This research was supported by research grants RO1CA109545 and RO1CA086984 to M.S.S. by the National Institutes of Health/National Cancer Institute and by an award from the Leo and Ann Albert Charitable Trust (to M.S.S.).

כל המחקרים vivo ב אושרו על ידי האוניברסיטה של טיפול בבעלי חיים נוטרדאם ועדת שימוש והשתמשו עכברות C57 / BL6J. 1. תרבית תאים Murine סרטן השחלות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפוך את מדיום תרבית תאי סרטן שחלות murine ID8 כדלקמן: 1 ליטר של בינוני הנשר השונה של Dulbecco (DMEM) השלים עם 4% עובריים שור סרום (FBS), 1% פניצילין / סטרפטומיצין, 5 מיקרוגרם / אינסולין מיליליטר, 5 מיקרוגרם / מיליליטר transferrin ו 5 ng / ml נתרן סלניט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Transduce תאים סרטניים בשחלות murine ID8 13 לבטא חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) באמצעות חלקיקי lentiviral רכש מסחרי מבטאי RFP ועם סמן בחירה (blasticidin גן). שים לב חלבון פלואורסצנטי ירוק ניתן להשתמש, אבל מספק אותות הקרינה חלשה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסמוך לפני התמרה, תרבות תאים 50 - 70% מפגש ולהוסיף בינוני טרי (ללא פניצילין / סטרפטומיצין) הכולל 1 מיליליטר polybrene (5 מיקרוגרם / מיליליטר סופיריכוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות פיפטה RFP-lentivirus (20 μl) dropwise לתוך צלחת לדגור על 37 מעלות צלסיוס למשך 72 שעות. הסר בינוני דגירה עם מדיום חדש למשך 24 שעות. להתחיל לבחור תאים transduced ידי הוספת blasticidin עד בינוני התרבות (5 מיקרוגרם / מ&quot;ל), ויעקוב אחרי התאים האדומים באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי (figure1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרבות התאים מתויג RFP במדיום ID8 ידי זריעה כ 10 6 תאים לתוך צלחת בתרבית רקמה באופן חזותי באמצעות ימי מיקרוסקופ אור עד monolayer התא הוא ומחוברות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר ומחוברות, למסוק את התאים באמצעות טריפסין (0.25%, 3 דקות) ולחזור הבקבוק אל האינקובטור 37 מעלות צלסיוס עד שהתאים מנותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנטרל את טריפסין עם 6 מ&quot;ל של מדיום תרבות ID8 המכילה סרום. פיפטה מעלה ומטה כנגד בתחתית הצלחת, ולאחר מכן להעביר צינור חרוטי 15 מ&quot;ל. צנטריפוגה ב 1200 סל&quot;ד במשך 2 דקות, ולאחר מכן לשאוב את המדיום באמצעות GLפיפטה תחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטפים את התאים עם בופר פוספט (PBS) על ידי resuspending בעדינות 6 מ&quot;ל PBS חם צנטריפוגה כמו 1.5 לעיל. Re- להשעות ב PBS לריכוז סופי של 5 x 10 6 תאים / מ&quot;ל. שמור את התאים חמים (37 מעלות צלסיוס) עד הזרקה. </li></ol> 2. תוך הצפק הזרקה של תאים ID8 בתחום ההדמיה vivo <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להזריק כל עכבר עם 2 מ&quot;ל של הפתרון ID8-PBS חם עבור סכום כולל של 10 מיליון תאים באמצעות הזרקה תוך הצפק (IP). אפשר תאים סרטניים לגדול in vivo במשך כ -10 שבועות עם הדמיה חייה מדי שבוע. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מיד לאחר ההזרקה ובכל שבוע לאחר מכן, לשקול את העכברים ואז להרדים כל העכבר באמצעות isofluorane (קצב הזרימה של 2.5% ב 0.5 L / min O 2 זרימה). הערה: עכברים נשקלו, ולא כמדד כמותי של נטל הגידול, אלא מדד כללי יותר של התקדמות פיזית עכבר הפרט לאורך כל תקופת המחקר. עכברים לשקולts הושוו עם ערכים למשקל הקודם שלהם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים עכברים על ידי הנחת בתא isofluorane. לשמור על הרדמה קבועה בזמן סריקה על ידי מיצוב ראש העכבר בחרוט האף לחשיפה isofluorane קצב זרימה 2.5% לאורך כל ההליך. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש קרם מקריח כדי להסיר את השיער על הגוף והבטן של כל עכבר, כמו השיער השחור יגרום הנחתה של אות הקרינה. עכברים שטופים במים חמים לאחר היישום של קרם המקריח מיובש עם מגבות נייר RT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד מורדם, לסרוק את כל הגוף של כל עכבר באמצעות מערכת דימות אופטי חיה קטנה. סרוק את כל העכברים במדגם בכל נקודת זמן. השתמש בפרוטוקול השני בשלב הבא (איור 2 א): <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב 1, להתבונן שכותרתו fluorescently (RFP) תאים סרטניים, לבצע רכישה multispectral לגבות סך של 5 תמונות באמצעות מסננים עירור של 440 ננומטר, 460 ננומטר, 480 ננומטר, 520 ננומטר ו -540 ננומטר, ואת מסנן פליטה של ​​600 ננומטר. השתמש פרמטרי רכישת הבאים: חשיפה רמה 15 שניות, 2 x 2 binning, FOV של 160 מ&quot;מ, f stop של 1.1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב 2, להתבונן על חית כולה, לרכוש תמונת החזרה באמצעות מסנן עירור פתוח (אור לבן), מסנן פליטה פתוח, חשיפה סטנדרטית של 0.2 שניות עם binning 2 x 2 ו FOV של 16 סנטימטר. שים לב: בפעם הדמיה בפועל הוא ~ 1 דק &#39;. </li></ol></li></ol> 3. עכבר Dissection ו Image Acquisition <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הדמיה לחיות מראת הנוכחות של הצטברות תערוכה תוך הצפק מחלה או חיות נרחבות של מיימת (כפי שמעידים נפיחות בטנית), פסד או רווח של משקל גוף יותר מ -20%, עייפות או סימנים אחרים של מצוקה, להרדים כל עכבר באמצעות CO 2 הרדמה ואחריו נקע בצוואר הרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את העור anteriorly לאורך קו האמצע הגחון של העכבר, באמצעות dissectio מחודדn מספרי, מהחלק העליון של הירכיים לתחתיות כלוב הצלעות. קח בזהירות רבה כדי לחתוך רק את שכבת העור (איור 2Bi). בעדינות להפריד את העור מרקמת הצפק, להיות בטוח שלא לנקב את קיר הבטן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת מספריים לנתיחה מחודדים, לחתוך רוחבי הוא בחלק התחתון של כלוב הצלעות והחלק העליון של הירכיים ליצור שני קפלי העור (איור 2 ב II, III). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח כל עכבר בצד הגחון שלו (חלל הצפק פונה כלפי מטה) עם שולי העור ופתח ולסרוק כל עכבר עם מוסדותיה באתרו באמצעות מערכת דימות אופטי חיה הקטנה (איור 3 א &#39;, ב&#39;). