Name: a reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically
Uploaded: 2015-09-09T14:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 28 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically at JoVE.com

Prior work with regard to susceptibility testing of dalbavancin has been valuable in development of a standardized methods and acknowledgement for this work is given to JMI Laboratories, Robert Rennie and Beth Goldstein.

הערה: עיין במסמכי CLSI M7-A10 וM100-S25 ו / או ISO / FDIS 20,776-1 לפרטים מלאים של שיטת microdilution מרק ההתייחסות לרגישות מיקרוביאלית 2, 3, 4 שיטות ההתייחסות לאפשר לאפשרויות בחלק מ. נהלים ספציפיים לייצור הכנת הבידוד ופנל MIC כדי להשיג את אותה תוצאה סופית. השיטה המפורטת כאן מתייחסת לסוכן, dalbavancin אחד מיקרוביאלית, וחלק מהצעדים מייצג את אחד עלול להיות כמה דרכים הליך ההתייחסות ניתן לעשות. אמצעי בטיחות מתאימה (בקנה אחד עם רמת בטיחות ביולוגית 2) צריך להיות מנוצל 10. פורמט פנל MIC משמש לצורך פרסום וידאו זה מוצג בטבלה 1. 1. חנות Dalbavancin אבקה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם קבלת אבקת dalbavancin הכיתה אבחון, חנות ב -20 מעלות צלסיוס בסביבה מיובשת בהקפאת הפשרה שאינה. לפני השימוש, האבקה צריכה לאזן ללהגיע RT לפני הפתיחה. </li></ol> 2. הכן דילולי MIC לוח <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות לא נעלה על 1,600 מיקרוגרם / מיליליטר של dalbavancin בDMSO המסודר (הטהור) בצינורות זכוכית או פלסטיק סטרילי, ולהשתמש באותו היום של הכנה או חנות ב -20 לC -60 o או מתחת לשימוש עתידי ב מקפיא ההפשרה אינה. קח בחשבון את העוצמה של dalbavancin כאמור בתיעוד קיבל עם האבקה, כאשר במשקל האבקה (ראה המשוואה 1 לדוגמא 800 מיקרוגרם / הכנת מניית מיליליטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את מניות הדילול דומה לתכנית כפי שמוצג בטור 1 (&quot;ריכוז מקור&quot;) בטבלה 2 עם DMSO המסודר בצינורות זכוכית או פלסטיק סטרילי. השתמש pipet אחד למדידת diluent וpipet אחר להוספת מניית dalbavancin הראשונית לצינור הראשון. לכל ריכוז מניית dalbavancin לאחר מכן להשתמש pipet חדש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן concent לוח MIC הסופי 100Xדילולים מנה (ריכוזי ביניים) עם DMSO המסודר. כפי שמוצג בעמודים 2-4 בטבלה 2, לשלב כרכים מתאימים של מקור וDMSO כדי להשיג ריכוז ביניים רצוי (כרכים לשמש יהיו תלוי במספר פנלי MIC להתבצע). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 0.004% P80: הכן פתרון מניות עובד טרי של P80 2% על ידי הוספת P80 0.1 מיליליטר ל -4.9 מיליליטר DH 2 א &#39; לעקר על ידי עובר דרך פתרון סינון ושימוש 0.22 מיקרון באותו היום של הכנה. הכן 0.004% diluent P80 על ידי הפיכת 1: P80 500 דילול של 2% (לדוגמא, 0.3 מיליליטר של 2% P80 ל149.7 מיליליטר של CAMHB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהמשך לדלל את ריכוזי ביניים מוכנים בשלב 2.2 1: 100 במרק קטיון הותאם מולר הינטון (CAMHB) בתוספת 0.004% (V / V) polysorbate-80 (P-80) P-80 ו / או LHB (לסטרפטוקוקוס) הוסיפה בכפול הריכוז הסופי כי תוספת של הבידוד (שלב 4.3) תגרום לדילול 1: 2. ראו עמודים 6 ו -7 בטבלה 2 </stRong&gt;. </li></ol> 3. להכין פנלי MIC <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר 50 μl של כל פתרון dalbavancin מוכן בשלב 2.3 לתוך בארות מתאימות של לוח MIC וכולל תקשורת רק באחד היטב (שליטת צמיחה גם). Pipet רב ערוצית עם טיפים סטרילי יכול לשמש לצעד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלוחות מייד או לאטום עם סרט פלסטיק, מקום בשקיות ניילון ומניח מייד במקפיא שאינו הפשרה ב- 20 ≤ o C (רצוי ב- 60 ≤ o C) עד צורך. אם לוחות קפוא משמשים, להסיר חותמות ולמקם את הלוחות בודדים במעבדת ספסל במשך 15-30 דקות (עד שהתוכן גם הם הפשירו) לפני שתמשיכו לחיסון פנל. </li></ol> 4. לחסן פנלי MIC, בצע ספירת טהרה ומושבת ההתקנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר כמה מושבות מבודדות היטב מאגר דם 18-24 שעות או צלחת אגר הלא סלקטיבי אחר. לגעת בחלק העליון של כל מושבה עם לולאה סטרילית או מטלית והעברה לCAMHB מיליליטר 1-5 או שלאלין עד העכירות הוא שווה ערך לסטנדרטי מק &#39;פרלנד 0.5. להעריך עכירות על ידי השוואה ויזואלית למק &#39;פרלנד 0.5 או עם מכשיר photometric. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 15-30 דקות של הכנה, לדלל את הבידוד 1: 100 בCAMHB (10 מיליליטר לCAMHB 100 μl). עבור רוב החיידקים שנבדקו נגד dalbavancin, למעט ס pneumoniae, דילול זה יספק ריכוז גם סופי של 5 x 10 5 CFU / מיליליטר (טווח מקובל הוא 2-8 x 10 5 CFU / ml). לס pneumoniae, ריכוז חיידקים המבוסס על השוואה של עכירות למק &#39;פרלנד 0.5 הוא בדרך כלל הרבה פחות, ולכן, לדלל את הבידוד 01:25 (400 μl לתוך 10 מיליליטר CAMHB + 10% + LHB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בתוך 15 דקות לאחר הכנת הבידוד, להעביר 50 μl של הבידוד הסופי היטב כל אחד (עם חריג של שליטת העקרות גם) של לוח MIC מוכן בשלב 3. pipet רב ערוצית באמצעות טיפים סטרילי יכול לשמש לצעד זה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע בדיקת טוהרעל ידי העברה והפצת aliquot 1-10 μl משליטת הצמיחה החיובית גם באמצעות לולאה סטרילי לאגר סלקטיבי (לדוגמא, אגר סויה trypticase עם 5% דם כבשים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבה התקנה על ידי הסרת 10 μl משליטת הצמיחה היטב עם pipet ערוץ אחד וקצה סטרילי ולהעביר 10 מיליליטר של תמיסת מלח (1: 1,000 דילול). לערבב ולהעביר עם pipet ערוץ אחד וקצה סטרילי 100 μl למדיום מתאים, לא סלקטיבי אגר (למשל, אגר trypticase סויה עם 5% דם כבשים) ומשתרע על פני השטח אגר כל עם לולאת סטרילי, חוזר פעמיים בכיוונים שונים כדי להבטיח חלוקה שווה של הבידוד (דילול 1:10). </li></ol> 5. פנלי דגירה MIC, מושבה רוזן וצלחות טוהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאטום כל פנל או ערימת MIC של לא יותר מ 4 פנלים בשקית ניילון, עם סרט פלסטי או עם כיסוי פלסטיק צמוד לפני דוגרים. לחלופין, למקם את פנל MIC ריק על top של ערימה של לא יותר מ 4 פנלי MIC, למקם מגבת נייר לחה במכל פלסטיק, לוחות MIC המקום במכל הפלסטיק ומכל קרוב מאובטח עם מכסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה לוחות MIC בחממת אוויר סביבה ב 35 ° C ± 2 מעלות צלזיוס במשך 16-20 שעות (staphylococci וenterococci) ו20-24 שעות (סטרפטוקוקוס) בתוך 30 דקות של חיסון. דגירה ספירת המושבה וצלחות טוהר תחת אותם תנאים מלבד סטרפטוקוקוס דגירה ב5% CO 2 באינקובטור. </li></ol> 6. קראו MIC ומושבת רוזן צלחות; בדוק פלייט טוהר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קראו MIC כריכוז הנמוך ביותר שמעכב צמיחת חיידקים בבארות כפי שזוהה על ידי בעין בלתי מזוינת לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת מושבות על צלחת ספירת מושבה. הכפל כל מושבה על ידי גורם דילול (1: 10,000) (לדוגמא, 50 מושבות היא שווה ערך ל 5 x 10 5 CFU / ml). טווח מקובל הוא 20-80 מושבות (2-8 x 10 5 CFU / ml) ומשמש כapproקו מנחה ximate. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק צלחת טוהר. אם כל המושבות דומות למושבות משמשות בשלב 4.1, ולאחר מכן את הבידוד יכול להיחשב טהור. אם יש מושבות אחרות בהווה, אז יש פוטנציאל לזיהום להיות נוכח בלוח MIC והבדיקה יש לחזור. </li></ol> תוצאות בקרת איכות 7. בדוק. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיין בטבלה 3 לטווחים צפויים של זני בקרת איכות CLSI. לדווח רק תוצאות של בדיקה מבודדת אם תוצאות MIC dalbavancin לאורגניזם בקרת איכות (ים) נמצאות בטווח הצפוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם MIC של ≥0.25 מיקרוגרם / מיליליטר מתקבל לכל ס קליני aureus לבודד, לחזור על בדיקות MIC dalbavancin ו / או לשלוח למעבדה התייחסות לאימות. </li></ol>

