המחברים מודים שוויצרי הקרן הלאומית למדע למענק מס &#39;31003A-132358/1, 31003A_152972 ומס&#39; 151,948, ומרכז המחקר הספרדי פייר מרסייה pour la מדע.

1. הכנת כימיקלים וציוד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך 500 מיליליטר של 1% hexametaphosphate נתרן (SHMP) (Napo 3) n פתרון ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מסננים לעקר nitrocellulose (NC) (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, בקוטר 47 מ&quot;מ) על ידי מעוקר בצלחות פטרי זכוכית סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר מסנני NC (גודל נקבובית 0.22 מיקרומטר, בקוטר 25 מ&quot;מ) על ידי מעוקר בצלחות פטרי זכוכית סגורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול ולב המשקל הריק של 50 מיליליטר צינורות סטרילי (עם כובע על) (צינור אחד לדגימה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן טריס-EDTA-חיץ 1x (TE-חיץ): להפוך את הפתרון של 10 מ&quot;מ טריס (טריס aminomethane (hydroxymethyl)) וחיץ 1 mM EDTA. התאם ל- pH 8 ולעקר ידי מעוקר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון יזוזים (20 מ&quot;ג / מיליליטר) על ידי המסת 0.02 גרם של יזוזים ב 1 מיליליטר TE-חיץ. באופן אידיאלי, לעשות טרי בכל פעם. חנות ב 4 מעלות צלזיוס במשך לא יותר מ 1 בשבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון פיסיולוגי על ידי המסת 8 גרם נתרן כלורי / L(NaCl) במים מזוקקים. לעקר ידי מעוקר. </li></ol> 2. הפרדה של ביומסה ממשקעים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 3 גרם של מדגם משקעים מראש שקל סטרילי 50 מיליליטר צינורות באמצעות סקופים מתכת-בער אתנול. לבצע את זה ב, ארון בטיחות ביולוגית UV מעוקר נקי, כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 15 מיליליטר של פתרון 1% סטרילי (autoclaved) SHMP למדגם באמצעות סטרילי סיים ביורטה. פתרון SHMP גם יכול להיות מסונן כדי למנוע זיהום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Homogenize המשקעים ופתרון SHMP עם disperser הנוזלית / homogenizer (למשל, homogenizer-Turrax Ultra). 70% אתנול לעקר או החיטוי הרוטור הפיזור לפני השימוש. הפעל את המגון 1 דקות ב17,500 סל&quot;ד. תן את שאר המדגם למשך 2 דקות ולחזור על הומוגניות דקות 1 באותה מהירות הרוטור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו המדגם לעמוד במשך 10 דקות. בשלב זה, החלקיקים הכבדים ביותר (מינרלים) יישבו. התאים וכל רכיבים אורגניים של המדגם עם זאת wחולה יישאר בפתרון. לאחר מכן, להעביר את פתרון supernatant (ביומסה תא המכיל) לתוך צינור 50 מיליליטר נקי, תוך הקפדה שלא להפריע גלולה המשקעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגלולת המשקעים להוסיף שוב 15 מיליליטר של פתרון 1% סטרילי (autoclaved) SHMP באמצעות סטרילי סיים ביורטה. אז חזור על שלבים 2.3 ו -2.4. חזרה זו מבטיחה את ההפרדה מהסכום המרבי של תאים וחלקיקים אורגניים ממרכיב המינרלים של המשקעים. Supernatant של הפרדה שנייה זה יכול להיות התמזג עם supernatant מההפרדה הראשונה. הערה: כל השלבים הבאים נעשים על supernatant (המכילים ביומסה תא). רכיב המינרלים (גלולה משקעים) יכול להיות מושלך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה המדגם ב 20 XG דקות 1. צעד זה מגדיל את G-Force מספיק כדי ליישב חלקיקים מינרליים קטנים בעוד שחומר התא הביולוגי עדיין בפתרון. לאחר צנטריפוגה, להעביר את פתרון supernatant (ביומסה תא המכיל) לשפופרת 50 מיליליטר נקי. זורק את כדור המינרלים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבוע את הנפח הסופי של התמיסה המכילה ביומסה על ידי שקילת המדגם. קביעת המשקל נמנעה צורך להעביר את הדגימה לגליל סיים ומפחיתה את הסיכון לזיהום. </li></ol> 3. אוסף של ביומסה בממברנה הסינון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יחידת סינון (47 מ&quot;מ קרומי קוטר) ומשאבת ואקום. לעקר את יחידת הסינון או על ידי מעוקר או (אם פיירקס זכוכית) על ידי ריסוס אותו עם 70% אתנול ובוער זה עם מבער בונזן. תן לזה להתקרר לפני שימשיך בפרוטוקול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף קרום NC סטרילי ליחידת הסינון באמצעות מלקחיים מעוקרים-בער אתנול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף מחצית ממדגם supernatant (משלב 2.6) על גבי יחידת סינון קרום ולאסוף תאים בקרום באמצעות משאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הנוזל עבר באופן מלא דרך המסנן, לעצור את משאבת הוואקום ולהסיר בזהירות את הקרום באמצעות איתןol-להבה מעוקרת מלקחיים. מניחים את הקרום לצלחת פטרי סטרילית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותך את הקרום במחצית באמצעות מספריים מעוקרים-בער אתנול. להוסיף כל מחצית של הקרום לצינור נפרד 2 מיליליטר. מחצית מהקרום תשמש להפקת DNA וניתוח של קהילת