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו הפרמטרים רכישת תמונה כמתואר-2.4.2 2.4.1.. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המשך ביתור את העכבר על ידי לחילוץ איברים הצפק בודדים כולל כבד, omentum / לבלב, קיבה, סרעפת, מעי דק, מעי גס, שמאלה הצפק תקינים, שחלות, kidneys, לפדר ואת כרית השומן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים לב, למנות, ולהקליט גידולים גלויים על כל איבר. השתמש קליפר למדוד את הקוטר של כל גידול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעד גידולים פחות מ -2 מ&quot;מ קוטר קטנים, בין 2 ו -5 מ&quot;מ כבינוני ו יותר מ -5 מ&quot;מימ כמו גדולים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניח את האיברים על תבנית סריקת איבר (איור 4) שמזהה במיקום קבוע מראש עבור כל איבר. השתמש PBS לשמור על האיברים לחים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סרוק כל גיליון של איברים באמצעות מערכת דימות אופטי חיה הקטנה (איור 3 ג, ד). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באותו הפרמטרים רכישת תמונה כמתואר בשלב 2.4. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר סריקה, איברי המקום בפורמלין 10% כדי לאפשר עיבוד עוקב עבור היסטולוגיה. </li></ol> כימות 4. נטל הגידול ב התמונות דואר קרינה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להפחית את כמות קרינה אוטומטית בכל סריקת multispectral, ראשון unmix את הקבצים באמצעות תוכנה זמינה עם מערכת הדמית חיה הקטנה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען תחילה RFP: בקובץ ספקטרלי Vivo, ואחריו Autofluor: בתיק האדום Vivo בחלון תמונות צרוף ובחר Unmix. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את הקבצים .bip כמו 16 ביט .tiff (ללא שינוי) הפורמט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנת ImageJ (לשעבר vivo איברים ואז גוף העכבר המלא עם איברים באתרו). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באפשרות קובץ&gt; פתיחה כדי לפתוח את קבצי .tiff 16 ביט של קבצי תבנית סריקת איבר ImageJ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תמונה&gt; התאם&gt; הבהירות / ניגודיות, לבחור להגדיר את המינימום מוצג ערך ל -0 ואת המקסימום הוצג ערך 35,353 ולאחר מכן, תחתשולחנות תמונה&gt; בדיקה, בחרו רד הוט. הערה: מודלים של בעלי חיים שונים ידרשו רמות בהירות שונות, אך חשוב לשמור על הבהירות העקבית לאורך מחקר נתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת כלי הבחירה Freehand, לצייר באזור צורה חופשית של מבחר עניין (ROI) סביב כל איבר ולהשתמש בכלי מדידה (CTRL + M) כדי לחשב את שטח הפנים של כל איבר; להקליט את שטח הפנים של כל איבר בגיליון אלקטרוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם ROI נמשך סביב כל איבר, קליק ימני בתוך ROI ובחר שכפלו לכלול רק האיבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעוד אני מסתכל על האיבר היחיד, תחת תמונה&gt; התאם&gt; סף, לבחור כדי לקבוע את הסף של התמונה לרמת סף תחתונה של + 1200 רמת סף עליונה של + 1700 בחר only האזורים הכי בהיר קורנים ולבדוק כדי לבחור רקע כהה; ובחר אישור. הערה: התמונות עשויות לדרוש מניפולציה ידנית של מחווני סף ImageJ כך שהאזורים הבהירים בעבר נבחרו לשלב ניתוח, כפי שפורטה לעיל. מודלי מחלה שונים ידרשו מגבלות סף שונות, אך חשוב לשמור על רמות הסף אחידות בכל מחקר נתון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת לנתח&gt; לנתח חלקיקים, לשנות את גודל (פיקסלים ^ 2) עד 10-אינפיניטי, לבחור התכנית: מתאר, לבדוק כדי לבחור רק &quot;הצג תוצאות&quot; ולחץ על אישור כדי למדוד גם את תחומי וצפיפות משולבת הגלם של אזורים בהירים אלה, גידולים ייחשבו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רשום את הערכים של שטח פנים ואת הצפיפות המשולבת גלם של כל מבחר גידול המוצגים <sטרונג&gt; שולחן תוצאות באותו גיליון אלקטרוני המכיל את שטח פנים איברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת לנתח&gt; כלים&gt; בר כיול, להוסיף סרגל מידת כיול לתמונות של האיברים. הערה: בדוגמה זו, זה נעשה על ידי שינוי מיקום עליון מימין, צבע המילוי השחור, צבע לייבל ווייט, מספר התוויות עד 5, עשרוני מקומות 0, גודל גופן 12 ואת זום פקטור ל -4.0 ולאפשר טקסט מודגש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת קובץ&gt; שמירה בשם ..., שמור את מונטאז בתור .TIFF וכן JPEG. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באפשרות קובץ&gt; פתיחה כדי לפתוח את הקובץ בפורמט JPEG של האברים ולאחר מכן, תחת הוספה &lt;תיבת טקסט </strong&gt;, להוסיף תוויות איבר ידי יצירת תיבת טקסט מתחת לכל אחת משלוש שורות של איברים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש באפשרות קובץ&gt; פתיחה כדי לפתוח את כל 16 קבצי .tiff קצת סריקות הגוף המלאות ב ImageJ לפי סדר מספר עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת תמונה&gt; התאם&gt; הבהירות / ניגודיות, לבחור להגדיר את המינימום מוצג ערך ל -0 ואת המקסימום הוצג ערך + 35,353 ולאחר מכן, תחת &#39;תמונה&#39;&gt; שולחנות בדיקה, בחרו רד הוט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת קובץ&gt; שמירה בשם ..., שמור את מונטאז &#39;בתור. Tiff וכן JPEG. </li></ol></li></ol> ניתוח 5. נתונים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיף את אזורי בחירת גידול צפיפויות משולבות גלם, בהתאמה, עבור כל איבר של כל עכבר ולהקליט את אזור גידול איבר הכולל עבור כל עכבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנרמל באזור הקליט integrat גלםערכי צפיפות ed עבור הגודל של כל איבר על ידי חלוקת שטח הגידול הכולל וערכי צפיפות משולבים הכוללים גלם על ידי שטח פן איבר המתאים (טבלת 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחשב ולתכנן את הממוצע של שני אזורי משטח גידול המנורמלים ואת ערכי צפיפות המנורמלים גלם המשולב (איור 5 א &#39;, ב&#39;). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השוואת ערכים ממוצעים אלה לאלה שהושגו על ידי חזותית לספור את הגידולים שהיו גלויים לעין בלתי מזוינת במהלך הבדיקה של כל איבר עבור גרורות. </li></ol>