<ol>
	<li>Boucher, H. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Once-weekly+dalbavancin+versus+daily+conventional+therapy+for+skin+infection.">Once-weekly dalbavancin versus daily conventional therapy for skin infection.</a> The New England journal of medicine. 370, 2169-2179 (2014).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M07-A10. Methods for Dilution Antimicrobial Tests for Bacteria that Grow Aerobically.: Approved Standard. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> M100-S25. Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing; Twenty-Fifth Informational Supplement. , (2015).</li><li>. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+laboratory+testing+and+in+vitro+diagnostic+test+systems+--+Susceptibility+testing+of+infectious+agents+and+evaluation+of+performance+of+antimicrobial+susceptibility+test+devices+--+Part+1:+Reference+method+for+testing+the+in+vitro+activity+of+antimicrobial+agents+against+rapidly+growing+aerobic+bacteria+involved+in+infectious+diseases.">Clinical laboratory testing and in vitro diagnostic test systems -- Susceptibility testing of infectious agents and evaluation of performance of antimicrobial susceptibility test devices -- Part 1: Reference method for testing the in vitro activity of antimicrobial agents against rapidly growing aerobic bacteria involved in infectious diseases.</a> ISO/FDIS. 20776-1, (2006).</li><li>Jones, R. N., Farrell, D. J., Flamm, R. K., Sader, H. S., Dunne, M. W., Mendes, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surrogate+analysis+of+vancomycin+to+predict+susceptible+categorization+of+dalbavancin.">Surrogate analysis of vancomycin to predict susceptible categorization of dalbavancin.</a> Diagn Microbiol Infect Dis. , (2015).</li><li>Turnidge, J., Paterson, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Setting+and+revising+antibacterial+susceptibility+breakpoints.">Setting and revising antibacterial susceptibility breakpoints.</a> Clinical microbiology reviews. 20, 391-408 (2007).</li><li>Rennie, R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Factors+influencing+broth+microdilution+antimicrobial+susceptibility+test+results+for+dalbavancin,+a+new+glycopeptide+agent.">Factors influencing broth microdilution antimicrobial susceptibility test results for dalbavancin, a new glycopeptide agent.</a> Journal of clinical microbiology. 45, 3151-3154 (2007).</li><li>Arhin, F. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+polysorbate+80+on+oritavancin+binding+to+plastic+surfaces:+implications+for+susceptibility+testing.">Effect of polysorbate 80 on oritavancin binding to plastic surfaces: implications for susceptibility testing.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 52, 1597-1603 (2008).</li><li>Farrell, D. J., Mendes, R. E., Rhomberg, P. R., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Revised+reference+broth+microdilution+method+for+testing+telavancin:+effect+on+MIC+results+and+correlation+with+other+testing+methodologies.">Revised reference broth microdilution method for testing telavancin: effect on MIC results and correlation with other testing methodologies.</a> Antimicrobial agents and chemotherapy. 58, 5547-5551 (2014).</li><li>Ribbon Panel, B. l. u. e. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Guidelines+for+Safe+Work+Practices+in+Human+and+Animal+Medical+Diagnostic+Laboratories.">Guidelines for Safe Work Practices in Human and Animal Medical Diagnostic Laboratories.</a> MMWR Supplements. 61 (01), 1-101 (2012).</li><li>Anderegg, T. R., Biedenbach, D. J., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Initial+quality+control+evaluations+for+susceptibility+testing+of+Dalbavancin+(BI397),+an+investigational+glycopeptide+with+potent+gram-positive+activity.">Initial quality control evaluations for susceptibility testing of Dalbavancin (BI397), an investigational glycopeptide with potent gram-positive activity.</a> Journal of clinical microbiology. 41, 2795-2796 (2003).</li><li>Koeth, L. M., Windau, A. R., Goldstein, B. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+Broth+Microdilution+and+Agar+Dilution+Dalbavancin+and+Vancomycin+MIC+Results+for+42+Aerobic+Gram-positive+Bacteria.+Poster+132.">Comparison of Broth Microdilution and Agar Dilution Dalbavancin and Vancomycin MIC Results for 42 Aerobic Gram-positive Bacteria. Poster 132.</a> ASM. , (2012).</li><li>Fritsche, T. R., Rennie, R. P., Goldstein, B. P., Jones, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+dalbavancin+MIC+values+determined+by+Etest+(AB+BIODISK)+and+reference+dilution+methods+using+gram-positive+organisms.">Comparison of dalbavancin MIC values determined by Etest (AB BIODISK) and reference dilution methods using gram-positive organisms.</a> Journal of clinical microbiology. 44, 2988-2990 (2006).</li><li>Mushtaq, S., Warner, M., Johnson, A. P., Livermore, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Activity+of+dalbavancin+against+staphylococci+and+streptococci,+assessed+by+BSAC+and+NCCLS+agar+dilution+methods.">Activity of dalbavancin against staphylococci and streptococci, assessed by BSAC and NCCLS agar dilution methods.</a> The Journal of antimicrobial chemotherapy. 54, 617-620 (2004).</li><li>Jones, R. N., Flamm, R. K., Sader, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Surveillance+of+dalbavancin+potency+and+spectrum+in+the+United+States+(2012).">Surveillance of dalbavancin potency and spectrum in the United States (2012).</a> Diagnostic microbiology and infectious disease. 76, 122-123 (2013).</li></ol>