החיידקים כולה. החצי השני של מסנן יאוחסן ב -80 ° C ומשמש כגיבוי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום קרום NC החדש על יחידת הסינון ולאסוף ביומסה מהמחצית השנייה של נפח דגימה (משלב 2.6) תוך שימוש במשאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הנוזל עבר באופן מלא דרך המסנן, לעצור את משאבת הוואקום ולהסיר בזהירות את הקרום באמצעות מלקחיים מעוקרים-בער אתנול. מניחים את כל הקרום לתוך צינור נפרד 2 מיליליטר. מדגם זה ישמש לטיפול להפריד endospores מתאי צמח. המדגם ניתן לאחסן ב -20 ° C עד לשימוש. </li></ol> 4. תמוגה של תאים גטטיבי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצעטיפול להפריד endospores מהתאים של צמח ביומסה שנאספו בעבר על קרום NC (שלב 3.6). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הקרום הוקפא, להשאיר אותו על RT במשך 10 דקות כדי להפשיר. לאחר מכן למקם את הקרום בצלחת פטרי סטרילי ולחתוך אותו (כ 4 פעמים) לחתיכות קטנות יותר באמצעות מספריים מעוקרים-בער אתנול. אז למקם את כל חלקי מסנן הקרום לתוך צינור 2 מיליליטר סטרילי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 900 ​​μl של חיץ 1x TE (טריס-EDTA) (ראה 1.5) לצינור המכיל קרום המדגם ומערבבים היטב על ידי מערבולת. בשלב זה, ביומסה היא להסיר את הקרום לפתרון TE-החיץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור בחממה על 65 מעלות צלזיוס למשך 10 דקות ו -80 סל&quot;ד. לאחר מכן להסיר את הצינור מהחממה ולתת לו להתקרר במשך 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף של ליזוזים מוכן טרי (ראה 1.5) 100 μl להגיע לריכוז סופי של 2 מ&quot;ג / מיליליטר. אל תוסיף יזוזים לפני המדגם התקרר עד 37 ° C, כמו זה יכול מעלותRade האנזים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה המדגם ב 37 מעלות צלזיוס במשך 60 דקות ו -80 סל&quot;ד, התנאים אופטימליים ליזוזים לlyse תאי צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר תמוגה הושלמה, להוסיף 250 μl של 3 הידרוקסיד N נתרן (NaOH) ו -250 μl של 6% פתרון סולפט dodecyl נתרן (SDS) לדוגמא. על ידי הוספה זו, נפח הדגימה מגיע 1.5 מיליליטר ויש ריכוז סופי של 0.5 N NaOH וריכוז סופי של 1% SDS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה זו תערובת על RT במשך 60 דקות ו -80 סל&quot;ד. הוספת הבסיס וחומרי הניקוי תעזור בתמוגה תא סופית. הריכוז של חומרי ניקוי אלה כבר מותאם כדי לא לפגוע בendospores, בעוד lysing תאי צמח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן יחידת סינון סטרילי שמחזיקה קרומי קוטר 25 מ&quot;מ על ידי מעוקר, או (אם פיירקס זכוכית) ריסוס זה עם 70% אתנול ובוער זה עם מבער בונזן. תן לזה להתקרר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח קרום 0.2 מיקרומטר NC (25 מ&quot;מ קוטר) על יחידת הסינון באמצעות מלקחיים אתנול-להבה מעוקרת. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את המדגם מהצעד 4.7 על הממברנה ולסנן את הנוזל באמצעות משאבת הוואקום. כאשר הנוזל עבר דרך, לכבות את משאבת ואקום. בשלב זה, את חומר התא וגטטיבי lysed מוסר, כפי שהוא לא שמר על הממברנה. רק endospores יישאר על הממברנה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 2 מיליליטר של תמיסה פיזיולוגית סטרילי כדי לשטוף את חומרי ניקוי שיורית ולסנן את הנוזל באמצעות משאבת הוואקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר נוזל מסונן באופן מלא, לכבות את משאבת הוואקום. השאר את הקרום ביחידת הסינון. </li></ol> 5. DNase טיפול הערה: בצע את טיפול DNase ישירות על קרום המסנן. חשובה שיחידת הסינון לא תדלוף ומשאבת הוואקום כבויה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף 450 μl של מים סטריליים, 50 μl של חיץ תגובת DNase (1x) ו -0.5 אנזים DNase μl ישירות על גבי קרום המסנן ולתת לו לעמוד במשך 15 דקות. במידת האפשר, לעשות עיכול זה בחדר שהוא מעט מלחמהmer מ RT הממוצע, מאז האנזים עובד טוב יותר בטמפרטורות של 25 מעלות צלזיוס ומעלה. הערה: שמירה על המבער בונזן צד יחידת הסינון גם מעלה את הטמפרטורה ויש יתרון הנוסף של שמירה על הסביבה סטרילית, ולכן הפחית את הסיכון לזיהום של הדגימות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר עיכול DNase הוא סיים, להפעיל משאבת ואקום כדי להסיר את האנזים מהמדגם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את האנזים שיורית על ידי הוספה וסינון 1 מיליליטר של תמיסה פיזיולוגית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם הנוזל עבר באופן מלא, לכבות את משאבת ואקום ולהסיר את הקרום המכיל מסנן endospores באמצעות מלקחיים סטרילי ולמקם אותו לתוך צלחת פטרי סטרילי. הערה: המדגם של endospores המופרד מוכן כעת לניתוח במורד הזרם. חנות ב -20 ° C אם משתמשת בו להפקת DNA או לחלופין על 4 מעלות צלזיוס אם משתמש בו לנביטה וטיפוח. </li></ol>

