אנו מודים פרופ &#39;מיכאל Klymkowsky באוניברסיטת קולורדו בבולדר ופרופ&#39; ננסי Papalopulu באוניברסיטת מנצ&#39;סטר למתן חביב אנטי Sox3 ואנטי Myt1 נוגדנים, בהתאמה. אנו מודים לחברים במעבדת Papalopulu לקבלת הצעות תובנה שלהם בפיתוח פרוטוקול זה. עבודה זו נתמכה על ידי שני קרן ריפוי Studentships כדי SZ ו JL, שתי מלגות הפרויקט מטעם קרן ריפוי כדי SZ / EA ו JL / EA בהתאמה, מענק תוכנית אחת של קרן Wellcome כדי EA (WT082450MA), ומענק אחד אסטרטגית לתמיכה מוסדית מן קרן Wellcome [097,820 / Z / 11 / Z].

<ol>
	<li>De Robertis, E. M., Kuroda, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsal-ventral+patterning+and+neural+induction+in+Xenopus+embryos.">Dorsal-ventral patterning and neural induction in Xenopus embryos.</a> Annual Rev Cell Dev Biol. 20, 285-308 (2004).</li><li>Wilson, S. W., Houart, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+steps+in+the+development+of+the+forebrain.">Early steps in the development of the forebrain.</a> Dev Cell. 6, 167-181 (2004).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Vertebrate+embryonic+cells+will+become+nerve+cells+unless+told+otherwise.">Vertebrate embryonic cells will become nerve cells unless told otherwise.</a> Cell. 88, 13-17 (1997).</li><li>Hemmati-Brivanlou, A., Melton, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Inhibition+of+activin+receptor+signaling+promotes+neuralization+in+Xenopus.">Inhibition of activin receptor signaling promotes neuralization in Xenopus.</a> Cell. 77, 273-281 (1994).</li><li>Fainsod, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+dorsalizing+and+neural+inducing+gene+follistatin+is+an+antagonist+of+BMP-4.">The dorsalizing and neural inducing gene follistatin is an antagonist of BMP-4.</a> Mech Dev. 63, 39-50 (1997).</li><li>Piccolo, S., Sasai, Y., Lu, B., De Robertis, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dorsoventral+patterning+in+Xenopus:+inhibition+of+ventral+signals+by+direct+binding+of+chordin+to+BMP-4.">Dorsoventral patterning in Xenopus: inhibition of ventral signals by direct binding of chordin to BMP-4.</a> Cell. 86, 589-598 (1996).</li><li>Zimmerman, L. B., De Jesus-Escobar, J. M., Harland, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Spemann+organizer+signal+noggin+binds+and+inactivates+bone+morphogenetic+protein+4.">The Spemann organizer signal noggin binds and inactivates bone morphogenetic protein 4.</a> Cell. 86, 599-606 (1996).</li><li>Koyano, S., Ito, M., Takamatsu, N., Takiguchi, S., Shiba, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Xenopus+Sox3+gene+expressed+in+oocytes+of+early+stages.">The Xenopus Sox3 gene expressed in oocytes of early stages.</a> Gene. 188, 101-107 (1997).</li><li>Rogers, C. D., Harafuji, N., Archer, T., Cunningham, D. D., Casey, E. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xenopus+Sox3+activates+sox2+and+geminin+and+indirectly+represses+Xvent2+expression+to+induce+neural+progenitor+formation+at+the+expense+of+non-neural+ectodermal+derivatives.">Xenopus Sox3 activates sox2 and geminin and indirectly represses Xvent2 expression to induce neural progenitor formation at the expense of non-neural ectodermal derivatives.</a> Mech Dev. 126, 42-55 (2009).</li><li>Zhang, C., Basta, T., Jensen, E. D., Klymkowsky, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+beta-catenin/VegT-regulated+early+zygotic+gene+Xnr5+is+a+direct+target+of+SOX3+regulation.">The beta-catenin/VegT-regulated early zygotic gene Xnr5 is a direct target of SOX3 regulation.</a> Development. 130, 5609-5624 (2003).</li><li>Penzel, R., Oschwald, R., Chen, Y., Tacke, L., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Characterization+and+early+embryonic+expression+of+a+neural+specific+transcription+factor+xSOX3+in+Xenopus+laevis.">Characterization and early embryonic expression of a neural specific transcription factor xSOX3 in Xenopus laevis.</a> Int J Dev Biol. 41, 667-677 (1997).</li><li>Bellefroid, E. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=X-MyT1,+a+Xenopus+C2HC-type+zinc+finger+protein+with+a+regulatory+function+in+neuronal+differentiation.">X-MyT1, a Xenopus C2HC-type zinc finger protein with a regulatory function in neuronal differentiation.</a> Cell. 87, 1191-1202 (1996).</li><li>Moody, S. A., Miller, V., Spanos, A., Frankfurter, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+expression+of+a+neuron-specific+beta-tubulin+in+frog+(Xenopus+laevis):+a+marker+for+growing+axons+during+the+embryonic+period.">Developmental expression of a neuron-specific beta-tubulin in frog (Xenopus laevis): a marker for growing axons during the embryonic period.</a> J Comp Neurol. 364, 219-230 (1996).</li><li>Oschwald, R., Richter, K., Grunz, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Localization+of+a+nervous+system-specific+class+II+beta-tubulin+gene+in+Xenopus+laevis+embryos+by+whole-mount+in+situ+hybridization.">Localization of a nervous system-specific class II beta-tubulin gene in Xenopus laevis embryos by whole-mount in situ hybridization.</a> Int J Dev Biol. 35, 399-405 (1991).</li><li>Chitnis, A., Henrique, D., Lewis, J., Ish-Horowicz, D., Kintner, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Primary+neurogenesis+in+Xenopus+embryos+regulated+by+a+homologue+of+the+Drosophila+neurogenic+gene+Delta.">Primary neurogenesis in Xenopus embryos regulated by a homologue of the Drosophila neurogenic gene Delta.</a> Nature. 375, 761-766 (1995).</li><li>Roberts, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+functional+organization+of+spinal+neurons+in+developing+lower+vertebrates.">Early functional organization of spinal neurons in developing lower vertebrates.</a> Brain Res Bull. 53, 585-593 (2000).</li><li>Hartenstein, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Early+neurogenesis+in+Xenopus:+the+spatio-temporal+pattern+of+proliferation+and+cell+lineages+in+the+embryonic+spinal+cord.">Early neurogenesis in Xenopus: the spatio-temporal pattern of proliferation and cell lineages in the embryonic spinal cord.</a> Neuron. 3, 399-411 (1989).</li><li>Hirabayashi, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Wnt/beta-catenin+pathway+directs+neuronal+differentiation+of+cortical+neural+precursor+cells.">The Wnt/beta-catenin pathway directs neuronal differentiation of cortical neural precursor cells.