סנדרה מק&#39;קרדי הנו עובד Therapeutics Durata; מומחי מעבדה, Inc, מעסיק של לורה Koeth וJeanna פישר, היה חוזה על ידי Therapeutics Durata להכין את כתב היד. עמלות פרסום לכתבה זו שולמו על ידי מומחי מעבדה, Inc.

פרטי השיטה הבאות מוצגים לשיקולים נוספים בעת הכנה לבדיקת MIC dalbavancin. העיצוב של לוח MIC יהיה תלוי במספר סוכני מיקרוביאלית להיבדק (כלומר., Dalbavancin לבד או סוכנים מרובים) והמינים של חיידקים להיבדק. ריכוזי dalbavancin צריכים להקיף את נקודות העצירה הפרשניות לכל מיני החיידקים שנבדקו ואת כל הטווח של דילולים צפויים לפחות אחד זן QC. סדרת דילול מיקרוביאלית יכולה להיות מאורגנת בשורות או עמודות בהתאם למספר סוכני מיקרוביאלית ו / או מבודד / צלחת ושיטה של ​​חיסון. הנפח של אבקת מרק dalbavancin וצריך להיות מחושב כדי להבטיח שכמויות אופטימליות מיוצרות והפסולת היא מינימאלית. לדוגמא בשימוש בפרסום זה, כרכים מבוססים על הכנת שני פנלי MIC. מרק מילר הינטון קטיון הותאם צריך להיות מוכן וautoclaved לפי אדםההוראות ועקרות של התקשורת של ufacturer מאומתים. לוחות MIC יכולים להתבצע ומשמשים באותו יום של הכנה או שהם יכולים להיבדק עם אורגניזמים בקרת האיכות מתאימים ולוחות תוקף מאוחסנים קפוא לשימוש עתידי. חשוב להשתמש בטכניקות סטרילי לאורך כל ההליך. אין קריטריונים נוקשים לאימות של ריכוז הבידוד עם ספירת מושבה. ספירת מושבה יכולה להיבדק בתחילה לכל מינים נבדקו ו / או מעת לעת כדי לאמת את צעד הדילול מתבצע בשלב 4.2. חשוב שהתוקף של תקן מק &#39;פרלנד 0.5 גם בדק באופן שיגרתי עם E. coli ATCC 25922 באמצעות הליך דומה לצעד 4.5. אם התוצאות אינן שווה ערך ל1-2 x 10 8 CFU / ml, יש לקבל סטנדרטי מק &#39;פרלנד 0.5 חדש. אם ספירת המושבה מבארות MIC נמצא מחוץ לטווח המקובל (2-8 10 5 CFU תוצאות x / מיליליטר וMIC לבודד הקליני (ים) משתנות מהדואר צפוי התפלגות נורמלית (לדוגמא. 0.03-.12 UG / מיליליטר לS. aureus) ו / או תוצאות MIC לבודד בקרת איכות (ים) נמצאות מחוץ לטווח צפוי, בדיקות אימות היא הכרחיות ושינוי שיטה עשוי להיות מוצדקים. הוא הציע כי 0.5 סטנדרטי מק &#39;פרלנד תוקף משמש לחזור על ספירת המושבה (ים), ואם תוצאות הן שוב מחוץ לתוצאות צפויות, דילול הבידוד כפי שבוצע בשלב 4.2 צריך להיות בהתאם וMIC חוזר ונשנה. שים לב שבדיקת טוהר היא הכרחית גם אם ספירת מושבה מתבצעת כי הליך ספירת המושבה משתמש נפח מדולל שלא בהכרח לזהות ריכוזים נמוכים של אורגניזמים מזהמים. לבדיקת MIC להיחשב חוקית, צמיחה מקובלת חייבת להתרחש בשליטת הצמיחה גם. עבור רוב החיידקים שייבחנו נגד dalbavancin (כלומר., Staphylococci, סטרפטוקוקוס וenterococci, צמיחה שנראה כמו כפתור (בדרך כלל&gt; 2 מ&quot;מ) ופחות frequently, צמיחה עשויה להופיע כעכירות בבאר. בניגוד לכמה סוכני מיקרוביאלית שעשויה להפגין נגררים השפעת הריכוזים להגדיל, נקודות קצה dalbavancin מוגדרות בדרך כלל היטב. ישנם מכשירים שונים שנועדו להקל על הצפייה בדיקות microdilution הקריאה, אשר עשוי לשמש לקריאת צלחות המכילות dalbavancin כל עוד אין פשרה ביכולת להבחין בצמיחת הבארות. השלבים הקריטיים בפרוטוקול הקשורות לחלקים של ההליך שאינם קשורים למסיסות של dalbavancin ותוספת של P80. חשוב שאת הריכוז המרבי של dalbavancin משמש הוא לא יותר מ -1,600 / מיקרוגרם מיליליטר, DMSO המשמש כממס וכי ריכוזי ביניים ערוכים DMSO לפני ביצוע דילולים המרק כך שהריכוז הסופי של DMSO בMIC פנל הבארות אינן עולים על 1%. DMSO הוא hygroscopic ולכן, השימוש בבקבוקים ישנים יותר של DMSO היה consideratיון ביחס למסיסות dalbavancin. עם זאת, בעוד שמחקר BMD קטן עם זני בקרת האיכות הוכיח את זה לא כדי להיות משתנה חשוב (ראה סעיף תוצאות), זה תרגול טוב להשתמש בבקבוקים חדשים או שנפתחו לאחרונה של DMSO. כמו כן, חשוב שP80 מתווסף המרק בשלב האחרון של הכנת דילול תרופה והוא בריכוז סופי של 0.002% בMIC כן. הליך BMD כלול כאן מנצל הכנת לוחות MIC באמצעות 50 μl / גם בdalbavancin ו- P-80 ריכוזים שתי פעמים הריכוז הסופי ותוספת של הבידוד עם 50 μl / כל כך טוב שנפח סופי / גם הוא 100 μl. שיטה זו מאפשרת לפורמט פנל MIC אחד להיות מיוצר לבדיקה של שני ס aureus וס pneumoniae כי דם סוס lysed ניתן להוסיף לבידוד. שיטות אלטרנטיביות להכנת לוחות MIC באמצעות 100 μl / גם עם תוספת של עד 10 μl / גם מתוארות בנהלי CLSI ו- ISO. נקודת העצירה רגישה dalbavancin לס aureus הוא ≤0.12 מיקרוגרם / מיליליטר (עלון FDA). כפי שמוצג במעקב האחרון, רוב מבודדים מעוכבים על ידי dalbavancin ברמות של 0.06 מיקרוגרם / מיליליטר 15. עם נקודת עצירה רגישה קרוב לMIC מודאלית, כל שינוי בMIC כתוצאה מהבדלים בשיטה יכול להשפיע על שיעורי רגישות. בגלל הליך BMD לdalbavancin כולל כמה שלבים ייחודיים (במיוחד, השימוש בDMSO בהכנת מניות ודילולי תרופת ביניים וP80 0.002% בMIC טוב, זה הכרחי כי השיטה המיושמת בדיוק. האורגניזם S. aureus QC (ATCC 29,213) עם MIC מודאלי dalbavancin מאוד ברור של 0.06 מיליליטר מיקרוגרם /, היה אינדיקטור טוב של וריאציה שיטה ויש להשתמש באופן שיגרתי כדי לאמת את שיטת BMD. אם תוצאות MIC הן עם הטווח הצפוי של .03-.12 מיקרוגרם / מיליליטר, אך במגמה לאו נמוך או HIGצד שעות של טווח זה, אימות נוספת של השיטה היא מוצדקת. התוספת של P80 0.002% מומלצת לכל היצורים גרם-חיובי רלוונטי (staphylococcci, enterococci, וסטרפטוקוקוס.) עם זאת, ראוי לציין כי זה כבר הראה כי lysed דם סוס פועל בדומה לP-80 ביחס לה אנטי-מחייב יכולת וכי התוספת של P-80 לCAMHB + LHB אין כל השפעה נוספת על תוצאות MIC סטרפטוקוקוס dalbavancin. אין כרגע שיטת דיפוזיה דיסק לdalbavancin בדיקות ובגלל עניי המתאם של BMD ותוצאות הספירה, בדיקת רגישות של dalbavancin בשיטת הספירה אינו מומלצת 12, 14. שיטת BMD צריכה לשמש להערכה העתידית של רגישות dalbavancin וכתקן זהב לפיתוח בדיקות רגישות מיקרוביאלית מסחריות.