<ol>
	<li>Nicholson, W. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Roles+of+Bacillus+endospores+in+the+environment.">Roles of Bacillus endospores in the environment.</a> Cell Mol Life Sci. 59 (3), 410-416 (2002).</li><li>Lester, E. D., Satomi, M., Ponce, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microflora+of+extreme+arid+Atacama+Desert+soils.">Microflora of extreme arid Atacama Desert soils.</a> Soil Biol Biochem. 39 (2), 704-708 (2007).</li><li>Wilson, M. S., Siering, P. L., White, C. L., Hauser, M. E., Bartles, A. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+archaea+and+bacteria+dominate+stable+microbial+communities+in+North+America's+Largest+Hot+Spring.">Novel archaea and bacteria dominate stable microbial communities in North America's Largest Hot Spring.</a> Microb Ecol. 56 (2), 292-305 (2008).</li><li>Hugenholtz, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exploring+prokaryotic+diversity+in+the+genomic+era.">Exploring prokaryotic diversity in the genomic era.</a> Genome Biol. 3 (2), (2002).</li><li>Onyenwoke, R. U., Brill, J. A., Farahi, K., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sporulation+genes+in+members+of+the+low+G+C+Gram-type-positive+phylogenetic+branch+(Firmicutes).">Sporulation genes in members of the low G+C Gram-type-positive phylogenetic branch (Firmicutes).</a> Arch Microbiol. 182 (2-3), 182-192 (2004).</li><li>Delmont, T. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accessing+the+soil+metagenome+for+studies+of+microbial+diversity.">Accessing the soil metagenome for studies of microbial diversity.</a> Appl Environ Microbiol. 77 (4), 1315-1324 (2011).</li><li>Ricca, E., Henriques, A. O., Cutting, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bacterial spore formers: probiotics and emerging applications. , (2004).</li><li>Kuske, C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Small-Scale+DNA+Sample+Preparation+Method+for+Field+PCR+Detection+of+Microbial+Cells+and+Spores+in+Soil.">Small-Scale DNA Sample Preparation Method for Field PCR Detection of Microbial Cells and Spores in Soil.</a> Appl Environ Microbiol. 64 (7), 2463-2472 (1998).</li><li>von Mering, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+phylogenetic+assessment+of+microbial+communities+in+diverse+environments.">Quantitative phylogenetic assessment of microbial communities in diverse environments.</a> Science. 315 (8515), 1126-1130 (2007).</li><li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stage+0+sporulation+gene+A+as+a+molecular+marker+to+study+diversity+of+endospore-forming+Firmicutes.">Stage 0 sporulation gene A as a molecular marker to study diversity of endospore-forming Firmicutes.</a> Environ Microbiol Rep. 5 (6), 911-924 (2013).</li><li>Siala, A., Hill, I. R., Gray, T. R. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Populations+of+spore-forming+bacteria+in+an+acid+forest+soil,+with+special+reference+to+Bacillus+subtilis.">Populations of spore-forming bacteria in an acid forest soil, with special reference to Bacillus subtilis.</a> J General Microbiol. 81 (1), 183-190 (1974).</li><li>Brandes Ammann, A., Kolle, L., Brandl, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+bacterial+endospores+in+soil+by+terbium+fluorescence.">Detection of bacterial endospores in soil by terbium fluorescence.</a> Int J Microbiol. , 435281 (2011).</li><li>Fichtel, J., Koster, J., Rullkotter, J., Saas, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High+variations+in+endospore+numbers+within+tidal+flat+sediments+revealed+by+quantification+of+dipicolinic+acid.">High variations in endospore numbers within tidal flat sediments revealed by quantification of dipicolinic acid.</a> Geomicrobiol J. 25 (7-8), (2008).</li><li>Cronin, U. P., Wilkinson, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+potential+of+flow+cytometry+in+the+study+of+Bacillus+cereus.">The potential of flow cytometry in the study of Bacillus cereus.</a> J Appl Microbiol. 108 (1), 1-16 (2010).</li><li>de Rezende, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dispersal+of+thermophilic+Desulfotomaculum+endospores+into+Baltic+Sea+sediments+over+thousands+of+years.">Dispersal of thermophilic Desulfotomaculum endospores into Baltic Sea sediments over thousands of years.</a> ISME J. 7 (1), 72-84 (2013).</li><li>Hubert, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thermophilic+anaerobes+in+Arctic+marine+sediments+induced+to+mineralize+complex+organic+matter+at+high+temperature.">Thermophilic anaerobes in Arctic marine sediments induced to mineralize complex organic matter at high temperature.</a> Environ Microbiol. 12 (4), 1089-1104 (2010).</li><li>Garbeva, P., van Veen, J. A., van Elsas, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Predominant+Bacillus+spp.+in+agricultural+soil+under+different+management+regimes+detected+via+PCR-DGGE.">Predominant Bacillus spp. in agricultural soil under different management regimes detected via PCR-DGGE.</a> Microb Ecol. 45 (3), 302-316 (2003).</li><li>Brill, J. A., Wiegel, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differentiation+between+spore-forming+and+asporogenic+bacteria+using+a+PCR+and+southern+hybridization+based+method.">Differentiation between spore-forming and asporogenic bacteria using a PCR and southern hybridization based method.</a> J Microbiol Methods. 31 (1-2), 29-36 (1997).</li><li>Rueckert, A., Ronimus, R. S., Morgan, H. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+real-time+PCR+assay+targeting+the+sporulation+gene,+spo0A.,+for+the+enumeration+of+thermophilic+bacilli+in+milk+powder.">Development of a real-time PCR assay targeting the sporulation gene, spo0A., for the enumeration of thermophilic bacilli in milk powder.</a> Food Microbiol. 23 (3), 220-230 (2006).</li><li>Bueche, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+endospore-forming+firmicutes+by+quantitative+PCR+with+the+functional+gene+spo0A.">Quantification of endospore-forming firmicutes by quantitative PCR with the functional gene spo0A.</a> Appl Environ Microbiol. 79 (17), 5302-5312 (2013).</li><li>Wunderlin, T., Junier, T., Roussel-Delif, L., Jeanneret, N., Junier, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endospore-enriched+sequencing+approach+reveals+unprecedented+diversity+of+Firmicutes+in+sediments.">Endospore-enriched sequencing approach reveals unprecedented diversity of Firmicutes in sediments.</a> Environ Microbiol Rep. 6 (6), 631-639 (2014).</li><li>Nicholson, W. L., Law, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Method+for+purification+of+bacterial+endospores+from+soils:+UV+resistance+of+natural+Sonoran+desert+soil+populations+of+Bacillus+spp.+with+reference+to+B.+subtilis+strain+168.">Method for purification of bacterial endospores from soils: UV resistance of natural Sonoran desert soil populations of Bacillus spp. with reference to B. subtilis strain 168.</a> J Microbiol Methods. 35 (1), 13-21 (1999).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

