrifugation step to pellet the isolated exosomes. Electron microscopy, Western blots, flow cytometry and multi-parameter nanoparticle optical analysis, where available, are crucial characterization steps to validate the quality of the exosomes. For the isolation of miRNA from these exosomes, spiking the lysate with a non-specific, synthetic miRNA from a species like Caenorhabditis elegans, i.e., Cel-miR-39, is important for normalization of RNA extraction efficiency. The isolation of exosome from bile fluid following this method allows the successful miRNA profiling from bile samples stored for several years at -80 &#176;C.

Bile fluid is a valuable source of extracellular vesicles/exosomes that contain potentially important biomarkers. This protocol represents a robust method to isolate exosomes from human bile for further analyses including miRNA profiling.

בידוד Profiling של MicroRNA המכיל Exosomes מן האדם מר

Exosome research in the last three years has greatly extended the scope towards identification and characterization of biomarkers and their therapeutic ...

Medicine

Isolation and Characterization of RNA-Containing Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of endocytic origin were first proposed to function as a way for reticulocytes to eradicate the transferrin receptor while maturing into erythrocytes1, and were later named exosomes. Exosomes are formed by inward budding of late endosomes, producing multivesicular bodies (MVBs), and are released into the environment by fusion of the MVBs with the plasma membrane2. Since the first discovery of exosomes, a wide range of cells have been shown to release these vesicles. Exosomes have also been detected in several biological fluids, including plasma, nasal lavage fluid, saliva and breast milk3-6. Furthermore, it has been demonstrated that the content and function of exosomes depends on the originating cell and the conditions under which they are produced. A variety of functions have been demonstrated for exosomes, such as induction of tolerance against allergen7,8, eradication of established tumors in mice9, inhibition and activation of natural killer cells10-12, promotion of differentiation into T regulatory cells13, stimulation of T cell proliferation14 and induction of T cell apoptosis15. Year 2007 we demonstrated that exosomes released from mast cells contain messenger RNA (mRNA) and microRNA (miRNA), and that the RNA can be shuttled from one cell to another via exosomes. In the recipient cells, the mRNA shuttled by exosomes was shown to be translated into protein, suggesting a regulatory function of the transferred RNA16. Further, we have also shown that exosomes derived from cells grown under oxidative stress can induce tolerance against further stress in recipient cells and thus suggest a biological function of the exosomal shuttle RNA17. Cell culture media and biological fluids contain a mixture of vesicles and shed fragments. A high quality isolation method for exosomes, followed by characterization and identification of the exosomes and their content, is therefore crucial to distinguish exosomes from other vesicles and particles. Here, we present a method for the isolation of exosomes from both cell culture medium and body fluids. This isolation method is based on repeated centrifugation and filtration steps, followed by a final ultracentrifugation step in which the exosomes are pelleted. Important methods to identify the exosomes and characterize the exosomal morphology and protein content are highlighted, including electron microscopy, flow cytometry and Western blot. The purification of the total exosomal RNA is based on spin column chromatography and the exosomal RNA yield and size distribution is analyzed using a Bioanalyzer.

This paper demonstrates methods for the isolation, purification and detection of exosomes, as well as techniques for analysis of their molecular content. These methods are adaptable for exosome isolation from both cell culture media and biological fluids, and can beyond analysis of molecular content also be useful in functional studies.

בידוד ואפיון של RNA המכיל Exosomes

The field of exosome research is rapidly expanding, with a dramatic increase in publications in recent years. These small vesicles (30-100 nm) of ...

Purification of High Yield Extracellular Vesicle Preparations Away from Virus

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection setting. The presented method is meant to isolate EVs away from virions (i.e., HIV-1), allowing for a higher efficiency and yield compared to conventional ultracentrifugation methods. Our protocol contains three steps: EV precipitation, density gradient separation, and particle capture. Downstream assays (i.e., Western blot, and PCR) can be run directly following particle capture. This method is advantageous over other isolation methods (i.e., ultracentrifugation) as it allows for the use of minimal starting volumes. Furthermore, it is more user friendly than alternative EV isolation methods requiring multiple ultracentrifugation steps. However, the presented method is limited in its scope of functional EV assays as it is difficult to elute intact EVs from our particles. Furthermore, this method is tailored towards a strictly research-based setting and would not be commercially viable.

This protocol isolates extracellular vesicles (EVs) away from virions with high efficiency and yield by incorporating EV precipitation, density gradient ultracentrifugation, and particle capture to allow for a streamlined workflow and a reduction of starting volume requirements, resulting in reproducible preparations for use in all EV research.

טיהור של תשואה גבוהה לחילוץ ההכנות הרחק וירוס

One of the major hurdles in the field of extracellular vesicle (EV) research today is the ability to achieve purified EV preparations in a viral infection ...

An Innovative Method for Exosome Quantification and Size Measurement

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about their complex pathways, their bioavailability and their diverse functions in health and disease. Current work focuses on the presence and the behavior of exosomes (in vitro as well as in vivo) in the context of different human disorders, especially in the fields of oncology, gynecology and cardiology.
Unfortunately, neither a consensus regarding a gold standard for exosome isolation exists, nor is there an agreement on such a method for their quantitative analysis. As there are many methods for the purification of exosomes and also many possibilities for their quantitative and qualitative analysis, it is difficult to determine a combination of methods for the ideal approach. 
Here, we demonstrate nanoparticle tracking analysis (NTA), a semi-automated method for the characterization of exosomes after isolation from human plasma by ultracentrifugation. The presented results show that this approach for isolation, as well as the determination of the average number and size of exosomes, delivers reproducible and valid data, as confirmed by other methods, such as scanning electron microscopy (SEM).