<ol>
	<li>Lengyel, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+development+and+metastasis.">Ovarian cancer development and metastasis.</a> American Journal of Pathology. 177 (3), 1053-1064 (2010).</li><li>Halkia, E., Spiliotis, J., Sugarbaker, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnosis+and+management+of+peritoneal+metastases+from+ovarian+cancer.">Diagnosis and management of peritoneal metastases from ovarian cancer.</a> Gastroenterology Research and Practice. 2012, 541842-541854 (2012).</li><li>Barbolina, M. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microenvironmental+regulation+of+ovarian+cancer+metastasis.">Microenvironmental regulation of ovarian cancer metastasis.</a> Cancer Treatment and Research. 149, 319-334 (2009).</li><li>Lengyel, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epithelial+ovarian+cancer+experimental+models.">Epithelial ovarian cancer experimental models.</a> Oncogene. 33 (28), 3619-3633 (2014).</li><li>Harter, P., duBois, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+surgery+in+ovarian+cancer+with+special+emphasis+on+cytoreductive+surgery+for+recurrence.">The role of surgery in ovarian cancer with special emphasis on cytoreductive surgery for recurrence.</a> Current Opinion in Oncology. 17 (5), 505-514 (2005).</li><li>Bristow, R. E., Puri, I., Chi, D. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoreductive+surgery+for+recurrent+ovarian+cancer:+a+meta-analysis.">Cytoreductive surgery for recurrent ovarian cancer: a meta-analysis.</a> Gynecologic Oncology. 112 (1), 265-274 (2009).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+metastatic+cancer+with+fluorescent+proteins.">In vivo imaging of metastatic cancer with fluorescent proteins.</a> Cell Death and Differentiation. 9, 786-789 (2002).</li><li>Sweeney, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+the+kinetics+of+tumor-cell+clearance+in+living+animals.">Visualizing the kinetics of tumor-cell clearance in living animals.</a> Proceedings of the National Academy of Science USA. 96, 12044-12049 (1999).</li><li>Chishima, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+invasion+and+micrometastasis+visualized+in+live+tissue+by+green+fluorescent+protein+expression.">Cancer invasion and micrometastasis visualized in live tissue by green fluorescent protein expression.</a> Cancer Research. 57, 2042-2047 (1997).</li><li>Bouvet, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Real-time+optical+imaging+of+primary+tumor+growth+and+multiple+metastatic+events+in+a+pancreatic+cancer+orthotopic+model.">Real-time optical imaging of primary tumor growth and multiple metastatic events in a pancreatic cancer orthotopic model.</a> Cancer Research. 62, 1534-1540 (2002).</li><li>Hoffman, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Multiples+Uses+of+Fluorescent+Proteins+to+Visualize+Cancer+in+vivo.">The Multiples Uses of Fluorescent Proteins to Visualize Cancer in vivo.</a> Nature Reviews. 5, 796-806 (2005).</li><li>Roby, K. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+syngeneic+mouse+model+for+events+related+to+ovarian+cancer.">Development of a syngeneic mouse model for events related to ovarian cancer.</a> Carcinogenesis. 21 (4), 585-591 (2000).</li><li>Rampurwala, M., Ravoori, M. K., Wei, W., Johnson, V. E., Vikram, R., Kundra, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+and+quantification+of+intraperitoneal+tumors+by+in+vivo+computed+tomography+using+negative+contrast+enhancement+strategy+in+a+mouse+model+of+ovarian+cancer.">Visualization and quantification of intraperitoneal tumors by in vivo computed tomography using negative contrast enhancement strategy in a mouse model of ovarian cancer.</a> Translational Oncology. 2 (2), 96-106 (2009).</li><li>Kim, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antitumor+and+antivascular+effects+of+AVE8062+in+ovarian+carcinoma.">Antitumor and antivascular effects of AVE8062 in ovarian carcinoma.</a> Cancer Research. 67, 9337-9345 (2007).</li><li>Picchio, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Advanced+ovarian+carcinoma:+usefulness+of+[(18)F]FDG-PET+in+combination+with+CT+for+lesion+detection+after+primary+treatment.">Advanced ovarian carcinoma: usefulness of [(18)F]FDG-PET in combination with CT for lesion detection after primary treatment.</a> Quarterly Journal of Nuclear Medicine. 47, 77-84 (2003).</li></ol>

מאמר זה הוא חלק של גיליון מיוחד בנושא מולטימודליות טרום קליני הדמיה, בחסות Bruker Biospin.