Dalbavancin הוא lipoglycopeptide חצי סינטטי שאושר על ידי ה- FDA מאי 2014 לטיפול בדלקות עור ומבנה עור חיידקים חריפים הנגרמות על ידי אורגניזמים גרם-חיובי 1. המטרה העיקרית של שיטה זו מפרטת בפורמט וידאו היא לספק הדרכה ברורה למדענים במעבדה ומחקרים הקליניים לבדיקה ודיווח של תוצאות רגישות dalbavancin מדויקות ושחזור. הנחישות של סוכן מיקרוביאלית MIC בשיטות מסחריות מבוצעת באופן שגרתי במעבדות קליניות להערכת הפעילות במבחנה של סוכן נגד חיידקים פתוגניים. השיטה המתוארת כאן היא שיטת microdilution מרק כפי שהומלץ על ידי CLSI וISO 2,3,4. מאז dalbavancin שיטות רגישות מסחריות אינן זמינות כעת (בזמן של פרסום זה) ודיפוזיה דיסק ושיטות דילול אגר אינם מומלצים F כרגעאו dalbavancin, שיטות דילול מרק התייחסות הן האפשרויות הזמינות הנוכחיות 12,14. כשיטת התייחסות זו היא לא מסחרית וFDA פינה במבחנה שיטת אבחון, מעבדות קליניות בארה&quot;ב המשתמשת בהליך זה לבדיקת מטופל חייב לציית לדרישות הרגולטוריות לבדיקת מעבדה פיתחה (LDT). זה צפוי כי ככל שעולה שימוש dalbavancin, תהיה יותר מעבדות צורך לבדוק מתחם זה. בדיקות Vancomycin כתחליף לקביעת רגישות dalbavancin של ס aureus אומת 5. עם זאת, dalbavancin עשוי להיות פעיל נגד ס ביניים vancomycin aureus (ויזה) ולכן, רופאים יכולים לבקש תוצאות MIC dalbavancin. בנוסף, תוצאות MIC למיני חיידקים אחרים ניתן לבקש. נקודת העצירה רגישה FDA לdalbavancin נגד ס aureus כבר נקבע ב≤0.12 מיקרוגרם / מיליליטר. ה- FDA הוקצה רק susceptiהקטגוריה ble בגלל המחסור בנתונים על בידודים עמידים. הפצת MIC הנורמלית בין הסוג בר ס aureus המבודד הוא בין 0.03-.12 מיקרוגרם / מיליליטר, עם MIC מודאלי ברור של 0.06 מיקרוגרם / מיליליטר. וריאציה קלה בתוצאות MIC בשל הבדל בשיטה, בנוסף לוריאצית BMD הטבועה של ± אחד דילול, עלולה להיות השפעה משמעותית על שיעורי הרגישות. 6 דומים לסוכני lipoglycopeptide אחרים, בדיקת רגישות dalbavancin יכולה להיות מאתגרות כתוצאה של מסיסות והגודל גדול יחסית של המולקולה ומאפייניה מחייבים 7,8,9. שיטת BMD ההתייחסות המתוארת כאן כוללת שני צעדים ספציפיים שהנם ייחודיים לסוכנים מסיסים ו / או סוכני lipoglycopeptide: (1) השימוש בDMSO להכנת פתרונות מניות ו( 2) תוספת של 0.002% P-80 בלוח MIC הסופי דילולים. המטרה של פרסום וידאו זה היא לספק בהירות לשיטת BMD dalbavancin ולspecifically להתמקד בצעדים מפתח אלה, כדי להבטיח תוצאות MIC מדויקות ושחזור.