ההתנגדות של endospores לגורמים חיצוניים אגרסיביים physicochemical (למשל, טמפרטורה או בדטרגנטים) שימשה כדי להמציא שיטה להפריד endospores חיידקים מהתאים של צמח בדגימות סביבתיות. זוהי השיטה המקיפה הראשונה לבודד endospores מדגימות סביבתיות באופן שאינו הרסני. שיטות קודמות לכמת, לזהות או ...

המטרה של עבודה זו היא לספק פרוטוקול להפרדת endospores חיידקים מתאי חיידקים וגטטיבי בדגימות סביבתיות. ההיווצרות של endospores חיידקים היא אסטרטגיית הישרדות, בדרך כלל מופעל על ידי רעב, שנמצאה במספר קבוצות חיידקים המשתייכות למשפחה החסרה 1 Firmicutes. חיידקי יוצרי Endospore נלמדים היטב, בעיקר בגלל מספר זני פתוגנים ומכאן חשיבות רפואית (למשל, anthracis Bacillus או קלוסטרידיום). זני סביבה של חיידקי יוצרי endospore היו מבודדים מכמעט כל סביבה (קרקע, מים, משקעים, בטן חיות אוויר, קרח, מעיים אנושיים, ועוד) 1-3. לכן, Firmicutes הוא המערכה הזאת השנייה בשכיחותו באוספי תרבות 4. בגלל חלבוני הקליפה חיצונית וליבת מגן הקשוח שלהם, endospores יכול לשרוד בתנאי הסביבה קיצוני החל frהתייבשות אום לקרינה גבוהה, טמפרטורות קיצוניות וכימיקלים מזיקים 5. התנגדות יוצאת דופן זה עושה את זה אתגר לחלץ DNA מendospores 6-8. זה סביר מסביר מדוע הם התעלמו במחקרי רצף סביבתי 9,10. שיטות אחרות, כגון מיקוד של endospores בדגימות סביבתיות על ידי נוגדני ניאון 11, כימות של חומצת dipicolinic (DPA) בקרקע 12 ומשקעים 13, cytometry זרימת 14 או פסטור וטיפוח לאחר מכן 15,16 כבר משמשים לאחזור או לכמת endospores ב דגימות סביבתיות. בשנים האחרונות, שיטות מיצוי DNA מותאם כמו גם פריימרים ספציפיים מולקולריים למקד רצפי גני endospore ספציפי פותחו 10,17-20. זה עזר לחשוף יותר מגוון ביולוגי בקרב קבוצה זו של חיידקים 21 וגם הוביל ליישומים בתעשייה וברפואה לצורך זיהוי של endospores, למשל באבקת חלב 19. הפרוטוקול המובא כאן מבוסס על ההבדל בהתנגדות לתנאי physicochemical מזיקים (כגון חום וחומרי ניקוי) של endospores חיידקים ביחס לתאים של צמח. להשמיד תאים של צמח במדגם, שנתקיים ברצף להחיל חום, יזוזים וריכוזים נמוכים של חומרי ניקוי. הזמן והכוח של טיפולים אלה כבר מותאמים כדי לא להרוס את הנבגים, אבל לlyse כל תאי הצמח. תאים מסוימים בבריכת תא סביבתית הם עמידים יותר מאחרים, ולכן כדי להגדיל את ההסתברות של השמדת כל התאים של הצמח, אנו מיישמים את שלושה טיפולים שונים. היתרון והחידוש של שיטה זו הוא שendospores לאחר הטיפול הוא עדיין שלם ויכול לשמש לניתוח נוסף במורד הזרם. אלה כוללים מיצוי DNA, PCR (qPCR) וamplicon או רצף metagenomic (מיקוד במיוחד הקבוצה של endospores וכך להקטין דiversity, תוך הגדלת כיסוי). Endospores יכול לשמש גם לטיפוח או כימות על ידי מיקרוסקופ פלואורסצנטי במורד הזרם, cytometry זרימה, או זיהוי של DPA. תכונה חשובה של שיטה זו היא שעל ידי השוואת מדגם שלא טופל עם מדגם מטופלים, אחד יכול להסיק את הכמות ומגוון של endospores במדגם סביבתי בנוסף לרכיב המקביל לשל צמח תאים.