בניגוד למחקרים באמצעות תאי סרטן שחלות אדם חייב להתנהל בעכברי immunocompromised, הפרוטוקול המתואר לעיל מנצל מערכת חיסון תקין עכברי C57 / BL6 ותאי סרטן שחלות murine syngeneic. אמנם זה מאפשר הערכה של פוטנציאל התפקיד של מחלחל חיסוני התקדמות גידול וגרור, הנוכחות של שיער כהה על פני שטח הבטן הופכת הדמיה פחות רגישה. שימוש מקריח להסיר שיער לפני ההדמיה משפרת רכישת תמונה, אבל היא גוזלת זמן, במיוחד עבור ניסויים הדורשים הדמיה אורכת. &#39;עירום&#39; עכברים חסרי שיער ניתן להשתמש בפרוטוקול זה ואינו דורשים הסרת שיער מקריחה מבוסס. יתר על כן, עכברים בעירום אין מערכת חיסון מתפקדת, כך יכולים גם להיות מנוצל כדי להעריך את הצמיחה של תאים סרטניים אנושיים השחלות בניסויים שבה התרומה של המערכת החיסונית היא לא תחת ניתוח. ראוי גם לציין כי עומק intraperגידולי itoneal גם מציגים אתגרים טכניים, כמו דימות פלואורסצנטי אופטית לא בדרך כלל לגילוי גידולים בעומקים של יותר מ -5 מ&quot;מ. יתר על כן, השכיחות של נוזל מיימת ואת הנוכחות של תאים סרטניים ascitic ליצור סיבוכים נוספים. ראינו השתנות העכבר אל העכבר משמעותי להיווצרות של נוזל מיימת, אפילו כאשר הוא מוזרק עם הקו הסלולרי אותו. כך בנוכחות מיימת, שיטה זו עדיפה לניתוח נקודת סיום של ניטל גידול איבר ספציפי ולא הדמיה אורכת שיגרתית של התקדמות. במקרה הנוכחי, שינויים דרמטיים נטל הגידול צוינו בין עכברים למשל, כאלה שליגיונותיו של ארבעה עד חמישה עכברים בדרך כלל יהיה מספיק לניתוח סטטיסטי. במקרה של הבדלים דרמטיים פחות ניטל גידול, שנבדקים בניסוי נוספים יהיו צורך להגיע כוח סטטיסטי. בעוד הדוגמאות המוצגות במסמך זה שונה באופן משמעותי נפח הגידול, דימות פלואורסצנטי אופטי ניתן להשתמש כדילזהות הבדלים הרבה יותר קטנים נטל גידול איבר ספציפי, במיוחד כשמשווה משקולות או מדידות מבוססות קליפר על נגעים קטנים (לא מוצגות) .Resolution והרגישות תשתנה בהתאם לקו תא ומערכת הדמיה. במקרה הנוכחי, שתלים גרורתי קטנים כמו 400 מיקרומטר בקוטר ניתן לפתור לכמת. שיטות חלופיות כוללים טומוגרפיה ממוחשבת משופרת ניגודיות (CT), תהודה מגנטית (MR) הדמיה, טומוגרפיית פליטת פוזיטרונים (PET) תוארו עבור הדמיה אורכת 14,15. Modalities כולל הדמיה אנטומית ופונקציונלית משולבת גם בפיתוח 16. בשנת לגבי השיטה המוצעת זה כימות של נטל הגידול, יש לציין כי קביעת ספי הקרינה [שלב 4.3.5.] מבוסס על עוצמת הקרינה לראות את התמונות איבר [שלב 4.3.2.] והוא נבחר על ידי המשתמש לכלול רק את האזורים פלורסנט ביותר relative לשאר האיבר. ערכי סף שונים שימשו בניתוח לפני קביעת ערכי סף הסופי נעשה שימוש במחקר זה. לאחר שנקבע, ספי אותם שימשו כל איבר נותחו על מנת להבטיח עקביות כימות של מה נחשב רקמת גרורתי ידי ניתוח ויזואלי הראשוני נעשה על ידי החוקר. קביעת ערכי סף אלו הוא שלב קריטי בהליך ועלול להשתנות מפרויקט אחד למשנהו כפי שנקבע על ידי החוקר הפרט. במקרה זה, רף נמוך יותר גדול שימש כדי ללכוד רק את אותות הקרינה בעוצמה הגבוהה ביותר. באמצעות סף אותו עבור כל איבר המנותח, ניתוח התוצאות להציע תוצאות כמותיות השוואתיות בהקשר של קבוצה זו של עכברים. למרות ששיטה זו היא מוגבלת כימות של הערכים המוחלטים של שטח הפנים הגידול, זה מאפשר לחוקרים את היכולת להשוות נטל הגידול מנורמל ביחס בין א אותוnd איברים שונים בתוך קבוצות של עכברים. יצוין כי גישה זו כוללת כימות של גידולים שאינם גלויים לעין בלתי מזוינת. המנגנון גרורתי הייחודי של תוצאות EOC ב carcinomatosis intraperitoneal לתפוצה רחבה המעורבות מספר רקמות ואיברים, טיוח ניתוח cytoreductive אופטימלי מאתגרת מבחינה טכנית. כפי cytoreduction המלא בקורלציה חיובית עם הישרדות כוללת, המסקנה היא כי פיתוח של אסטרטגיות טיפוליות חדשות כדי להילחם גרורות תוך הצפק היא מוצדקת. הערכת היעילות הטיפולית, לעומת זאת, היא תלויה quantitation מדויק של נטל הגידול, כולל הערכה של גרורות איבר ספציפי. באמצעות דימות אופטי של תאים סרטניים מתויג RFP באתרו תיקן autofluorescence איבר, בשילוב עם הדמיה איבר vivo לשעבר זהיר, פיתחנו גישה לכמת נטל הגידול איבר ספציפי intraperitoneal. מעניין לציין, כי הניתוחים שלנו מראיםהאתרים המועדפים של גרורות במודל זה, כפי שהוגדר על ידי אזור נטל הגידול / משטח, הם דומים לאלה שנמצאו אצל נשים עם סרטן שחלות (omentum, השחלה, המעי, לפדר) 2,4,5. לכן גישה זו צריכה להיות כלי בעתיד בהערכה רפויה הניסיונות שנועד למקד מחלה גרורתית.