</a> Development. 131, 2791-2801 (2004).</li><li>Munji, R. N., Choe, Y., Li, G., Siegenthaler, J. A., Pleasure, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wnt+signaling+regulates+neuronal+differentiation+of+cortical+intermediate+progenitors.">Wnt signaling regulates neuronal differentiation of cortical intermediate progenitors.</a> J Neurosci. 31, 1676-1687 (2011).</li><li>Bonev, B., Stanley, P., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+Modulates+Hes1+ultradian+oscillations+by+forming+a+double-negative+feedback+loop.">MicroRNA-9 Modulates Hes1 ultradian oscillations by forming a double-negative feedback loop.</a> Cell Rep. 2, 10-18 (2012).</li><li>Bonev, B., Pisco, A., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNA-9+reveals+regional+diversity+of+neural+progenitors+along+the+anterior-posterior+axis.">MicroRNA-9 reveals regional diversity of neural progenitors along the anterior-posterior axis.</a> Dev Cell. 20, 19-32 (2011).</li><li>Munoz, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regeneration+of+Xenopus+laevis+spinal+cord+requires+Sox2/3+expressing+cells.">Regeneration of Xenopus laevis spinal cord requires Sox2/3 expressing cells.</a> Dev Biol. , (2015).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Vleminckx, K., Amaya, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fezf2+promotes+neuronal+differentiation+through+localised+activation+of+Wnt/beta-catenin+signalling+during+forebrain+development.">Fezf2 promotes neuronal differentiation through localised activation of Wnt/beta-catenin signalling during forebrain development.</a> Development. 141, 4794-4805 (2014).</li><li>Zhang, S., Li, J., Lea, R., Amaya, E., Dorey, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Functional+Genome-Wide+In+Vivo+Screen+Identifies+New+Regulators+of+Signalling+Pathways+during+Early+Xenopus+Embryogenesis.">A Functional Genome-Wide In Vivo Screen Identifies New Regulators of Signalling Pathways during Early Xenopus Embryogenesis.</a> PloS one. 8, e79469 (2013).</li><li>Wang, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+identifies+neural+progenitors+in+persistent+neonatal+and+adult+mouse+forebrain+germinative+zones.">Sox3 expression identifies neural progenitors in persistent neonatal and adult mouse forebrain germinative zones.</a> J Comp Neurol. 497, 88-100 (2006).</li><li>Sabherwal, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+apicobasal+polarity+kinase+aPKC+functions+as+a+nuclear+determinant+and+regulates+cell+proliferation+and+fate+during+Xenopus+primary+neurogenesis.">The apicobasal polarity kinase aPKC functions as a nuclear determinant and regulates cell proliferation and fate during Xenopus primary neurogenesis.</a> Development. 136, 2767-2777 (2009).</li><li>Falk, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electroporation+of+cDNA/Morpholinos+to+targeted+areas+of+embryonic+CNS+in+Xenopus.">Electroporation of cDNA/Morpholinos to targeted areas of embryonic CNS in Xenopus.</a> BMC Dev Biol. 7, 107 (2007).</li><li>Moreno, N., Retaux, S., Gonzalez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatio-temporal+expression+of+Pax6+in+Xenopus+forebrain.">Spatio-temporal expression of Pax6 in Xenopus forebrain.</a> Brain Res. 1239, 92-99 (2008).</li><li>Kay, B. K., Shah, A. J., Halstead, W. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+Ca2+-binding+protein,+parvalbumin,+during+embryonic+development+of+the+frog,+Xenopus+laevis.">Expression of the Ca2+-binding protein, parvalbumin, during embryonic development of the frog, Xenopus laevis.</a> J Cell Biol. 104, 841-847 (1987).</li><li>Park, B. Y., Hong, C. S., Weaver, J. R., Rosocha, E. M., Saint-Jeannet, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Xaml1/Runx1+is+required+for+the+specification+of+Rohon-Beard+sensory+neurons+in+Xenopus.">Xaml1/Runx1 is required for the specification of Rohon-Beard sensory neurons in Xenopus.</a> Dev Biol. 362, 65-75 (2012).</li><li>Lea, R., Bonev, B., Dubaissi, E., Vize, P. D., Papalopulu, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+fluorescent+in+situ+mRNA+hybridization+(FISH)+on+whole+mounts+and+sections.">Multicolor fluorescent in situ mRNA hybridization (FISH) on whole mounts and sections.</a> Methods Mol Biol. 917, 431-444 (2012).</li><li>Canaria, C. A., Lansford, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+optical+imaging+in+living+embryos.">Advanced optical imaging in living embryos.</a> Cell Mol Life Sci. 67, 3489-3497 (2010).</li><li>Prouty, A. M., Wu, J., Lin, D. T., Camacho, P., Lechleiter, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiphoton+laser+scanning+microscopy+as+a+tool+for+Xenopus+oocyte+research.">Multiphoton laser scanning microscopy as a tool for Xenopus oocyte research.</a> Methods Mol Biol. 322, 87-101 (2006).</li><li>Love, N. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=pTransgenesis:+a+cross-species,+modular+transgenesis+resource.">pTransgenesis: a cross-species, modular transgenesis resource.</a> Development. 138, 5451-5458 (2011).</li><li>Kovacevic Grujicic, N., Mojsin, M., Krstic, A., Stevanovic, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+characterization+of+the+human+SOX3+promoter:+identification+of+transcription+factors+implicated+in+basal+promoter+activity.">Functional characterization of the human SOX3 promoter: identification of transcription factors implicated in basal promoter activity.</a> Gene. 344, 287-297 (2005).</li><li>Wang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myt1+and+Ngn3+form+a+feed-forward+expression+loop+to+promote+endocrine+islet+cell+differentiation.">Myt1 and Ngn3 form a feed-forward expression loop to promote endocrine islet cell differentiation.</a> Dev Biol. 317, 531-540 (2008).</li><li>Rogers, C. D., Archer, T. C., Cunningham, D. D., Grammer, T. C., Casey, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sox3+expression+is+maintained+by+FGF+signaling+and+restricted+to+the+neural+plate+by+Vent+proteins+in+the+Xenopus+embryo.">Sox3 expression is maintained by FGF signaling and restricted to the neural plate by Vent proteins in the Xenopus embryo.</a> Dev Biol. , 307-319 (2008).</li></ol>