<table><tbody><tr><td>Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 &amp;#956;m pore size, 47 mm diameter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182004 Aldrich&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Tris(hydroxymethyl)aminomethane</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>252859 Sigma-Aldrich</td><td>CAS 77-86-1</td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E9884 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&amp;nbsp; 60-00-4&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Lysozyme from chicken egg white</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>62971 Fluka</td><td>powder, CAS&amp;nbsp; 12650-88-3&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Ultra-Turrax homogenizer T18 basic</td><td>IKA</td><td>3720000</td><td></td></tr><tr><td>Glass filter holders for 47&amp;nbsp;mm membranes, Pyrex glass</td><td>EMD Millipore</td><td>XX10 047 00</td><td></td></tr><tr><td>Chemical duty vacuum pump</td><td>Millipore</td><td>WP6122050</td><td>220 V/50 Hz</td></tr><tr><td>Manifold sampling filtration for 25&amp;nbsp;mm membranes</td><td>Millipore</td><td>1225 Sampling Manifold</td><td>polypropylene</td></tr><tr><td>Dnase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0303S</td><td>Rnase free</td></tr><tr><td>NaOH</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5881 Sigma-Aldrich</td><td>CAS&amp;nbsp; 1310-73-2&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Sodium dodecyl sulfphate (SDS)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L3771 Sigma&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Whatman nitrocellulose membrane filters, 0.2 &amp;#956;m pore size, 25 mm diameter</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>WHA7182002 Aldrich</td><td></td></tr></tbody></table>

physical isolation of endospores from environmental samples by targeted lysis of vegetative cells

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a morpho-physiological resting state that enhances survival under adverse environmental conditions. Even though endospore-forming Firmicutes are one of the most frequently enriched and isolated bacterial groups in culturing studies, they are often absent from diversity studies based on molecular methods. The resistance of the spore core is considered one of the factors limiting the recovery of DNA from endospores. We developed a method that takes advantage of the higher resistance of endospores to separate them from other cells in a complex microbial community using physical, enzymatic and chemical lysis methods. The endospore-only preparation thus obtained can be used for re-culturing or to perform downstream analysis such as tailored DNA extraction optimized for endospores and subsequent DNA sequencing. This method, applied to sediment samples, has allowed the enrichment of endospores and after sequencing, has revealed a large diversity of endospore-formers in freshwater lake sediments. We expect that the application of this method to other samples will yield a similar outcome.

התוצאות שהוצגו כאן כבר פורסמה קודם לכן 10,21. אנא עיין במאמרים אלה לפרשנות והדיון הסביבתיים של נתונים. ההליך הכולל מסוכם באיור 1 ומתאים לשלושה שלבים עיקריים: ראשון, ההפרדה של ביומסה ממשקעים או כל מטריצה ​​סביבתית אח?...

Watch this Scientific Journal Video about Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells at JoVE.com

Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

בידוד פיזי של Endospores מדגימות סביבתיות על ידי תמוגה ממוקדת של תאים גטטיבי

Endospore formation is a survival strategy found among some bacteria from the phylum Firmicutes. During endospore formation, these bacteria enter a ...

physical-isolation-endospores-from-environmental-samples-targeted

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Environment

14.1K Views.  Macquarie University. A method to single out bacterial endospores from complex microbial communities was developed to perform tailored culture or molecular studies of this group of bacteria.

Video: Physical Isolation of Endospores from Environmental Samples by Targeted Lysis of Vegetative Cells

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is a significant nosocomial pathogen. C. difficile is notoriously difficult to isolate and cultivate and is extremely sensitive to even low levels of oxygen in the environment. Here, methods for isolating C. difficile from fecal samples and subsequently culturing C. difficile for preparation of glycerol stocks for long-term storage are presented. Techniques for preparing and enumerating spore stocks in the laboratory for a variety of downstream applications including microscopy and animal studies are also described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which maintains a consistent anaerobic environment to ensure proper conditions for optimal C. difficile growth. We provide protocols for transferring materials in and out of the chamber without causing significant oxygen contamination along with suggestions for regular maintenance required to sustain the appropriate anaerobic environment for efficient and consistent C. difficile cultivation.