סרטן שחלות אפיתל (EOC) הוא הגורם השכיח ביותר למוות ממאיר גינקולוגיות, עם אבחנות חדשות 21,290 המשוער בארה&quot;ב בשנת 2015 ו 1 14,180 מקרי מוות. הרוב המכריע (&gt; 75%) של נשים מאובחנים עם מחלה בשלב מאוחר (שלב III או IV) מאופיין גרורות תוך הצפק מפוזרות פרוגנוזה גרועה. ישנות מחל חלל הצפק בעקבות כימותרפיה כקו הראשון הן גם נפוצות ומייצג אחד גורמים עיקריים של 2,3 תמותה. EOC גרורה ידי מנגנון ייחודי המעורבים הוא המשך ישיר מן הגידול הראשוני לאיברים הצפק שכנות כמו גם על ידי ניתוק או שפיכת התאים מפני שטח גידול הראשוני כמו תאים בודדים או אגרגטים רבים תאיים. תאים הם לשפוך לתוך חלל הצפק, שבה הם להתנגד הנגרמת ניתוק אפופטוזיס 4. הצטברות של מיימת הצפק שכיחה, כפי תאים סרטניים לשפוך לחסום ניקוז לימפטי הצפק tumors לייצר גורמי גדילה אשר משנים חדירות כלי הדם. חלק של תאים סרטניים לשפוך לצרף אל פני השטח של איברים הצפק ומבנים כולל המעי, הכבד, omentum ו לפדר, ואז הם לעגן מתרבים כדי לייצר נגעים משניים מרובים לתפוצה רחבה 3,5. גרורות Hematogenous הן נדירות. לפיכך, ניהול קליני מורכב בדרך של ניתוח cytoreductive כולל &quot;debulking אופטימלי&quot;, המוגדר כריתה של כל הגידול גלוי (לא משנה כמה קטן). Cytoreduction השלם קשור לעלייה משמעותית בהישרדות הכוללת 6,7 והיא קשורה עם האתגר של זיהוי והסרה של נגעים &lt;0.5 סנטימטר. במודלים של בעלי חיים קטנים הוכיחו שירות במחקר סרטן השחלות בשיפור ההבנה שלנו של התקדמות מחלה וכן יש להציג תעודת מזהה של סמנים פרוגנוסטיים ובדיקה של תרופות רומן או גישות טיפול משולב. ככל העיקריהאתר של שכיחות סרטן השחלות גרורות הוא חלל הצפק, מודלים orthotopic של גרורות EOC כרוך בניתוח ואפיון של המחלה intraperitoneal. למרות חלו שיפורים אחרונים ביכולת תאים סרטני תמונה, אפילו ברמה של התא הבודד, עדיין קיימים קשיים משמעותיים בכימות ניטל גידול גרורתי של EOC. אתגרים אלה נובעים בשל מספר, גודל ומיקום אנטומי של גרורות. יתר על כן קיים צורך לתאי סרטן התווית כדי להבדילם תאי מארחים נורמלים. מחקרים קודמים מנוצלים פרוטוקולי תיוג מבוסס נוגדן או transfection של תאים סרטניים עם 8,9 בלוציפראז. תיוג פלורסנט ישיר של תאים סרטניים דווח לראשונה על ידי Chishima ועמיתים לעבודה בשנת 1997 10. תוויות פלורסנט אינן דורשות תוספת של מצע אקסוגניים ולספק סגולי תאים סרטניים מעודן, מתן אמצעים יעילים יותר כדי לעקוב אחר גרורות סרטן 11,12 </sup&gt;. בזאת אנו מתארים שיטת הדמיה אופטית ניתוח כמותי של מחלה גרורתית באמצעות מודל xenograft orthotopic syngeneic המורכב חלבון פלואורסצנטי אדום (RFP) -tagged בתאי סרטן שחלות murine ID8 13 ועכברים חיסוני המוסמכות C57 / BL6. אנו מדגימים שיטה חדשה של כימות נטל הגידול היחסי שילוב in vivo לשעבר vivo הדמיה עם הסרת פלואורסצנציה אוטומטי רקמות. לגישה הזאת יש פוטנציאל השירות במחקרים שנועדו להעריך את ההשפעה של שינויים ספציפיים גנטיים, אפיגנטיים או מיקרו-סביבתיים ו / או שיטות טיפול על גרורות איבר ספציפי של סרטן השחלות.

<table><tbody><tr><td>Dulbecco&#039;s Modified Eagle Medium</td><td>Corning</td><td>10-014-CM</td><td></td></tr><tr><td>Fetal bovine serum</td><td>Gibco</td><td>10437-028</td><td></td></tr><tr><td>penicillin/streptomycin</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Insulin-transferrin-sodium selenite media supplement</td><td>Sigma</td><td>I-1884</td><td></td></tr><tr><td>Bruker Xtreme small animal imaging system</td><td>Bruker Corp.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bruker Multispectral software</td><td>Bruker Corp</td><td></td><td></td></tr><tr><td>lentiviral particles with Red fluorescent protein</td><td>GenTarget, Inc.</td><td>LVP023</td><td></td></tr><tr><td>trypsin for cell culture</td><td>Corning</td><td>25-053-CI</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Corning</td><td>21-040-CM</td><td></td></tr><tr><td>depilatory cream (such as Nair Hair Remover Lotion)</td><td>purchases from drugstore&amp;nbsp;</td><td>n/a</td><td></td></tr><tr><td>ImageJ software&amp;nbsp;</td><td>http://imagej.nih.gov/ij/&amp;nbsp;</td><td></td><td>free download</td></tr><tr><td>dissecting tools (forceps)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>&amp;nbsp;RS 5130</td><td></td></tr><tr><td>dissecting tools (Scissors)</td><td>Roboz Surgical Instrument</td><td>RS 5910</td><td></td></tr></tbody></table>

quantitation of intra-peritoneal ovarian cancer metastasis

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States. Mortality is due to diagnosis of 75% of women with late stage disease, when metastasis is already present. EOC is characterized by diffuse and widely disseminated intra-peritoneal metastasis. Cells shed from the primary tumor anchor in the mesothelium that lines the peritoneal cavity as well as in the omentum, resulting in multi-focal metastasis, often in the presence of peritoneal ascites. Efforts in our laboratory are directed at a more detailed understanding of factors that regulate EOC metastatic success. However, quantifying metastatic tumor burden represents a significant technical challenge due to the large number, small size and broad distribution of lesions throughout the peritoneum. Herein we describe a method for analysis of EOC metastasis using cells labeled with red fluorescent protein (RFP) coupled with in vivo multispectral imaging. Following intra-peritoneal injection of RFP-labelled tumor cells, mice are imaged weekly until time of sacrifice. At this time, the peritoneal cavity is surgically exposed and organs are imaged in situ. Dissected organs are then placed on a labeled transparent template and imaged ex vivo. Removal of tissue auto-fluorescence during image processing using multispectral unmixing enables accurate quantitation of relative tumor burden. This method has utility in a variety of applications including therapeutic studies to evaluate compounds that may inhibit metastasis and thereby improve overall survival.