החוקרים אין לי מה לחשוף.

כאן אנו מדגימים שיטה נוחה ויעילה המאפשרת הדמית נוירוגנזה עיקרית בעוברי Xenopus. שיטה זו מאפשרת הערכה של סוגים שונים של תאים עצביים, כולל תאי גזע עצביים ועל נוירונים העיקרי מובחן באמצעות סמנים סוג תא ספציפי. הפרוטוקול הוא איתן בדרך כלל עם רמה גבוהה מאוד של שחזור. עבור עוברים נמצאים בשלבים טרום בקיעה (כלומר עד לשלב 28), אנו ידניים ממליצים להסיר את קרום vitelline לפני הקיבוע כמו זו מאפשרת עוברת כדי ליישר באופן מלא לפני הקיבעון. זה חשוב במיוחד בעת איסוף עוברים בשלבים מוקדמים יחסית (לפני הבקיעה), מאז עוברים כפוף קשה מאוד לארגן את הכיוון הרצוי בתוך החדר גובר. אנחנו לא חווינו אובדן של immunogenicity לאחר קיבוע MEMFA או PFA ומכאן צעד יחזור אנטיגן נוסף אינו הכרחי בפרוטוקול זה. בנוסף, זההליך immunostaining יכול להתבצע דגימות chromogenic / ניאון הכלאה באתרה. בתרחיש כזה, מומלץ לדלג על שלב הטיפול K פרוטאז במהלך הפרוטוקול הכלאה באתרו. לאחר תגובת מצע chromogenic / פלורסנט, דגימות ניתן לכבס עם TBS ו מוטבעות פתרון ג&#39;לטין דגים בצורה דומה דגימות קבועות MEMFA / PFA. בקבוקונים לדוגמא יכולים להיות מוגנים מפני אור על ידי עטיפת הבקבוקונים בנייר אלומיניום אם ניאון הכלאה באתרו יהיה צלם יחד עם מכתים immunofluorescent מאוחר יותר. במקרים מסוימים, עובר עלולים להתכווץ בצורה מוגזמת אחרי חדירת ג&#39;לטין. זו נגרמת ככל הנראה על ידי אחד קיבעון מספיק או מיצוי TBS-טריטון מספיק. ודא כי עוברי תוקנו PFA / MEMFA לפחות 2-3 שעות או רצוי לילה ב 4 מעלות צלזיוס. אם הבעיה נמשכת, להגדיל את זמן הכביסה של TBS-טריטון 3 עבור שעה 1. במהלך קריו-sectioנינג, הנוקשות של לחסום מדגם עשוי להשתנות כמו קבוצות שונות של ג&#39;לטין דגים יש מאפיינים שונים. בעיה זו ניתן לפצות באופן חלקי על ידי התאמת הטמפרטורה של microtome. טמפרטורה נמוכה יותר תגרום גוש &quot;קשה&quot; מדגם אולם מתחת לטמפרטורה נמוכה מוגזמת בלוק הדגימה נעשה פריך וקשה סעיף. חלק כיוונון עדין או בפועל (באמצעות בלוקי מדגם מדומים ללא עוברי) לפני כל חתך עשויה להועיל לפני השימוש על במיוחד דגימות יקרות. בעיה בדרך נתקלה במהלך החתך היא החלקים הדקים לפעמים נוטים להדביק על צלחת זכוכית העבה ולא להישאר שטוחים על במת הפלדה. זה יכול להיות במיוחד לשבש שכן הוא כל זמן קוטע את תהליך החתך הרציף. במקרים כאלה בדרך כלל נגרמים על ידי אחת משתי סיבות: תא הסעיף ו (בעיקר) צלחת הזכוכית העבה לא להיות קר מספיק, או מוגזם מטען סטטי על המכונית ואת operator, במיוחד במזג אוויר יבש. הראשון ניתן לפתור על ידי לכבות את הטמפרטורה של חדר הסעיף ולהשאיר צלחת הזכוכית בתוך תוספת זמן (אולי הלילה); ואת האחרון על ידי הארקת cryostat כראוי. חיבור משטח המתכת של cryostat לברז מתכת או מערכת צינורות מים דומה עשויה מתכת יכולה להיות דרך חלופית כדי לשחרר את המטענים סטטיים. לאחר כל שימוש, צלחת זכוכית עבה יש לשטוף היטב עם חומר ניקוי שאינו מאכל (כגון נוזל כלים), שטופים במים ultrapure, ריססו עם אתנול טהור, עטוף בנייר מגבת כדי להגן על פני השטח ואת הקצוות מפגיעה. הנוגדנים המפורטים בפרוטוקול הם ספציפיים בדרך כלל רק לעתים נדירות אנו נתקלים ספיחה לא ספציפית או אות רקע גבוהה. יצוין כי, אם באמצעות מומת חום בסרום עיזים / טלה כסוכן חסימה,-איון חום מוגזם (כמו דמיינו כתוצאה מהיווצרותם של נמהר פלאפי בנסיוב) צריךלהימנע ככל נמהר זה מאוד אטרקטיבי כדי נוגדנים משני ועשוי לתרום מקור רקע גבוה. זה אפשרי, ולפעמים רצוי, כדי לבצע מכתים כפול לדמיין אוכלוסיות שונות של תאים עצביים בו זמנית. כזה מכתים כפול אפשרי ובאופן כללי נותן תוצאות משביעות רצון עם השילובים הבאים: Sox3 / N-אמבט או Myt1 / N-אמבט. עם זאת, פעמים המכתימות של Sox3 ו Myt1 מסתבך בשל העובדה כי שני נוגדנים הם ממקור ארנב. בדקנו כמה ערכות תיוג ישירות נוגדנים, אולם לא נצפו תוצאות משביעות רצון (אות לרעש ברמה נמוכה), ככל הנראה בשל חוסר הגברת אות מ נוגדנים משני. גישה אפשרית אחת לעקוף בעיה זו תהיה להעלות קווים מהונדסים Xenopus, כמפורט להלן. אחת המגבלות העיקריות של פרוטוקול זה הוא, כי בעוד פרוטוקול זה יכול מספיק distinguish שתי ברכות עיקריות של תאים עצביים, כלומר, ברכת תא גזע העצבית להביע Sox3 ואת נוירונים הבדילו להביע Myt1, היא חסרו את היכולת לחשוף תת-אוכלוסיות שונות של נוירונים בדיל. כזה תת אוכלוסיות, אשר כוללות, אך אינם מוגבלות, הנוירונים מוטוריים עיקריים, interneurons, ואת עצב סנסורי, בדרך כלל מאופיינים הגנים סמנו דיפרנציאלי הביע שלהם 28-30. כאמור, התקדמות בפיתוח ססגוניות הכלאה באתרו בשילוב עם שיטת זיהוי immunofluorescence מבוסס נוגדנים בעוברי Xenopus יכולה למלא את הפער לחשוף תת-אוכלוסיות אלו של נוירונים בדיל לחקירת פוטנציאל 31. לחלופין, כפי הודגם במודל עכברים, זה היה גם להיות רצוי להעלות מערך מקיף יותר של נוגדנים מסוג התא ספציפי להבחין אוכלוסיות תאים שונות כגון Xenopus. זהגם ראוי להזכיר כי, כתוספת בשיטה זו, התקדמות הדמיה אופטיות ניתוח תמונה, כגון מיקרוסקופיה multiphoton, שחזור 3D, ופילוח, ניתן ליישם גם לאחר הערכות ראשוניות להשיג תצפיות מקיפות יותר של ביציות Xenopus וכן עוברי מוקדם, במיוחד תחת חיה הגדרת 32,33. לכן, כדי לעקוב אחר התפשטות, בידול, ותנועה של תאים עצביים בבעלי חיים, זה היה להיות רצוי להקים אחד או יותר קווים מהונדסים כי נמל חלבוני ניאון מונעים על ידי אמרגן סוג תא ספציפי כדי לאפשר תצפית חיים של אוכלוסיות תאים כאלה בתחילת Xenopus עוברי. הקמת X. laevis קו עם אמרגן נוירו-ספציפי β טובולין נהיגת tauGFP ושימושיה ספק דוגמא יפה 23,34. עם רצפי אמרגן מלאים הוא sox3 ו myt1 המאופיין בבעלי חוליות 35-37, זה shולד להיות יחסי קל להקים קווי מהונדס נוספים Xenopus שאמור לתרום בהרחבה לשתי קהילת Xenopus ושדה כללי יותר של מחקר נוירוגנזה העיקרי.

