פרוטוקול זה יכול לשמש כדי לתאם דפוסי פעילות סידן עם ביטוי גנים ברמת התא הבודד העצמת החוקרים לחקור שאלות חדשות על היחסים בין שתי תכונות אלה. בניגוד לגישות קודמות, שבדרך כלל חוקרות רקמות שלמות, הטכניקה שלנו מתקרבת לרמת התא הבודד ומאפשרת לנו להעריך קשרים אוטונומיים בין פעילות סידן לביטוי גנים. התחל על ידי UV עיקור שתי מנות פטרי פלסטיק 35 מילימטר אחד צלחת אחת 35 מילימטר תאים תרבות במשך כ 30 דקות.
עבודה מכסה המנוע לזרימת למינאר, להוסיף 10 מיליליטר של שתי תותב סידן מילימולרית לכל אחד משני צינורות חרוט פלסטיק 50 מיליליטר, צלחת פטרי מעוקרת UV אחד, ואת צלחת תרבות התא מעוקר UV. הוסיפו שני מיליליטר של תמיסת פטרי נטולת סידן ומגנזיום לצלחת פטרי מעוקרת UV אחרת ומלאו שתי מנות פטרי מפלסטיק 100 מ"מ ותבשיל פטרי פלסטיק אחד בגודל 35 מילימטר עם 0.1X MMR בתוספת ג'נטמיצין. לאחר מכן מלאו צלחת פטרי מפלסטיק 60 מ"מ עם 70% אתנול.
מיד לפני הניתוח, ביסודיות לערבב 0.01 גרם של קולגן B לתוך צינור אחד של פתרון סידן. הוסיפו את הפתרון לצלחת פטרי פלסטיק חדשה של 60 מילימטרים ולהשתמש במיקרוסקופ מנתח כדי לזהות עוברים בשלב ההתפתחותי הרצוי. השתמש פיפטה העברה סטרילית להעביר לפחות שישה עוברים מתאימים לתוך צלחת אחת 100 מילימטר המכיל MMR בתוספת ג'נטמיצין.
ואז להעביר עובר אחד מצלחת החזקה לתוך הצלחת השנייה 100 מילימטר של MMR בתוספת ג'נטמיצין ולה מניחים את צלחת הניתוח הזה מתחת למיקרוסקופ. באמצעות זוג מטלות קהות כדי לייצב את העובר, בזהירות לקלף את קרום vitelline המקיף את העובר עם זוג מטליות בסדר. כאשר כל הממברנה הוסרה, השתמש במקלות העדינות כדי לצבוט את העובר לאורך הציר האחורי כדי להפריד בין אזורי הגב והפינה.
השתמש פיפטה העברה סטרילית חדשה כדי להעביר את החלק הגבי לצלחת 60 מילימטר של פתרון קולגן במשך 1 עד 2 דקות לפני בזהירות העברת הדגימה בחזרה לצלחת הניתוח. כדי להשלים את הניתוח, להסיר בזהירות את כל הזיהום אנדודרמלי ומסודרמלי מן הרקמה העצבית המשוערת של ectoderm ולהעביר בעדינות את explant לצלחת 35 מילימטר של פתרון סידן. כאשר נאספו שלושה מתפוצצים נוספים, השתמש במיקרופיט P1000 כדי להעביר את כל ארבעת המתפוצצים לצלחת 35 מילימטר של סידן ותוצר ללא מגנזיום המדאג להימנע מכל מגע בין המתפוצצים לבין ממשק מי האוויר.
לאחר מכן מערבבים בעדינות את המנה כך שכל המתפוצצים מתקבצים במרכז הצלחת ודגירה את הדגימות במשך שעה בטמפרטורת החדר כדי לאפשר לרקמות להתנתק. במהלך הדגירה הזו, מעבירים את שני העוברים האחרונים לצלחת השנייה של MMR עם ג'נטמיצין, ומכסים את המנה כדי לאפשר לדגימות אלה להתפתח באין מפריע. בסוף הדגירה, השתמש בדבק-על כדי לחבר כיסוי מיקרו-שליט לתחתית צלחת תרבות התאים של 35 מילימטרים ולהשתמש במיקרופיגט P100 כדי לאסוף את המתפוצצים המנותקים.
החזקת פיפטה בזווית רדודה קרוב לפני השטח של צלחת תרבות התא, למקם את קצה פיפטה בפינת הרשת פונה פנימה ולגרש בחוזקה את ההשעיה התא על פני השטח מרותק. באופן אידיאלי, התאים יתיישבו באשכול הדוק וצפוף. אפשר לתאים לדבוק בצלחת במשך שעה בטמפרטורת החדר.