המנגנון גרורתי של סרטן השחלות מאופיין גרורות תוך הצפק מפוזרים מאוד מורכבות נגעים רבים בגדלים שונים, כולל מספר קטן (&lt;2 מ&quot;מ) נגעים. לפיכך, השימוש של תאים סרטניים שכותרתו RFP (איור 1) ו דימות אופטי מספק שיטה חלופית כדי ספירה ידנית ומדידה של גודל הנגע. התפתחות נטל הגידול לאורך זמן ניתן לקבוע על ידי שקילה שבועית של עכברים ומדידה של ההקף הבטן כדי לאמוד הימצאות אפשרית של מיימת. דימות אופטי בשנת vivo מספק גישה משלימה להעריך נטל הגידול (איור 2). סרטן השחלות גרור לאתרים מרובים החלל הצפק ונהגים מולקולריים של גרורות באתר ספציפי כרגע לא ידועים. בנוסף קביעת ניטל גידול כולל, דיסקציה הזהירה הקרב הבא ניתן לבצע כדי להעריך ולכמת pa אתר ספציפי<html> tterns של גרורות. לפיכך, דימות אופטי של איברים הצפק באתרם (איור 3 א &#39;, ב&#39;) בשילוב עם הערכה vivo לשעבר של איברים בודדים (איור 3 ג, ד) יכול לספק מידע שימושי על הכולל לעומת נטל הגידול איבר ספציפי. הסריקות מוצגות באיור 3 מייצגות את תוצאות סריקת חללי הבטן ואיברי פרט של עכברים עם בדרגות שונות של ניטל גידול. לדוגמה, איור 3 ג מציג את נטל הגידול ביותר omentum / הלבלב, השחלות לפדר של א מאוס כשמשווים לאיברים אותם עכבר B, הבדל משמעותי האות נתפסת (איור 3D). השימוש בתבנית סריקת איבר (איור 4) מסייע זיהוי של ניטל גידול איבר ספציפי. תצפית של נטל הגידול ההפרש הוא אישר הן כמותית מבחינת שטח הפנים הגידול ואת עוצמת האות הגידול (טבלה 1, איור 5). ss = &quot;jove_content&quot; FO: keep-together.within-page = &quot;1&quot;&gt; התוצאות מוצגות דמויים אלה והשולחן נותחו באמצעות תצוגת מינימום ומקסימום בטווח שבין 0 ל + 35,353 כדי למנוע כל אותות חיוביים שגויים הקרינה אוטומטית ניתנה הנחה על ידי הרקמות. התארים המשתנים של אות שניתן לראות באיור 2 ו -3 להמחיש את המגוון הגדול של ניטל גידול כי ניתן הדמיה לכמת באמצעות שיטה זו. הנתונים בטבלה 1 מדגימים מגוון רחב זה של תחולה בכימות היא מבחינת שטח ואת עוצמת אות משטח גידול של הגידול. לדוגמא, כאשר מסתכלים על omentum / לבלב של עכבר בהשוואה לזו של העכבר B, שטח פן גידול המנורמל הוא 26 פעמים יותר מאשר עכבר העכבר ב יתר על כן, המגוון הרחב של עוצמת אות גם מודגם ב omentum / בלבלב של עכברים ו- B; הצפיפות המשולבת הגלם המנורמלת של עכבר גדולה 56 פעמים מזה של העכבר B. תוצאות אלו מראות את תוקפו של comparing בנטל גידול של בדיקה כמה נושאים ביחס אחד לשני, הן מבחינת שטח הפנים הגידול ואת עוצמת האות גידול, באמצעות שיטה מהירה זו שאינה דורשת ניתוח היסטולוגית נוספת. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig1.jpg" /> איור 1. ID8 Murine השחלות תאים סרטניים אקספרס RFP. (א) תמונת שלב של תאי ID8. (ב) תמונה פלואורסצנטי של תאי ID8. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53316/53316fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig2.jpg" /> איור 2. דימות אופטי חיה של C56 / BL6 עכבר עם נטל הגידול תוך הצפק. (א) קרם מקריח שימש להסיר hai<html> r מפני שטח הגחון של העכבר לפני הסריקה. (ב) תרשים המציג קו אמצע גחון ראשוני חתכים לרוחב. <a href="https://ecsource-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53316/53316fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3AC" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig3AC.jpg" /> <img alt="3BD איור" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig3BD.jpg" /> איור 3. Endpoint סריקה של תוך הצפק גידול ברדן. (A, B) עכברים הם צילמו הראשון עם איברים באתרו (בצד הגחון למטה) לאחר פתיחת משטח הגחון של העכבר. (C, D) הדמיה של איברים בודדים. כל איבר הוא גזור, ניטל גידול חזותי מוקלט, והניח על תבנית סריקת איבר לניתוח.Target = &quot;_ blank&quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig4.jpg" /> איור 4. תבנית סריקת איברים. איברים גזורים מונחים על תבנית סריקת האיבר לשמור זיהוי מיקומית של איברים בודדים במהלך סריקה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/53316/53316fig5.jpg" /> .. איור 5. מידע כמותי מנורמל עבור omentum / לבלב, שחלות לפדר הנתונים נותחו כמתואר בפרוטוקול וכפי שניתן לראות בטבלה 1 עכבר מתייחס העכבר שנסרק 3A לוח; עכבר B מתייחס העכבר שנסרק 3B לוח. (א) אזור הגידול מנורמל. ניתוח וכימות אותות הקרינה של שלושה גופים אלה נערך לכמת במונחים של יחסשל שטח פן גידול שטח פן איבר שלמים עבור שני העכברים. (ב) משולבת בצפיפות גלם מנורמלת. ניתוח וכימות אותות הקרינה של שלושה גופים אלה נערך לכמת במונחים של היחס בין צפיפות משולב גלם לאזור איבר משטח שלם עבור שני עכברים. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="513" style=";text-align:right;direction:rtl"><colgroup><col /><col /><col /><col /></colgroup><tbody><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> Omentum / לבלב </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"></td><td style="width:129px;"> אזור גידול מנורמל </td><td colspan="2" style="width:320px;"> צפיפות מנורמלת משולבת גלם </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> עכבר </td><td style="width:129px;"> .5346 </td><td colspan="2" style="width:320px;"> 5.11E + 07 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> עכבר B </td><td style="width:129px;"> .0203 </td><td colspan="2" style="width:320px;"> 8.97E + 05 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> שחלות </td></tr><tr height="81"><td height="81" style="height:81px;width:64px;"></td><td style="width:129px;"> אזור גידול מנורמל </td><td colspan="2" style="width:320px;"> צפיפות מנורמלת משולבת גלם </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> עכבר </td><td style="width:129px;"></td><td colspan="2" style="width:320px;"> 4.79E + 07 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"> עכבר B </td><td style="width:129px;"> .0123 </td><td colתוחלת = &quot;2&quot; style = &quot;width: 320px;&quot;&gt; 5.62E + 05 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:64px;"></td><td colspan="3" style="width:449px;"> לפדר </td></tr><tr height="101"><td height="101" style="height:101px;width:64px;"></td><td colspan="2" style="width:193px;"> אזור גידול מנורמל </td><td style="width:256px;"> צפיפות מנורמלת משולבת גלם </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> עכבר </td><td colspan="2" style="width:193px;"> .2951 </td><td style="width:256px;"> 2.22E + 07 </td></tr><tr height="20"><td height="20" style="height:20px;width:64px;"> עכבר B </td><td colspan="2" style="width:193px;"> .0098 </td><td style="width:256px;"> 4.15E + 05 </td></tr></tbody></table> אזור גידול בטבלה 1. מנורמל מנורמל גלםערכי צפיפות משולבים ב- omentum / הלבלב, שחל לפדר של שניהם עכבר ועכבר ב הודעה לנתיחה וסריקה, כל איבר היה מפולחים הקרינה שלה לכמת כדי לקבוע את שיעור גידול באזור שטח פן איבר הכולל ואת העוצמות של קרינה באזורי גידול אלה. Omentum / הלבלב, השחלות לפדר נבחרו כפי שעשו אותות הקרינה החזקה בתוך שתי קבוצות הביקורת חיוביות ושליליות.