בבעלי חוליות, התפתחות מערכת העצבים המרכזית מורכבת מכמה שלבים ייחודיים עדיין רצופים. הצעד הראשון הוא אינדוקציה עצבית, כאשר תאי ectodermal נאיביים מפורטים כלפי גורל עצבי ולא גורל אפידרמיס. מספר מנגנוני ויסות מחוברים מעורבים בשלב זה ב Xenopus ומערכות מודל אחר 1,2. תהליך זה מתואם בעיקר על ידי גורמים מופרשים המיוצרים על ידי mesoderm הבסיסי, כגון chordin, שגולגולת, ו follistatin 3-7. לאחר אינדוקציה עצבית, קבוצת משנה של אבות עצביים לצאת ממעגל התא מתחיל להבחין בתהליך המכונה נוירוגנזה ראשוני. לא כל מבשרי נוירונים להבדיל בשלב זה. התאים העצביים מבשרי הנותרים ממשיכים להתרבות, ובכך לשמר את הברכה תא גזע הדרושים להמשך צמיחה של מערכת עצבים המרכזית ברחבי פיתוח לבגרות. אלה יחסי ציבורoliferating תאים עצביים מבשר מאופיינים הביטוי שלהם של Sry (Y באזור בקביעת מין) -box 3 (sox3) גן 8-11. אוכלוסיית אחרים של תאים, אשר היציאה מחזור התא ומתחייבים גורל הבדיל, מזוהים על ידי הביטוי של סמנים גן בידול, טובולין, בטא 2B בכיתה IIb (tubb2b, N-גיגית) ו גורם שעתוק המיאלין 1 (myt1) 12-14. כזה תאים עצביים הבדיל בסופו של דבר להצמיח קטגוריות שונות של נוירונים כולל, אך לא רק, מנוע, הבין, ואת עצב סנסורי ממוקם באזורים נפרדים בתוך הצינור העצבי 15-17. בעוד מאמצים משמעותיים הוקדשו לחשוף את מנגנוני ויסות ששולטים דפוסי גורל קביעת אירועי neuroectoderm הקדמי, פחות תשומת לב נעשה על בחקירת אירועי נוירוגנית המתרחשים בעקבותבשלב דפוסים ראשוני. ואכן, הולך אותות, תקנות תעתיק, כמו גם שינויים שלאחר translational מעורבים כולם בפעילות בשלב מאוחר זה, זה לשלוט מפרט עיתוי שושלת במהלך הנוירוגנזה 18-20. בדיקות נוספות לתוך המנגנונים האלה דורשות שיטה אמינה לדמיין בקלות להבחין אוכלוסיות שונות של תאים עצביים. הנ&quot;ל סמנים עצביים, כולל, Sox3, Myt1, ו- N-האמבטיה, יכולה לספק אמצעי לזיהוי אוכלוסיות תאים שונים אלה, ובכך לספק את היסודות הדרושים חושף את המנגנון הבסיסי של בידול עצבי 21-23. למרות תיוג הפרש של אוכלוסיות תאים עצביות הודגם באורגניזמים מודל שניים, מחקרים מעטים יחסית נצלו את מערכת Xenopus במלואם בעניין זה. זאת בעיקר בשל מחסור של נוגדנים תואמים באופן מהימן לזהות את neur השונהאוכלוסיות תאים onal בצינור העצבי. כאן, אנו מתארים שיטה המאפשר הדמיה והבחנה עצבית בעוברי Xenopus מוקדם באמצעות immunostaining, המספק גישה חזקה ונוחה לחקירת נוירוגנזה עיקרי Xenopus. פרוטוקול זה אמור לתת הדרכה מספקת לחוקרים המעוניינים בהתפתחות המוקדמת של מערכת העצבים המרכזית Xenopus בין שלב 26 ושלב 45.