<table><tbody><tr><td>Dalbavancin</td><td>Metrics, Inc.</td><td>Greenville, NC</td><td>BI-397</td></tr><tr><td>Vancomycin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>St. Louis, MO</td><td>C5793</td></tr><tr><td>Cation Adjusted Mueller Hinton Broth</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td>212322</td></tr><tr><td>Lysed horse blood</td><td>Cleveland Scientific</td><td>Bath, OH</td><td></td></tr><tr><td>Dose-it peristaltic pump</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td></td></tr><tr><td>Multi-channel pipet (Viaflo II)</td><td>Integra</td><td>Hudson, NH</td><td>4164</td></tr><tr><td>12 channel pipet (Matrix)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Single channelpPipets (Ovation 10 &amp;micro;l - 100 &amp;micro;l)</td><td>VistaLab</td><td>Brewster, NY</td><td></td></tr><tr><td>96 well microplate</td><td>Greiner Bio-one</td><td>Monroe, NC</td><td>650161</td></tr><tr><td>50 ml flat cap conical bottom centrifuge tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>16x125 mm disposable glass tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>12x17 mm snap cap, polystyrene tubes</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>16 ml centrifuge tubes</td><td>BioExpress</td><td>Kaysville, UT</td><td>C-3394-2</td></tr><tr><td>Reagent reservoirs</td><td>Integra Biosciences</td><td>Hudson, NH</td><td>4312</td></tr><tr><td>Disposable sterilelLoops (1 &amp;micro;l &amp;amp; 10 &amp;micro;l)</td><td>Biologix</td><td>Lenexa, KA</td><td>65-0001,65-0010</td></tr><tr><td>Tryptic soy agar + 5% sheep blood</td><td>Becton Dickinson</td><td>Sparks, MD</td><td></td></tr><tr><td>Incubator (ambient)</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Incubator (5% CO2)</td><td>Sanyo</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Analytical balance&amp;nbsp;</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>Waltham, MA</td><td></td></tr><tr><td>Gloves</td><td>Kimberly-Clark</td><td></td><td>52817</td></tr><tr><td>Lab coats</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

a reference broth microdilution method for dalbavancin in vitro susceptibility testing of bacteria that grow aerobically

בדיקת רגישות מיקרוביאלית (AST) מתבצעת על מנת להעריך את הפעילות במבחנה של סוכני מיקרוביאלית נגד חיידקים שונים. תוצאות AST, שבאות לידי ביטוי כריכוזים מעכבים מינימליים (מיקרופונים) משמשות במחקר לפיתוח ולניטור מיקרוביאלית של פיתוח עמידות ובהגדרה הקלינית להדרכת טיפול אנטיביוטיה. Dalbavancin הוא סוכן מיקרוביאלית lipoglycopeptide חצי סינטטי שאושר מאי 2014 על ידי מנהל המזון והתרופות אמריקניות (FDA) לטיפול בדלקות עור ומבנה עור חיידקים חריפים הנגרמות על ידי אורגניזמים גרם-חיוביים. היתרון של dalbavancin על טיפולים אנטי-staphylococcal הנוכחיים הוא זמן מחצית החיים הארוכים שלה, המאפשר למינון של פעם בשבוע. יש Dalbavancin פעילות נגד Staphylococcus aureus (כולל שני וmethicillin-רגיש S. aureus [MSSA] methicillin-resistant S. aureus [MRSA]) staphylococci, coagulase-שלילי, <em&gt; Streptococcus pneumoniae, קבוצת סטרפטוקוקוס anginosus, סטרפטוקוקוס β-המוליטית וenterococci רגיש vancomycin. בדומה לסוכנים אחרים האחרונים lipoglycopeptide, אופטימיזציה של שיטות בדיקת רגישות CLSI ומרק ISO כולל את השימוש של sulfoxide דימתיל (DMSO) כממס בעת הכנת פתרונות מניות וpolysorbate 80 (P80) כדי להקל על דבקותו של הסוכן לפלסטיק. לפני המחקרים הקליניים ובפיתוח הראשוני של dalbavancin, מחקרי רגישות לא בוצעו תוך השימוש בP-80 ותוצאות MIC נטו להיות גבוה פי 2-4 ובאופן דומה הגבוה MIC תוצאות שהושגו עם שיטת רגישות הדילול אגר. Dalbavancin נכלל לראשונה בשולחנות מתודולוגיה microdilution מרק CLSI בשנת 2005 ותוקן בשנת 2006 כדי להבהיר שימוש בDMSO ו- P-80. Microdilution מרק ההליך (BMD) מוצג כאן הוא ספציפי לdalbavancin והנו בהתאם לשיטות CLSI ו- ISO, עם פירוט וfoc צעד-אחר-צעדשלנו בשלבים הקריטיים הוסיף לבהירות.

Watch this Scientific Journal Video about A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically at JoVE.com

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology.

Microdilution שיטת ההפניה מרק לDalbavancin<em&gt; במבחנה</em&gt; בדיקה של רגישות חיידקים שגדלות אירובי

Antimicrobial susceptibility testing (AST) is performed to assess the in vitro activity of antimicrobial agents against various bacteria. The AST results, ...

a-reference-broth-microdilution-method-for-dalbavancin-vitro

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

28.9K Views.  Laboratory Specialists, Inc. Here, we present a protocol for determination of dalbavancin susceptibility of clinically relevant Gram-positive bacteria using a broth microdilution reference methodology. 