Watch this Scientific Journal Video about Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis at JoVE.com

Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

כימות של גרורות סרטן השחלות תוך הצפק

Epithelial ovarian cancer (EOC) is the leading cause of death from gynecologic malignancy in the United States.  Mortality is due to diagnosis of 75% of ...

quantitation-of-intra-peritoneal-ovarian-cancer-metastasis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K Views.  University of Notre Dame. Ovarian cancer metastasis is characterized by numerous diffuse intra-peritoneal lesions, such that accurate visual quantitation of tumor burden is challenging. Herein we describe a method for in situ and ex vivo quantitation of metastatic tumor burden using red fluorescent protein (RFP)-labeled tumor cells and optical imaging.

Video: Quantitation of Intra-peritoneal Ovarian Cancer Metastasis

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all gynecologic malignancies among US women 1,2,3. Serous tumors are the most widespread forms of ovarian cancer and 4,5 the Tg-MISIIR-TAg transgenic represents the only mouse model that spontaneously develops this type of tumors. Tg-MISIIR-TAg mice express SV40 transforming region under control of the Mullerian Inhibitory Substance type II Receptor (MISIIR) gene promoter 6. Additional transgenic lines have been identified that express the SV40 TAg transgene, but do not develop ovarian tumors. Non-tumor prone mice exhibit typical lifespan for C57Bl/6 mice and are fertile. These mice can be used as syngeneic allograft recipients for tumor cells isolated from Tg-MISIIR-TAg-DR26 mice.
Objective: Although tumor imaging is possible 7, early detection of deep tumors is challenging in small living animals. To enable preclinical studies in an immunologically intact animal model for serous ovarian cancer, we describe a syngeneic mouse model for this type of ovarian cancer that permits in vivo imaging, studies of the tumor microenvironment and tumor immune responses.
Methods: We first derived a TAg+ mouse cancer cell line (MOV1) from a spontaneous ovarian tumor harvested in a 26 week-old DR26 Tg-MISIIR-TAg female. Then, we stably transduced MOV1 cells with TurboFP635 Lentivirus mammalian vector that encodes Katushka, a far-red mutant of the red fluorescent protein from sea anemone Entacmaea quadricolor with excitation/emission maxima at 588/635 nm 8,9,10. We orthotopically implanted MOV1Kat in the ovary 11,12,13,14 of non-tumor prone Tg-MISIIR-TAg female mice. Tumor progression was followed by in vivo optical imaging and tumor microenvironment was analyzed by immunohistochemistry.
Results: Orthotopically implanted MOV1Kat cells developed serous ovarian tumors. MOV1Kat tumors could be visualized by in vivo imaging up to three weeks after implantation (fig. 1) and were infiltrated with leukocytes, as observed in human ovarian cancers 15 (fig. 2).
Conclusions: We describe an orthotopic model of ovarian cancer suitable for in vivo imaging of early tumors due to the high pH-stability and photostability of Katushka in deep tissues. We propose the use of this novel syngeneic model of serous ovarian cancer for in vivo imaging studies and monitoring of tumor immune responses and immunotherapies.

An Orthotopic Model of Serous Ovarian Cancer in Immunocompetent Mice for in vivo Tumor Imaging and Monitoring of Tumor Immune Responses

To study in vivo tumor growth and tumor microenvironment, we used a syngeneic and orthotopic mouse model of ovarian cancer in immunocompetent animals. We transduced a mouse tumor cell line (MOV1) with Katushka fluorescent protein (MOV1KAT) and here we show its orthotopic implantation in ovary and in vivo imaging.

דגם orthotopic של סרטן השחלות הצפק ב עכברים immunocompetent עבור In vivo הדמיה ניטור הגידול של המערכת החיסונית גידול

Background: Ovarian cancer is generally diagnosed at an advanced stage where the case/fatality ratio is high and thus remains the most lethal of all ...

Immunology and Infection

Surface-enhanced Resonance Raman Scattering Nanoprobe Ratiometry for Detecting Microscopic Ovarian Cancer via Folate Receptor Targeting

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic spread has already occurred. However, ovarian cancer has a unique pattern of metastatic spread, in that tumor implants are initially contained within the peritoneal cavity. This feature could enable, in principle, the complete resection of tumor implants with curative intent. Many of these metastatic lesions are microscopic, making them hard to identify and treat. Neutralizing such micrometastases is believed to be a major goal towards eliminating tumor recurrence and achieving long-term survival. Raman imaging with surface enhanced resonance Raman scattering nanoprobes can be used to delineate microscopic tumors with high sensitivity, due to their bright and bioorthogonal spectral signatures. Here, we describe the synthesis of two &#39;flavors&#39; of such nanoprobes: an antibody-functionalized one that targets the folate receptor &#8212; overexpressed in many ovarian cancers &#8212; and a non-targeted control nanoprobe, with&#160;distinct spectra. The nanoprobes are co-administered intraperitoneally to mouse models of metastatic human ovarian adenocarcinoma. All animal studies were approved by the Institutional Animal Care and Use Committee of Memorial Sloan Kettering Cancer Center. The peritoneal cavity of the animals is surgically exposed, washed, and scanned with a Raman microphotospectrometer. Subsequently, the Raman signatures of the two nanoprobes are decoupled using a Classical Least Squares fitting algorithm, and their respective scores divided to provide a ratiometric signal of folate-targeted over untargeted probes. In this way, microscopic metastases are visualized with high specificity. The main benefit of this approach is that the local application into the peritoneal cavity &#8212; which can be done conveniently during the surgical procedure &#8212; can tag tumors without subjecting the patient to systemic nanoparticle exposure. False positive signals stemming from non-specific binding of the nanoprobes onto visceral surfaces can be eliminated by following a ratiometric approach where targeted and non-targeted nanoprobes with distinct Raman signatures are applied as a mixture. The procedure is currently still limited by the lack of a commercial wide-field Raman imaging camera system, which once available will allow for the application of this technique in the operating theater.