<table><tbody><tr><td>gentamicin&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1397</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T3253</td><td></td></tr><tr><td>Tris-base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td></td></tr><tr><td>NaCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746436</td><td></td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>746452</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>793639</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>RDD003</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>37% formaldehyde&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>F8775</td><td></td></tr><tr><td>Gelatin from cold water fish skin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G7765</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Base Mould Disposable 15 Mm x 15 Mm x 5 Mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-015A</td><td></td></tr><tr><td>Base Mould Disposable 7 Mm x 7 Mm x 5 Mm Simport</td><td>VWR</td><td>EMB-200-010K</td><td></td></tr><tr><td>Superfrost Plus slides</td><td>ThermoFisher</td><td>12-550-15</td><td></td></tr><tr><td>Tissue Freezing Medium (OCT)</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>14020108926</td><td></td></tr><tr><td>Cryostat</td><td>Leica&amp;nbsp;</td><td>CM3050</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry Ice</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100&amp;nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr><tr><td>&amp;nbsp;85-90 &amp;deg;C Heat block</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>PAP pen</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Z377821</td><td></td></tr><tr><td>Acetone, analytical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Staining jar with slide racks</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Click-lock food box of appropriate size (has the capacity to hold 1-2 6-well plate inside)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>anti-acetylated tubulin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T7451</td><td></td></tr><tr><td>Anti-mouse IgG (H+L), F(ab&#039;)2&amp;nbsp;Fragment (Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;488 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4408</td><td></td></tr><tr><td>Anti-rabbit IgG (H+L), F(ab&#039;)2&amp;nbsp;Fragment (Alexa Fluor&amp;reg;&amp;nbsp;555 Conjugate)</td><td>Cell Signaling</td><td>4413</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor&amp;reg; 647 Phalloidin</td><td>Cell Signaling</td><td>8940</td><td></td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Cell Signaling</td><td>4083</td><td></td></tr><tr><td>ProLong Gold Antifade Mountant</td><td>Life Technologies</td><td>P36930</td><td></td></tr></tbody></table>

assessing primary neurogenesis in xenopus embryos using immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During this process, a portion of neural stem cells undergo differentiation and give rise to the first populations of differentiated primary neurons within the nascent central nervous system. Several vertebrate model organisms have been used to explore the mechanisms of neural cell fate specification, patterning, and differentiation. Among these is the African clawed frog, Xenopus, which provides a powerful system for investigating the molecular and cellular mechanisms responsible for primary neurogenesis due to its rapid and accessible development and ease of embryological and molecular manipulations. Here, we present a convenient and rapid method to observe the different populations of neuronal cells within Xenopus central nervous system. Using antibody staining and immunofluorescence on sections of Xenopus embryos, we are able to observe the locations of neural stem cells and differentiated primary neurons during primary neurogenesis.