Video: A Reference Broth Microdilution Method for Dalbavancin In Vitro Susceptibility Testing of Bacteria that Grow Aerobically

Antimicrobial Susceptibility Testing of Mycobacterium Tuberculosis Complex for First and Second Line Drugs by Broth Dilution in a Microtiter Plate Format

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). Antimicrobial susceptibility testing (AST) of Mtb has traditionally been performed by the agar method of proportion or by 
macrobroth testing on an instrument such as the BACTEC (Becton Dickinson, Sparks, MD), VersaTREK (TREK Diagnostics, Cleveland, OH) or BacT/ALERT (bioM&eacute;rieux, Hazelwood, MO). The agar proportion method, while considered the &#x201C;gold&#x201D; standard of AST, is labor intensive and requires calculation of resistance by performing colony counts on drug-containing agar as compared to drug-free agar. If there is &ge;1% growth on the drug-containing medium as compared to drug-free medium, the organism is considered resistant to that drug. The macrobroth methods require instrumentation and test break point ("critical") drug concentrations for the first line drugs (isoniazid, ethambutol, rifampin, and pyrazinamide). The method described here is commercially available in a 96 well microtiter plate format [MYCOTB (TREK Diagnostics)] and contains increasing concentrations of 12 antimicrobials used for treatment of tuberculosis including both first (isoniazid, rifampin, ethambutol) and second line drugs (amikacin, cycloserine, ethionamide, kanamycin, moxifloxacin, ofloxacin, para-aminosalicylic acid, rifabutin, and streptomycin). Pyrazinamide, a first line drug, is not included in the microtiter plate due to its need for acidic test conditions. Advantages of the microtiter system include both ease of set up and faster turn around time (14 days) compared with traditional agar proportion (21 days). In addition, the plate can be set up from inoculum prepared using either broth or solid medium. Since the microtiter plate format is new and since Mtb presents unique safety challenges in the laboratory, this protocol will describe how to safely setup, incubate and read the microtiter plate.

Antimicrobial susceptibility testing of Mycobacterium tuberculosis is challenging but critical for patient care. This microtiter plate format offers testing of 12 antimycobacterial drugs and provides minimum inhibitory concentration (MIC) values, which will aid in appropriate treatment.

רגישות בדיקת Antimicrobial של קומפלקס שחפת Mycobacterium עבור תרופות הקו הראשון והשני על ידי דילול מרק בפורמט פלייט microtiter

The rapid detection of antimicrobial resistance is important in the effort to control the increase in resistant Mycobacterium 
tuberculosis (Mtb). ...

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

There is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from cystic fibrosis (CF) patients. Existing methods rely on single or a few isolates grown aerobically and planktonically. Predetermined cut-offs are used to define whether the bacteria are sensitive or resistant to any given antibiotic1. However, during chronic lung infections in CF, P. aeruginosa populations exist in biofilms and there is evidence that the environment is largely microaerophilic2. The stark difference in conditions between bacteria in the lung and those during diagnostic testing has called into question the reliability and even relevance of these tests3.
 Artificial sputum medium (ASM) is a culture medium containing the components of CF patient sputum, including amino acids, mucin and free DNA. P. aeruginosa growth in ASM mimics growth during CF infections, with the formation of self-aggregating biofilm structures and population divergence4,5,6. The aim of this study was to develop a microtitre-plate assay to study antimicrobial susceptibility of P. aeruginosa based on growth in ASM, which is applicable to both microaerophilic and aerobic conditions.
 An ASM assay was developed in a microtitre plate format. P. aeruginosa biofilms were allowed to develop for 3 days prior to incubation with antimicrobial agents at different concentrations for 24 hours. After biofilm disruption, cell viability was measured by staining with resazurin. This assay was used to ascertain the sessile cell minimum inhibitory concentration (SMIC) of tobramycin for 15 different P. aeruginosa isolates under aerobic and microaerophilic conditions and SMIC values were compared to those obtained with standard broth growth. Whilst there was some evidence for increased MIC values for isolates grown in ASM when compared to their planktonic counterparts, the biggest differences were found with bacteria tested in microaerophilic conditions, which showed a much increased resistance up to a &gt;128 fold, towards tobramycin in the ASM system when compared to assays carried out in aerobic conditions.
 The lack of association between current susceptibility testing methods and clinical outcome has questioned the validity of current methods3. Several in vitro models have been used previously to study P. aeruginosa biofilms7, 8. However, these methods rely on surface attached biofilms, whereas the ASM biofilms resemble those observed in the CF lung9 . In addition, reduced oxygen concentration in the mucus has been shown to alter the behavior of P. aeruginosa2 and affect antibiotic susceptibility10. Therefore using ASM under microaerophilic conditions may provide a more realistic environment in which to study antimicrobial susceptibility.

Use of Artificial Sputum Medium to Test Antibiotic Efficacy Against Pseudomonas aeruginosa in Conditions More Relevant to the Cystic Fibrosis Lung

Current diagnostic antimicrobial susceptibility testing relies on the planktonic growth of isolates in nutrient rich, aerobic conditions. Here, we employ an alternative artificial sputum medium to study antimicrobial susceptibility of Pseudomonas aeruginosa biofilms under both aerobic and microaerophilic conditions more representative of the cystic fibrosis lung.