Culturing and Maintaining Clostridium difficile in an Anaerobic Environment

Clostridium difficile is a pathogenic bacterium that is a strict anaerobe and causes antibiotic associated diarrhea (AAD). Here, methods for isolating, culturing and maintaining C. difficile vegetative cells and spores are described. These techniques necessitate an anaerobic chamber, which requires regular maintenance to ensure proper conditions for optimal C. difficile cultivation.

Culturing ושמירה<em&gt; Difficile Clostridium</em&gt; בסביבת אנאירובית

Clostridium  difficile is a Gram-positive, anaerobic, sporogenic bacterium  that is primarily responsible for antibiotic associated diarrhea (AAD) and is ...

Immunology and Infection

Isolation, Propagation, and Identification of Bacterial Species with Hydrocarbon Metabolizing Properties from Aquatic Habitats

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous catalytic enzymes and are naturally capable of metabolizing hydrocarbons. Scientists harness biodiversity in aquatic ecosystems to isolate bacteria with biodegradation and bioremediation potential. Such isolates from the environment provide a rich set of metabolic pathways and enzymes, which can be further utilized to scale up the degradation process at an industrial scale. In this article, we outline the general process of isolation, propagation, and identification of bacterial species from aquatic habitats and screen their ability to utilize hydrocarbons as the sole carbon source in vitro using simple techniques. The present protocol describes the isolation of various bacterial species and their subsequent identification using the 16S rRNA analysis. The protocol also presents steps for characterizing the hydrocarbon degrading potential of bacterial isolates. This protocol will be useful for researchers trying to isolate bacterial species from environmental habitats for their biotechnological applications.

We present the process of isolating, propagating, and characterizing hydrocarbon-degrading bacteria from aquatic habitats. The protocol outlines bacterial isolation, identification by the 16S rRNA method, and testing of their hydrocarbon-degrading potential. This article would help researchers in characterizing microbial biodiversity in environmental samples, and specifically screen for microbes with bioremediation potential.

בידוד, ריבוי וזיהוי של מיני חיידקים בעלי תכונות מטבוליזם פחמימני מבתי גידול מימיים

Hydrocarbon pollutants are recalcitrant to degradation and their accumulation in the environment is toxic to all life forms. Bacteria encode numerous ...

Detecting Cortex Fragments During Bacterial Spore Germination

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming bacterium, Bacillus subtilis. Germination is triggered by small molecule germinants and occurs without the need for macromolecular synthesis. Though differences exist between the mechanisms of spore germination in species of Bacillus and Clostridium, a common requirement is the hydrolysis of the peptidoglycan-like cortex which allows the spore core to swell and rehydrate. After rehydration, metabolism can begin and this, eventually, leads to outgrowth of a vegetative cell. The detection of hydrolyzed cortex fragments during spore germination can be difficult and the modifications to the previously described assays can be confusing or difficult to reproduce. Thus, based on our recent report using this assay, we detail a step-by-step protocol for the colorimetric detection of cortex fragments during bacterial spore germination.

Herein, we describe a colorimetric assay to detect the presence of reducing sugars during bacterial spore germination.

זיהוי Cortex שבר במהלך בקטריאלי Spore נביטה

The process of endospore germination in Clostridium difficile, and other Clostridia, increasingly is being found to differ from the model spore-forming ...

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence microscopy. Super-resolution three-dimensional Structured Illumination Microscopy (3D-SIM) is a promising tool to overcome this hurdle and reveal the molecular details of the process of germination of Bacillus subtilis (B. subtilis) spores. Here, we describe the use of a modified SIMcheck (ImageJ)-assistant 3D imaging process and fluorescent reporter proteins for SIM microscopy of B. subtilis spores&#8217; germinosomes, cluster(s) of germination proteins. We also present a (standard)3D-SIM imaging procedure for FM4-64 staining of B. subtilis spore membranes. By using these procedures, we obtained unsurpassed resolution for germinosome localization and show that &#62;80% of B. subtilis KGB80 dormant spores obtained after sporulation on defined minimal MOPS medium have one or two GerD-GFP and GerKB-mCherry foci. Bright foci were also observed in FM4-64 stained spores&#8217; 3D-SIM images suggesting that inner membrane lipid domains of different fluidity likely exist. Further studies that use double labeling procedures with membrane dyes and germinosome reporter proteins to assess co-localization and thus get an optimal overview of the organization of Bacillus germination proteins in the inner spore membrane are possible.

Visualization of Germinosomes and the Inner Membrane in Bacillus subtilis Spores

Germinant receptor proteins cluster in &#8216;germinosomes&#8217; in the inner membrane of Bacillus subtilis spores. We describe a protocol using super resolution microscopy and fluorescent reporter proteins to visualize germinosomes. The protocol also identifies spore inner membrane domains that are preferentially stained with the membrane dye FM4-64.

ויזואליזציה של Germinosomes, את הקרום הפנימי בנבגים Bacillus subtilis

The small size of spores and the relatively low abundance of germination proteins, cause difficulties in their microscopic analyses using epifluorescence ...