תוצאות הנציגים להראות בחתכים של עובר שלב 30 Xenopus ברמות שונות, כלומר המוח הקדמי, המוח התיכון, למוח האחורי, וחוט שדרה, מוכתמות נוגדנים שונים (איור 4). כאמור, Sox3 שכותרתו אוכלוסיית תא אב עצבית מאתרת הקרבה של לומן של הצינור העצבי, בעוד MyT1 שכותרתו נוירונים עיקרי בדיל נודד החוצה ולאתר ליד השכבה השולית (lamina בסיס) של הצינור העצבי. Anti-אצטיל-טובולין תוויות אקסונים בנוירונים הבדיל, אשר ניתן לצפות בתוך הצינור העצבי כולו. תופעות ספציפיות מציאת גן או ביטוי יתר היא שיטה בשימוש נרחב בנוירוביולוגיה להעריך האם מודולציה של ההתבטאות של גנים ספציפיים (ים) משבשת את הצמיחה והתבדלות של תאים עצביים. במקרים כאלה, גם Morpholinos (MOS) או DNA מבנה (ים) נושאת פרו<html> moter מונחה גן (הים) מוזרק לתוך אחד משני בלסטומרים בשלב שני תאים 23. לחלופין, הם יכולים להיות מוזרקים לתוך חדר המוח ואחריו electroporation, אשר יגרום מציאה או ביטוי יתר של גן רצוי (ים) 27. בשני המקרים, את ההשפעות תוגבלנה צד אחד של העובר, מה שהופך את הצד הנגדי של העובר כפי בקרה פנימית מטופל. לאחר קיבוע, חתך, ו immunostaining, ההשפעות של מציאת גן / יתר ביטוי הם לכמת באמצעות ספירת השוואת המספרים הסלולרי של אוכלוסיות שונות משני צדי עובר. על ידי צבירת נתונים אלה מכמה עובריים, ניתוח סטטיסטי יכול להתבצע. בתוצאות הנציג שלנו, לא הפרעות נעשו העוברים. דוגמאות של הפרעות גן והשפיע על אוכלוסיות תאים עצביות שונות ניתן למצוא הפניות 20,23. t &quot;FO: keep-together.within-page =&quot; 1 &quot;&gt; <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig1.jpg" /> איור 1:. סדר עובר ואורינטצית העובש בסעיף (א) תיאור קריקטורה המראה את הרכבת ההרכבה, לציין את המגש סומן בתווית עם התאריך, במה, ואת הכיוון של עוברים. (ב) תמונה המציגה את המראה הטבעי של הרכבת ההרכבה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53949/53949fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig2.jpg" /> איור 2:. האורינטציה ואת המיקום של גוש הג&#39;לטין על דיסק ההחזקה המדגמת (א) תיאור קריקטורה המראה את הרכבת בלוק סעיף, לב עוברי נמצא בעמדת &quot;ראש בראש&quot; ואת גוש הג&#39;לטין קבוע בחוזקה on כדי הדיסק ההחזקה מדגם ידי המדיום הקפאת רקמות בבסיס (ראה תרשים 2B). (ב) תמונה המציגה את המראה הטבעי של הרכבת בלוק הסעיף, לב ההצטברות של המדיום הקפאה רקמות בין גוש הג&#39;לטין ודיסק ההחזקה המדגמת. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53949/53949fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig3.jpg" /> איור 3:. רציף חתך (א) דגם של תא סעיף. דיסק החזקת המדגם צריך לסובב וקבוע למצב שצד העובר הוא פונה כלפי מעלה. אחרי כמה (6-10) חלקים, הרצועה הארוכה של אריחי סעיף רציפים מופרד בעדינות מן הלהב (הכחול) בעזרת מברשת בסדר, ואז פונה 90 מעלות על הצלחת החזקה. ואז זמני בחדר טעון חיובי שקופיתצמוד בלחץ על רצועת הסעיף פונה כלפי מטה ומייד הרים עד רצועות מוגמרות שנאספו. (ב) בדרך כלל, כל שקופית יכולה להכיל 2 קווים מקבילים של רצועות, כפי שמוצג. זכור להכין תיעוד מפורט על התווית לשקופית באמצעות עיפרון. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53949/53949fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53949/53949fig4.jpg" /> איור 4: חתך של שלב 30 X. laevis ראשנים מכתימים הרקמה העצבית, 20X. (א) שרטוטים המציינים את מיקומם היחסי (מוח קדמי, מוח תיכון, למוח אחורי, וחוט שדרה) של מטוסים בפרק ראשני Xenopus. (ב) על סמך חתכים מקבילים מוכתם אנטי Sox3 (אדום), אנטי-acetylated טובולין (Green), ו DAPI (הכחול), המראה את המיקום היחסי של ברכות תאי גזע עצביות כמו גם neurofilaments בתוך הצינור העצבי. (C) מקביל בחתכים מוכתמים אנטי MyT1 (אדום) ו DAPI (כחול), המראים את המיקום היחסי של נוירונים עיקרי מובחן בתוך הצינור העצבי. סרגל קנה מידה = 20 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53949/53949fig4large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining at JoVE.com

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

מאמר זה מציג שיטה נוחה ומהירה המאפשר הדמיה אוכלוסיות תאים עצביים שונים במערכת העצבים המרכזית של עוברי Xenopus באמצעות מכתים immunofluorescent על ​​הסעיפים.

הערכת Neurogenesis יסודי<em&gt; Xenopus</em&gt; עוברים באמצעות Immunostaining

Primary neurogenesis is a dynamic and complex process during embryonic development that sets up the initial layout of the central nervous system. During ...

assessing-primary-neurogenesis-in-xenopus-embryos-using-immunostaining

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

9.5K Views.  University of Manchester.  מאמר זה מציג שיטה נוחה ומהירה המאפשר הדמיה אוכלוסיות תאים עצביים שונים במערכת העצבים המרכזית של עוברי Xenopus באמצעות מכתים immunofluorescent על ​​הסעיפים. 

Video: Assessing Primary Neurogenesis in Xenopus Embryos Using Immunostaining

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect neuronal process outgrowth, shRNA or cDNA constructs can be introduced into primary neurons via chemical transfection or viral transduction. However, with primary cortical cells, a heterogeneous pool of cell types (glutamatergic neurons from different layers, inhibitory neurons, glial cells) are transfected using these methods. The use of in utero electroporation to introduce DNA constructs in the embryonic rodent cortex allows for certain subsets of cells to be targeted: while electroporation of early embryonic cortex targets deep layers of the cortex, electroporation at late embryonic timepoints targets more superficial layers. Further, differential placement of electrodes across the heads of individual embryos results in the targeting of dorsal-medial versus ventral-lateral regions of the cortex. Following electroporation, transfected cells can be dissected out, dissociated, and plated in vitro for quantitative analysis of neurite outgrowth. Here, we provide a step-by-step method to quantitatively measure neuronal process outgrowth in subsets of cortical cells.
The basic protocol for in utero electroporation has been described in detail in two other JoVE articles from the Kriegstein lab 1, 2. We will provide an overview of our protocol for in utero electroporation, focusing on the most important details, followed by a description of our protocol that applies in utero electroporation to the study of gene function in neuronal process outgrowth.

In utero Electroporation followed by Primary Neuronal Culture for Studying Gene Function in Subset of Cortical Neurons

In utero electroporation is a valuable method for transfecting neuronal progenitor cells in vivo. Depending upon the placement of the electrodes and the developmental timepoint of electroporation, certain subsets of cortical cells can be targeted. Targeted cells can then be analyzed in vivo or in vitro for effects of genetic alteration.

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג&#39;ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

In vitro study of primary neuronal cultures allows for quantitative analyses of neurite outgrowth. In order to study how genetic alterations affect ...