בעוד התאים מתיישבים, לקבוע ולתזמן את השלב ההתפתחותי של עוברי בקרת אחים. בסוף הדגירה, מעבירים את צלחת הדגימה למיקום מוגן באור ושואבים 100 מיקרוליטר של פתרון מקצה המנה. מערבבים פתרון זה עם שבעה microliters של פתרון חומצה פלואו-4 AM Pluronic F127 מוכן טרי עם צינור למעלה ולמטה לפני החזרת נפח מלא לצלחת מדגם.
מערבבים בעדינות כדי לערבב ולכסות את הצלחת בנייר אלומיניום. לאחר שעה בטמפרטורת החדר, החלף מיליליטר אחד של צלחת תרבות explant על טבעי עם שלושה מיליליטר של טרי שני מילימול של תותבת סידן. ואז להחליף שלושה מיליליטר של על טבעי עם שלושה מיליליטר של תותבת סידן טרי פעמיים נוספות.
עבור הדמיה של פעילות סידן בתוך המתפוצצים, מניחים את לוחית הדגימה על הבמה של מיקרוסקופ קונפוקל הפוך המוגן מפני חשיפה לאור הסביבה ולהשתמש בסמן כדי לתייג את הנקודה הקדמית של הצלחת, כך שניתן יהיה למצוא את אותו שדה תצוגה במפגשי הדמיה הבאים. השתמש במטרות 10 ו -20 פעמים כדי לאתר מדגם מתחת למיקרוסקופ ולבחור שדה תצוגה מתאים שהוא צפוף תאים אך לא כל כך צפוף שהתאים מקובצים או שקשה להבחין ביניהם בנפרד. התאימו את מוקד המיקרוסקופ כך שכיסוי הרשת הנשלט יהיה גלוי, ומשנים את שדה התצוגה המקורי עד שמספר הניתן לזיהוי יהיה במסגרת לפי הצורך.
השג תמונת שדה בהיר של שדה התצוגה שנבחר כאשר הכיסוי הנשלט על-ידי הרשת נמצא במוקד ותדמית שדה בהיר של שדה התצוגה שנבחר כאשר התאים נמצאים במוקד. ללא תמונה ברורה של הכיסוי המותב ואת שדה התצוגה, לא תוכל לרשום במשותף את התאים שלך עם אלה בתמונות הדגים שתיצור מאוחר יותר. לאחר מכן להאיר את הדגימות עם לייזר 488 ננומטר.
לקבלת תמונה של שעתיים, שנה את תצורת ההדמיה כך שתקליט 901 מסגרות עם זמן סריקה של 3.93 שניות במרווח זמן של שמונה שניות לפני הפעלת התצורה כדי להשיג את התמונה. לאחר השלמת ההדמיה, הסר את הצלחת מהשלב מיקרוסקופ ולהחליף את התרבות supernatant עם מיליליטר אחד של 1X MEMFA עבור דגירה של שעתיים בטמפרטורת החדר דואג לתעד את השלב ההתפתחותי של עוברי בקרת אחים בתחילת הדגירה. הדמיה של עלילה מורכבת המכילה עקבות עבור כל התאים שתועדו בניסוי חושפת את המידה שבה מדידות בתפזורת או אוכלוסיה יכולות לטשטש דפוסים ניואנסים יותר של התנהגות spiking.
כאשר הפרופילים המוקלטים של תא בודד מבודדים, ניתן לזהות בבירור דוגמאות לפעילות ספיקינג לא סדירה האופיינית לתאי ניוון עצביים. כדי לכמת מורכבות זו, ניתן ליישם שיטות ניתוח נתונים שונות, כולל פרמטרים מגוונים להגדרת עלייה חדה. אם הצלחות מטופלות בגסות או שהשטיפה מבוצעת בעוצמה רבה מדי במהלך הפלואורסצנט בהכלאה במקום, ניתן לנתק את התאים ממשטחי הלוחות כך שלא ניתן יהיה להתאים את התאים לתמונות.
אם הפרעה זו משפיעה רק על חלק מהתאים בשדה התצוגה, ייתכן שעדיין ניתן יהיה לזהות ולהקצות חלק מהתאים בתוך התמונה. עם זאת, הכמות המרבית של נתונים הוא צבר מניסוי שבו ההכלאה מבוצעת בזהירות מעט תאים אובדים או ממוקם מחדש בין תמונות. תוצאות מניסויים איסוף פעילות סידן עם הביטוי של גנים סמן אבי עצבי יכול לחשוף קשרים רבים בין דפוסים ספציפיים של פעילות סידן פנוטיפים נוירו משדר.
עם נתונים אלה, חוקרים יכולים לחקור תכונות מורכבות יותר של דפוסי סידן דינמיים אלה ואת היחסים ביטוי גנים במקום להיות מוגבל ספירה ספייק פשוט.