Bioengineering

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure plasma (LPP) discharges contain a broad spectrum of active species, which lead to rapid microbial inactivation. To study the efficiency and mechanisms of sterilization by LPP, we use spores of the test organism Bacillus subtilis because of their extraordinary resistance against conventional sterilization procedures. We describe the production of B. subtilis spore monolayers, the sterilization process by low pressure plasma in a double inductively coupled plasma reactor, the characterization of spore morphology using scanning electron microscopy (SEM), and the analysis of germination and outgrowth of spores by live cell microscopy. A major target of plasma species is genomic material (DNA) and repair of plasma-induced DNA lesions upon spore revival is crucial for survival of the organism. Here, we study the germination capacity of spores and the role of DNA repair during spore germination and outgrowth after treatment with LPP by tracking fluorescently-labelled DNA repair proteins (RecA) with time-resolved confocal fluorescence microscopy. Treated and untreated spore monolayers are activated for germination and visualized with an inverted confocal live cell microscope over time to follow the reaction of individual spores. Our observations reveal that the fraction of germinating and outgrowing spores is dependent on the duration of LPP-treatment reaching a minimum after 120 s. RecA-YFP (yellow fluorescence protein) fluorescence was detected only in few spores and developed in all outgrowing cells with a slight elevation in LPP-treated spores. Moreover, some of the vegetative bacteria derived from LPP-treated spores showed an increase in cytoplasm and tended to lyse. The described methods for analysis of individual spores could be exemplary for the study of other aspects of spore germination and outgrowth.

Investigating the Detrimental Effects of Low Pressure Plasma Sterilization on the Survival of Bacillus subtilis Spores Using Live Cell Microscopy

This protocol illustrates the important consecutive steps required to assess the relevance of monitoring vitality parameter and DNA repair processes in reviving Bacillus subtilis spores after treatment with low pressure plasma by tracking fluorescence-labelled DNA repair proteins via time-resolved confocal microscopy and scanning electron microscopy.

חוקרים את מזיקה אפקטים של נמוך לחץ פלזמה עיקור על ההישרדות של Bacillus subtilis הנבגים באמצעות Live התא מיקרוסקופ

Plasma sterilization is a promising alternative to conventional sterilization methods for industrial, clinical, and spaceflight purposes. Low pressure ...

Biology

Investigating Teliospore Germination Using Microrespiration Analysis and Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are thick-walled dispersal agents. Teliospores can remain dormant for decades. The dormancy is characterized by low metabolic rates, paused macromolecular biosynthesis and greatly reduced levels of respiration. Upon receiving required environmental signals, teliospores germinate to produce haploid cells, which can initiate new rounds of infection. Teliospore germination is characterized by the resumption of macromolecular biosynthesis, increased respiration and dramatic morphological changes. In order to precisely measure changes in cellular respiration during the early stages of germination, we have developed a simple protocol employing a Clark-type respirometer. The later stages of germination are distinguished by specific morphological changes, but germination is asynchronous. We developed a microdissection technique that enables us to collect teliospores at distinct germination stages.

Smut fungi cause many devastating agricultural diseases. They are dispersed as dormant teliospores that germinate in response to environmental cues. We outline two methods to investigate molecular changes during germination: measuring respiration increase to detect metabolic activation and assessing changing molecular events by isolating teliospores at distinct morphological stages.

חוקרים נביטה Teliospore באמצעות ניתוח Microrespiration ו- Microdissection

Smut fungi are the etiological agents of several devastating agricultural diseases. They are characterized by the production of teliospores, which are ...

Isolation and Selection of Entomopathogenic Fungi from Soil Samples and Evaluation of Fungal Virulence against Insect Pests

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important to isolate and select indigenous EPF. Therefore, the soil bait method combined with the insect bait (mealworm, Tenebrio molitor) system was used in this study with some modifications. The isolated EPF were then subjected to the virulence test against the agricultural pest Spodoptera litura. Furthermore, the potential EPF strains were subjected to morphological and molecular identifications. In addition, the conidia production and thermotolerance assay were performed for the promising EPF strains and compared; these data were further substituted into the formula of effective conidia number (ECN) for laboratory ranking. The soil bait-mealworm system and the ECN formula can be improved by replacing insect species and integrating more stress factors for the evaluation of commercialization and field application. This protocol provides a quick and efficient approach for EPF selection and will improve the research on biological control agents.

Here we present a protocol based on the&#160;mealworm (Tenebrio molitor)-bait system that was used for isolating and selecting entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. An effective conidia number (ECN) formula is used to select high stress tolerant EPF based on physiological characteristics for pest microbial control in the field.

בידוד ובחירה של פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע והערכה של אלימות פטרייתית נגד מזיקי חרקים

Entomopathogenic fungi (EPF) are one of the microbial control agents for integrated pest management. To control local or invasive pests, it is important ...