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent. These cells can be isolated, and programmed to generate various tissues through manipulation of genes expression or induction by morphogens. In this manuscript protocols are described for the use of Xenopus laevis blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development. These protocols allow the investigation of fate acquisition, cell migration behaviors, and cell autonomous and non-autonomous properties. The blastocoel roof explants can be cultured in a serum-free defined medium and grafted into host embryos. This transplantation into an embryo allows the investigation of the long-term lineage commitment, the inductive properties, and the behavior of transplanted cells in vivo. These assays can be exploited to investigate molecular mechanisms, cellular processes and gene regulatory networks underlying neural development. In the context of regenerative medicine, these assays provide a means to generate neural-derived cell types in vitro that could be used in drug screening.

Stem cell-like Xenopus Embryonic Explants to Study Early Neural Developmental Features In Vitro and In Vivo

In Xenopus embryos, cells from the roof of the blastocoel are pluripotent and can be programmed to generate various tissues. Here, we describe protocols to use amphibian blastocoel roof explants as an assay system to investigate key in vivo and in vitro features of early neural development.

כמו תא גזע<em&gt; Xenopus</em&gt; Explants העובריים לחקר תכונות המוקדמות עצבי התפתחותית<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Understanding the genetic programs underlying neural development is an important goal of developmental and stem cell biology. In the amphibian blastula, ...

Developmental Biology

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The efficient in vivo visualization of blood vessels and the reliable quantification of their complexity are key to understanding the biology and disease of the vascular network. Here, we provide a detailed method to visualize blood vessels with a commercially available fluorescent dye, human plasma acetylated low density lipoprotein DiI complex (DiI-AcLDL), and to quantify their complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be labeled by a simple injection of DiI-AcLDL into the beating heart of an embryo, and blood vessels in the entire embryo can be imaged in live or fixed embryos. Combined with gene perturbation by the targeted microinjection of nucleic acids and/or the bath application of pharmacological reagents, the roles of a gene or of a signaling pathway on vascular development can be investigated within one week without resorting to sophisticated genetically engineered animals. Because of the well-defined venous system of Xenopus and its stereotypic angiogenesis, the sprouting of pre-existing vessels, vessel complexity can be quantified efficiently after perturbation experiments. This relatively simple protocol should serve as an easily accessible tool in diverse fields of cardiovascular research.

Visualization and Quantitative Analysis of Embryonic Angiogenesis in Xenopus tropicalis

This protocol demonstrates a fluorescence-based method to visualize the vasculature and to quantify its complexity in Xenopus tropicalis. Blood vessels can be imaged minutes after the injection of a fluorescent dye into the beating heart of an embryo after genetic and/or pharmacological manipulations to study cardiovascular development in vivo.

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב<em&gt; Xenopus טרופי</em

Blood vessels supply oxygen and nutrients throughout the body, and the formation of the vascular network is under tight developmental control. The ...

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During axon outgrowth, the growth cone must integrate multiple sources of guidance cue information to modulate its cytoskeleton in order to propel the growth cone forward and accurately navigate to find its specific targets1. How this integration occurs at the cytoskeletal level is still emerging, and examination of cytoskeletal protein and effector dynamics within the growth cone can allow the elucidation of these mechanisms. Xenopus laevis growth cones are large enough (10-30 microns in diameter) to perform high-resolution live imaging of cytoskeletal dynamics (e.g.2-4 ) and are easy to isolate and manipulate in a lab setting compared to other vertebrates. The frog is a classic model system for developmental neurobiology studies, and important early insights into growth cone microtubule dynamics were initially found using this system5-7 . In this method8, eggs are collected and fertilized in vitro, injected with RNA encoding fluorescently tagged cytoskeletal fusion proteins or other constructs to manipulate gene expression, and then allowed to develop to the neural tube stage. Neural tubes are isolated by dissection and then are cultured, and growth cones on outgrowing neurites are imaged. In this article, we describe how to perform this method, the goal of which is to culture Xenopus laevis growth cones for subsequent high-resolution image analysis. While we provide the example of +TIP fusion protein EB1-GFP, this method can be applied to any number of proteins to elucidate their behaviors within the growth cone.

Neural Explant Cultures from Xenopus laevis

Culturing neural explants from dissected Xenopus laevis embryos that express fluorescent fusion proteins allows for imaging of growth cone cytoskeletal dynamics.

תרבויות Explant עצביות מן<em&gt; Xenopus laevis</em

The complex process of axon guidance is largely driven by the growth cone, which is the dynamic motile structure at the tip of the growing axon. During ...

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the development of neuronal connectivity. During establishment of the retino-tectal projection, optic axons extend from the eye and navigate through distinct regions of the brain to reach their target tissue, the optic tectum. Once optic axons enter the tectum, they elaborate terminal arbors that function to increase the number of synaptic connections they can make with target interneurons in the tectum. Here, we describe a method to express DNA encoding green fluorescent protein (GFP), and gain- and loss-of-function gene constructs, in optic neurons (retinal ganglion cells) in Xenopus embryos. We explain how to microinject a combined DNA/lipofection reagent into eyebuds of one day old embryos such that exogenous genes are expressed in single or small numbers of optic neurons. By tagging genes with GFP or co-injecting with a GFP plasmid, terminal axonal arbors of individual optic neurons with altered molecular signaling can be imaged directly in brains of intact, living Xenopus tadpoles several days later, and their morphology can be quantified. This protocol allows for determination of cell-autonomous molecular mechanisms that underlie the development of optic axon arborization in vivo.

Microinjection of DNA into Eyebuds in Xenopus laevis Embryos and Imaging of GFP Expressing Optic Axonal Arbors in Intact, Living Xenopus Tadpoles

This protocol aims to demonstrate how to microinject a DNA/DOTAP mixture into eyebuds of one day old Xenopus laevis embryos, and how to image and reconstruct individual green fluorescent protein (GFP) expressing optic axonal arbors in tectal midbrains of intact, living Xenopus tadpoles.