A method for isolation of exosomes from whole blood and further analysis by nanoparticle tracking using a semi-automatic instrument is presented in this article. The presented technology provides an extremely sensitive method for visualizing and analyzing particles in liquid suspension.

שיטה חדשנית לExosome כימות ומדידה גודל

Although the biological importance of exosomes has recently gained an increasing amount of scientific and clinical attention, much is still unknown about ...

Fast and Simplified Method for High Through-put Isolation of miRNA from Highly Purified High Density Lipoprotein

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for diagnosis and prognosis or may serve as targets for drug development, respectively. Recently it has been shown that miRNAs are carried in lipoproteins, particularly high density lipoproteins (HDL) and are delivered to recipient cells for uptake. This raises the possibility that miRNAs play a critical and pivotal role in cellular and organ function via regulation of gene expression as well as messenger for cell-cell communications and crosstalk between organs. Current methods for miRNA isolation from purified HDL are impractical when utilizing small samples on a large scale. This is largely due to the time consuming and laborious methods used for lipoprotein isolation. We have developed a simplified approach to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from plasma samples. This method should facilitate investigations into the role of miRNAs in health and disease and in particular provide new insights into the variety of biological functions, outside of the reverse cholesterol transport, that have been ascribed to HDL. Also, the miRNA species which are present in HDL can provide valuable information of clinical biomarkers for diagnosis of various diseases.

MicroRNAs play an important regulatory role and are emerging as novel therapeutic targets for various human diseases. It has been shown that miRNAs are carried in high density lipoproteins. We have developed a simplified method to rapidly isolate purified HDL suitable for miRNA analysis from human plasma.

שיטה מהירה ופשוטה עבור בידוד גבוה באמצעות-לשים של מירנה מן ליפופרוטאין בצפיפות הגבוה מאוד מטוהר

Small non-coding RNAs (miRNAs) have been implicated in a variety of human diseases including metabolic syndromes. They may be utilized as biomarkers for ...

Isolation and Characterization of Human Adipocyte-Derived Extracellular Vesicles using Filtration and Ultracentrifugation

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can modulate the cellular status of other cells locally in tissue microenvironments or through liberation into peripheral blood. Adipocyte-derived EVs are elevated in the peripheral blood and show alterations in their cargo (RNA and protein) during metabolic disturbances, including obesity and diabetes. Adipocyte-derived EVs can regulate the cellular status of neighboring vascular cells, such as endothelial cells and adipose tissue resident macrophages to promote adipose tissue inflammation. Investigating alterations in adipocyte-derived EVs in vivo is complex because EVs derived from peripheral blood are highly heterogenous and contain EVs from other sources, namely platelets, endothelial cells, erythrocytes and muscle. Therefore, the culture of human adipocytes provides a model system for the study of adipocyte derived EVs. Here, we provide a detailed protocol for the extraction of total small EVs from cell culture media of human gluteal and abdominal adipocytes using filtration and ultracentrifugation. We further demonstrate the use of Nanoparticle Tracking Analysis (NTA) for quantification of EV size and concentration and show the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101) in the gluteal and abdominal adipocyte derived-EVs. Isolated EVs from this protocol can be used for downstream analysis, including transmission electron microscopy, proteomics, metabolomics, small RNA-sequencing,&#160;microarrays and can be&#160;utilized in functional in vitro/in vivo studies.

We describe the isolation of human adipocyte-derived extracellular vesicles (EVs) from gluteal and abdominal adipose tissue using filtration and ultracentrifugation. We characterize the isolated adipocyte-derived EVs by determining their size and concentration by Nanoparticle Tracking Analysis and by western blotting for the presence of EV-protein tumor susceptibility gene 101 (TSG101).

Extracellular vesicles (EVs) are lipid enclosed envelopes that carry biologically active material such as proteins, RNA, metabolites and lipids. EVs can ...

<meta charset="utf8"></head><body>מחקרי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים באמצעות פרוטאום שלפוחית חוץ-תאית בפלזמה

Isolation, Characterization, and Proteomic Analysis of Plasma-Derived Extracellular Vesicles for Cardiovascular Biomarker Discovery

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research due to their role in regulating intercellular communication, potentially serving as valuable biomarkers for cardiovascular disease. However, the EV proteome and its potential as a biomarker in cardiovascular diagnostics remain poorly understood. This protocol presents a standardized method for the isolation and quantification of plasma-derived EV and the analysis of their protein cargo using plasma samples from patients presenting to the Chest Pain Unit of a large university hospital. Following routine phlebotomy, EV are isolated from plasma by differential ultracentrifugation. The enrichment of specific EV marker proteins in EV isolates is visualized by immunoblotting, and average size distribution and plasma EV concentrations are quantified by nanoparticle tracking analysis. Finally, ultra-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry is employed for label-free analysis of the EV proteome. This protocol thus provides a comprehensive approach to study and use plasma-derived EV as potential carriers of critical biological information as well as to explore their potential as novel biomarkers.

<meta charset="utf8"></head><body>זרקור המחבר: קידום הניתוח של פרוטאום שלפוחית חוץ-תאית בפלזמה למחקרי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים

This article describes a methodology for the isolation, characterization, and quantification of human plasma-derived extracellular vesicles (EV) and presents a workflow for label-free analysis of the EV proteome using liquid chromatography-tandem mass spectrometry (LC-MS/MS).

בידוד, אפיון וניתוח פרוטאומי של שלפוחיות חוץ-תאיות שמקורן בפלזמה לגילוי סמנים ביולוגיים קרדיווסקולריים

Extracellular vesicles (EV) are cell-derived, lipid bilayer-enclosed, non-replicable nanoparticles. EV currently gain attention in cardiovascular research ...