Comparison of Methods for Isolating Entomopathogenic Fungi from Soil Samples

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic fungi (EPF) from soil samples. The soil is a rich habitat for microorganisms, including EPF particularly belonging to the genera Metarhizium and Beauveria, which can regulate arthropod pests. Biological products based on fungi are available in the market mainly for agricultural arthropod pest control. Nevertheless, despite the high endemic biodiversity, only a few strains are used in commercial bioproducts worldwide. In the present study, 524 soil samples were cultured on potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium). The growth of fungal colonies was observed for 3 weeks. All Metarhizium and Beauveria EPF were morphologically identified at the genus level. Additionally, some isolates were molecularly identified at the species level. Twenty-four out of these 524 soil samples were also surveyed for EPF occurrence using the insect bait method (Galleria mellonella and Tenebrio molitor). A total of 51 EPF strains were isolated (41 Metarhizium spp. and 10 Beauveria spp.) from the 524 soil samples. All fungal strains were isolated either from croplands or grasslands. Of the 24 samples selected for comparison, 91.7% were positive for EPF using Galleria bait, 62.5% using Tenebrio bait, and 41.7% using CTC. Our results suggested that using insect baits to isolate the EPF from the soil is more efficient than using the CTC medium. The comparison of isolation methods in addition to the identification and conservation of EPF has a positive impact on the knowledge about biodiversity. The improvement of EPF collection supports scientific development and technological innovation.

Entomopathogenic fungal colonies are isolated from tropical soil samples using Tenebrio bait, Galleria bait, as well as selective artificial medium, i.e., potato dextrose agar enriched with yeast extract supplemented with chloramphenicol, thiabendazole, and cycloheximide (CTC medium).

השוואה בין שיטות לבידוד פטריות אנטומופתוגניות מדגימות קרקע

The goal of the present study is to compare the effectiveness of using insect baits versus artificial selective medium for isolating entomopathogenic ...

Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular fungi such as molds and unicellular fungi, broadly defined as yeasts, fulfill essential roles in soil ecosystems as decomposers of organic material and as food sources for other soil dwellers. Fungal species diversity in soil is dependent on a multitude of climatic factors such as rainfall and temperature, as well as soil properties including organic matter, pH, and moisture. Lack of adequate environmental sampling, especially in regions of Asia, Africa, South America, and Central America, hinders the characterization of soil fungal communities and the discovery of novel species. 
We characterized soil fungal communities in nine countries across six continents using ~4,000 soil samples and a protocol developed in the laboratory for the isolation of yeasts and molds. This protocol begins with separate selective enrichment for yeasts and the medically relevant mold Aspergillus fumigatus, in liquid media while inhibiting bacterial growth. Resulting colonies are then transferred to solid media and further processed to obtain pure cultures, followed by downstream genetic characterization. Yeast species identity is established via sequencing of their internal transcribed spacer (ITS) region of the nuclear ribosomal RNA gene cluster, while global population structure of A. fumigatus is explored via microsatellite marker analysis. 
The protocol was successfully applied to isolate and characterize soil yeast and A. fumigatus populations in Cameroon, Canada, China, Costa Rica, Iceland, Peru, New Zealand, and Saudi Arabia. These findings revealed much-needed insights on global patterns in soil yeast diversity, as well as global population structure and antifungal resistance profiles of A. fumigatus. This paper presents the method of isolating both yeasts and A. fumigatus from international soil samples.

This protocol is an effective, speedy method of culturing yeasts and the mold Aspergillus fumigatus from large sets of soil samples in as little as 7 days. The methods can be easily modified to accommodate a range of incubation media and temperatures as needed for experiments.

בידוד של שמרים ועובשים הניתנים לעיבוד מאדמות כדי לחקור את מבנה האוכלוסייה הפטרייתית

Soil is host to an incredible amount of microbial life, with each gram containing up to billions of bacterial, archaeal, and fungal cells. Multicellular ...

Isolation, Characterization, and Total DNA Extraction to Identify Endophytic Fungi in Mycoheterotrophic Plants

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as any other vital resource, the fungi with which these plants intimately associate are essential for them. Hence, some of the most relevant techniques in studying mycoheterotrophic species are the ones that enable the investigation of associated fungi, especially those inhabiting roots and subterranean organs. In this context, techniques for identifying culture-dependent and culture-independent endophytic fungi are commonly applied. Isolating fungal endophytes provides a means for morphologically identifying them, analyzing their diversity, and maintaining inocula for applications in the symbiotic germination of orchid seeds. However, it is known that there is a large variety of non-culturable fungi inhabiting plant tissues. Thus, culture-independent molecular identification techniques offer a broader cover of species diversity and abundance. This article aims to provide the methodological support necessary for starting two investigation procedures: a culture-dependent and an independent one. Regarding the culture-dependent protocol, the processes of collecting and maintaining plant samples from collection sites to laboratory facilities are detailed, along with isolating filamentous fungi from subterranean and aerial organs of mycoheterotrophic plants, keeping a collection of isolates, morphologically characterizing hyphae by slide culture methodology, and molecular identification of fungi by total DNA extraction. Encompassing culture-independent methodologies, the detailed procedures include collecting plant samples for metagenomic analyses and total DNA extraction from achlorophyllous plant organs using a commercial kit. Finally, continuity protocols (e.g., polymerase chain reaction [PCR], sequencing) are also suggested for analyses, and techniques are presented here.

The current article aims to provide detailed and adequate protocols for the isolation of plant-associated endophytic fungi, long-term preservation of isolates, morphological characterization, and total DNA extraction for subsequent molecular identification and metagenomic analyses.

בידוד, אפיון ומיצוי DNA כולל לזיהוי פטריות אנדופיטיות בצמחים מיקוהטרוטרופיים

Mycoheterotrophic plants present one of the most extreme forms of mycorrhizal dependency, having totally lost their autotrophic capacity. As essential as ...