הזרקת דנ א לתוך eyebuds ב xenopus זריזה העוברים והדמיה של gfp המבטא האופטי axonal הביע בשלמותו, חי xenopus tadpoles

The primary visual projection of tadpoles of the aquatic frog Xenopus laevis serves as an excellent model system for studying mechanisms that regulate the ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Immunohistochemistry and Multiple Labeling with Antibodies from the Same Host Species to Study Adult Hippocampal Neurogenesis

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly committed intermediate progenitor subtypes. Each of these subtypes expresses a set of specific molecular markers that, together with specific morphological criteria, can be used for their identification. Typically, immunofluorescent techniques are applied involving subtype-specific antibodies in combination with exo- or endogenous proliferation markers. We herein describe immunolabeling methods for the detection and quantification of all stages of adult hippocampal neurogenesis. These comprise the application of thymidine analogs, transcardial perfusion, tissue processing, heat-induced epitope retrieval, ABC immunohistochemistry, multiple indirect immunofluorescence, confocal microscopy and cell quantification. Furthermore we present&#160;a sequential multiple immunofluorescence protocol which circumvents problems usually arising from the need of using primary antibodies raised in the same host species. It allows an accurate identification of all hippocampal progenitor subtypes together with a proliferation marker within a single section. These techniques are a powerful tool to study the regulation of different progenitor subtypes in parallel, their involvement in brain pathologies and their role in specific brain functions.

This video article illustrates a comprehensive protocol to detect and quantify all stages of adult hippocampal neurogenesis within the same tissue section. We elaborated a method to overcome the limitations of indirect multiple immunofluorescence that arise when suitable antibodies from different host species are unavailable.

אימונוהיסטוכימיה ותיוג מרובה עם נוגדנים ממיני Host אותו ללימוד למבוגרים בהיפוקמפוס נוירוגנזה

Adult neurogenesis is a highly regulated, multi-stage process in which new neurons are generated from an activated neural stem cell via increasingly ...

Generation of Neurospheres from Mixed Primary Hippocampal and Cortical Neurons Isolated from E14-E16 Sprague Dawley Rat Embryo

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have a robust in vitro model that can be exploited for various neurobiology studies. Though primary neuron cultures (i.e., long-term hippocampal cultures) have provided scientists with models, it does not yet represent the complexity of brain network completely. In the wake of these limitations, a new model has emerged using neurospheres, which bears a closer resemblance to the brain tissue. The present protocol describes the plating of high and low densities of mixed cortical and hippocampal neurons isolated from the embryo of embryonic day 14-16 Sprague Dawley rats. This allows for the generation of neurospheres and long-term primary neuron culture as two independent platforms to conduct further studies. This process is extremely simple and cost-effective, as it minimizes several steps and reagents previously deemed essential for neuron culture. This is a robust protocol with minimal requirements that can be performed with achievable results and further used for a diversity of studies related to neuroscience.

Presented here is a protocol for the spontaneous generation of neurospheres enriched in neural progenitor cells from high density plated neurons. During the same experiment, when neurons are plated at a lower density, the protocol also results in prolonged primary rat neuron cultures.

הדור של נוירוספירות מ מעורב היפוקמאל ראשוני ונוירונים בקליפת המוח מבודדים מ E14-E16 ספראג העובר עכברוש

Primary neuron culture is an essential technique in the field of neuroscience. To gain deeper mechanistic insights into the brain, it is essential to have ...

Immunohistochemistry Techniques to Analyze Cellular Proliferation and Neurogenesis in Rats Using the Thymidine Analog BrdU

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The immunodetection of thymidine analogs (such as 5-Bromo-2&#39;-deoxyuridine (BrdU)) is a standard technique used for visualizing these newly generated cells. Therefore, BrdU is usually injected in small animals intraperitoneally, so the thymidine analog gets incorporated into dividing cells during DNA synthesis. Detection is performed by immunohistochemical analysis of brain slices. Every research group that has been using this technique can appreciate that it requires special attention to minute details to achieve a successful stain. For instance, an important step is DNA denaturation with HCl, which allows it to reach the cell nucleus to stain it. However, the existing scientific reports describe very few of such steps in detail. Therefore, standardizing the technique is challenging for new laboratories as it can take several months to yield positive and successful outcomes. The purpose of this work is to describe and elaborate the steps to obtain positive and successful outcomes of the immunostaining technique in detail when working with the thymidine analog BrdU. The protocol includes the reagent preparation and setup, administration of thymidine analog in a rodent, transcardial perfusion, tissue preparation, peroxidase immunohistochemical reaction, use of avidin-biotin complex, immunofluorescence, counterstaining, microscopy imaging, and cell analysis.

This paper presents four of the most common techniques for visualizing BrdU positive cells to measure adult neurogenesis in rats. This work includes instructions for reagent preparation, thymidine analog administration, transcardial perfusion, tissue preparation, peroxidase immunohistochemical reaction, immunofluorescence, signal amplification, counterstaining, microscopy imaging, and cell analysis.

טכניקות אימונוהיסטוכימיה לניתוח התפשטות תאים ונוירוגנזה בחולדות באמצעות BrdU אנלוגי של תימידין

One of the most important things in the field of adult hippocampal neurogenesis (AHN) is the identification of the newly generated cells. The ...

Biology

Immunofluorescence Staining for Visualizing Proliferated Neural Stem Cells in Mouse Brain Sections

Source: Quintanilla, L. J., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/59237">Assaying Circuit Specific Regulation of Adult Hippocampal Neural Precursor Cells.</a> J. Vis. Exp. (2019)
This video demonstrates the procedure for staining newly proliferated neural stem cells in brain tissue sections using EdU incorporation, followed by immunofluorescence to visualize specific proteins, enhancing the understanding of cell dynamics and proliferation.

צביעת אימונופלואורסצנטיות להדמיית תאי גזע עצביים מתרבים באזורי מוח עכבר

All procedures involving animal samples have been reviewed and approved by the appropriate animal ethical review committee.
1. Immunohistochemistry

	...

הערכת Neurogenesis יסודי

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ברחם electroporation ואחריו תרבות עצבית ראשונית ללימוד פונקציה ג'ין בתת קבוצה של נוירונים קליפתיים

כמו תא גזע

ויזואליזציה וניתוח כמותי של אנגיוגנזה עובריים ב

תרבויות Explant עצביות מן