Ovarian cancer forms metastases throughout the peritoneal cavity. Here, we present a protocol to make and use folate-receptor targeted surface-enhanced resonance Raman scattering nanoprobes that reveal these lesions with high specificity via ratiometric imaging. The nanoprobes are administered intraperitoneally to living mice, and the derived images correlate well with histology.

ראמאן תהודה משופרת השטח פיזור Nanoprobe Ratiometry לגילוי סרטן השחלות מיקרוסקופיים באמצעות חומצה פולית קולטן מיקוד

Ovarian cancer represents the deadliest gynecologic malignancy. Most patients present at an advanced stage (FIGO stage III or IV), when local metastatic ...

Cancer Research

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

An Orthotopic Mouse Model of Ovarian Cancer using Human Stroma to Promote Metastasis

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant transgenic mouse models of ovarian cancer exist, these mice are expensive and take a long time to develop tumors. Intraperitoneal injection xenograft models lack human stroma and do not accurately model ovarian cancer metastasis. Even patient derived xenografts (PDX) do not fully recapitulate the human stromal microenvironment as serial PDX passages demonstrate significant loss of human stroma. The ability to easily model human ovarian cancer within a physiologically relevant stromal microenvironment is an unmet need. Here, the protocol presents an orthotopic ovarian cancer mouse model using human ovarian cancer cells combined with patient-derived carcinoma-associated mesenchymal stem cells (CA-MSCs). CA-MSCs are stromal progenitor cells, which drive the formation of the stromal microenvironment and support ovarian cancer growth and metastasis. This model develops early and diffuses metastasis mimicking clinical presentation. In this model, luciferase expressing ovarian cancer cells are mixed in a 1:1 ratio with CA-MSCs and injected into the ovarian bursa of NSG mice. Tumor growth and metastasis are followed serially over time using bioluminescence imaging. The resulting tumors grow aggressively and form abdominal metastases by 14 days post injection. Mice experienced significant decreases in body weight as a marker of systemic illness and increased disease burden. By day 30 post injection, mice met endpoint criteria of &gt;10% body weight loss and necropsy confirmed intra-abdominal metastasis in 100% of mice and 60%-80% lung and parenchymal liver metastasis. Collectively, orthotopic engraftment of ovarian cancer cells and stroma cells generates tumors that closely mimic the early and diffuse metastatic behavior of human ovarian cancer. Furthermore, this model provides a tool to study the role of ovarian cancer cell: stroma cell interactions in metastatic progression.

<meta charset="utf8"></head><body>מודל עכברי אורתוטופי של סרטן השחלות באמצעות סטרומה אנושית לקידום גרורות

Orthotopic engraftment of ovarian cancer cells mixed with human stromal cells provides a mouse model that exhibits rapid, diffuse metastatic behavior that is characteristic of human ovarian cancer. This model also allows for the study of tumor cell and stromal cell interactions, as well as their role in tumor progression and metastasis.

מודל עכברי אורתוטופי של סרטן השחלות באמצעות סטרומה אנושית לקידום גרורות

Ovarian cancer is characterized by early, diffuse metastasis with 70% of women having metastatic disease at the time of diagnosis. While elegant ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

דגם Murine הדמיה בלתי פולשנית לזיהוי ומעקב סרטן השחלות הישנות

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

הקמת מודל 3D Ex Vivo לאינטראקציה בין סרטן השחלות לאומנטום

An Ex Vivo Model of Ovarian Cancer Peritoneal Metastasis Using Human Omentum

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian cancer cells as well as immune modulatory signals that allow tumor tolerance. However, we have limited models that closely mimic the interaction between ovarian cancer cells and adipose-rich tissues. To further understand the cellular and molecular mechanisms by which the omentum provides a pro-tumoral microenvironment, we developed a unique 3D ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. Using human omentum, we are able to grow ovarian cancer cells within this adipose-rich microenvironment and monitor the factors responsible for tumor growth and immune regulation. In addition to providing a platform for the study of this adipose-rich tumor microenvironment, the model provides an excellent platform for the development and evaluation of novel therapeutic approaches to target metastatic cancer cells in this niche. The proposed model is easy to generate, inexpensive, and applicable to translational investigations.

מחבר זרקור: מודל מתקדם Ex Vivo לחקר אינטראקציה בין סרטן לשומן מיקרו-סביבה 

This protocol describes the establishment of a three-dimensional (3D) ex vivo model of cancer cell-omentum interaction. The model provides a platform for elucidating pro-tumor mechanisms within the adipose niche and for testing novel therapies.

מודל Ex Vivo של סרטן השחלות גרורות פריטוניאליות באמצעות Omentum אנושי

Ovarian cancer is the deadliest gynecologic malignancy. The omentum plays a key role in providing a supportive microenvironment to metastatic ovarian ...

כימות של גרורות סרטן השחלות תוך הצפק

Summary

Explore More Videos

דגם orthotopic של סרטן השחלות הצפק ב עכברים immunocompetent עבור In vivo הדמיה ניטור הגידול של המערכת החיסונית גידול

ראמאן תהודה משופרת השטח פיזור Nanoprobe Ratiometry לגילוי סרטן השחלות מיקרוסקופיים באמצעות חומצה פולית קולטן מיקוד

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

מודל עכברי אורתוטופי של סרטן השחלות באמצעות סטרומה אנושית לקידום גרורות

מודל עכברי אורתוטופי של סרטן השחלות באמצעות סטרומה אנושית לקידום גרורות

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

דגם Murine הדמיה בלתי פולשנית לזיהוי ומעקב סרטן השחלות הישנות

מודל Ex Vivo של סרטן השחלות גרורות פריטוניאליות באמצעות Omentum אנושי

מודל Ex Vivo של סרטן השחלות גרורות פריטוניאליות באמצעות Omentum אנושי

מודל Ex Vivo של סרטן השחלות גרורות פריטוניאליות באמצעות Omentum אנושי