שימוש בינוני כיח מלאכותית לבדיקת יעילות אנטיביוטי נגד<em&gt; Pseudomonas aeruginosa</em&gt; בתנאי רלוונטיים יותר ריאות סיסטיק פיברוזיס

There  is growing concern about the relevance of in vitro antimicrobial  susceptibility tests when applied to isolates of P. aeruginosa from  cystic ...

Visualization of the Charcoal Agar Resazurin Assay for Semi-quantitative, Medium-throughput Enumeration of Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the etiological agent of TB, is refractory to rapid and lasting chemotherapy due to the presence of bacilli exhibiting phenotypic drug resistance. The charcoal agar resazurin assay (CARA) was developed as a tool to characterize active molecules discovered by high-throughput screening campaigns against replicating and non-replicating M. tuberculosis. Inclusion of activated charcoal in bacteriologic agar medium helps mitigate the impact of compound carry-over, and eliminates the requirement to pre-dilute cells prior to spotting on CARA microplates. After a 7-10 day incubation period at 37 &#176;C, the reduction of resazurin by mycobacterial microcolonies growing on the surface of CARA microplate wells permits semi-quantitative assessment of bacterial numbers via fluorometry. The CARA detects approximately a 2-3 log10 difference in bacterial numbers and predicts a minimal bactericidal concentration leading to &#8805;99% bacterial kill (MBC&#8805;99). The CARA helps determine whether a molecule is active on bacilli that are replicating, non-replicating, or both. Pilot experiments using the CARA facilitate the identification of which concentration of test agent and time of compound exposure require further evaluation by colony forming unit (CFU) assays. In addition, the CARA can predict if replicating actives are bactericidal or bacteriostatic.

The charcoal agar resazurin assay (CARA) is a semi-quantitative, medium-throughput method to assess activity of test agents against mycobacteria that are replicating, non-replicating, or both. The CARA permits rapid evaluation of time- and concentration-dependent activity and identifies parameters to pursue by colony forming unit (CFU) assays.

ויזואליזציה של Assay Resazurin פחם אגר עבור וכמותיות, ספירת בינוני תפוקה של Mycobacteria

There is an urgent need to discover and progress anti-infectives that shorten the duration of tuberculosis (TB) treatment. Mycobacterium tuberculosis, the ...

Antimicrobial Synergy Testing by the Inkjet Printer-assisted Automated Checkerboard Array and the Manual Time-kill Method

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR bacteria are increasingly becoming a necessity. One such approach is combination therapy, in which two or more antibiotics are used together to treat an infection against which one or both of the drugs may be ineffective alone. When two drugs, in combination, exert a greater than additive effect, they are considered synergistic. In vitro investigation of synergistic activity is an important first step in evaluating the possible efficacy of drug combinations. Two main in vitro synergy testing methods have been developed: the checkerboard array and the time-kill study. In this paper, we present an automated checkerboard array method that makes use of inkjet printing technology to increase the efficiency and accuracy of this technique, as well as a standard manual time-kill synergy method. The automated checkerboard array can serve as a high-throughput screening assay, while the manual time-kill study provides additional, complementary data on synergistic activity and killing.
The checkerboard array is a modification of standard minimum inhibitory concentration (MIC) testing, in which bacteria are incubated with antibiotics at different concentration combinations and evaluated for growth inhibition after overnight incubation. Manual performance of the checkerboard array requires a laborious and error-prone series of calculations and dilutions. In the automated method presented here, the calculation and dispensing of required antibiotic stock solution volumes are automated through the use of inkjet printer technology. In the time-kill synergy assay, bacteria are incubated with the antibiotics of interest, both together and individually, and sampled at intervals over the course of 24 h for quantitative culture. The results can determine whether a combination is synergistic and whether it is bactericidal, and provide data on inhibition and killing of bacteria over time.

Antimicrobial synergy testing is used to evaluate the effect of two or more antibiotics used in combination and is typically performed by one of two methods: the checkerboard array or the time-kill assay. Here, we present an automated, inkjet printer-assisted checkerboard array synergy technique and a classic time-kill synergy study.

סינרגיה מיקרוביאלית בדיקות על ידי באמצעות מדפסת הזרקת דיו לוח שחמט אוטומטיות מערך ושיטת להרוג זמן ידנית

As rates of multidrug-resistant (MDR) pathogens continue to rise, outpacing the development of new antimicrobials, novel approaches to treatment of MDR ...

Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential nutrient or produces antimicrobial compounds that its competitor is not resistant to. Here we describe a deferred growth inhibition assay, a method for assessing the ability of one bacterium to inhibit the growth of another through the production of antimicrobial compounds or through competition for nutrients. This technique has been used to investigate the correlation of nasal isolates with the exclusion of particular species from a community. This technique can also be used to screen for lantibiotic producers or potentially novel antimicrobials. The assay is performed by first culturing the test inhibitor-producing strain overnight on an agar plate, then spraying over the test competitor strain and incubating again. After incubation, the extent of inhibition can be measured quantitatively, through the size of the zone of clearing around the inhibitor-producing strain, and qualitatively, by assessing the clarity of the inhibition zone. Here we present the protocol for the deferred inhibition assay, describe ways to minimize variation between experiments, and define a clarity scale that can be used to qualitatively assess the degree of inhibition.

The deferred growth inhibition assay can be used to assess the competition effect by one bacterial isolate on another. Inhibition is quantified by measuring the zone of clearing around the inhibitor-producing isolate, or qualitatively assessed by determining the visible extent of inhibition.

צמיחה נדחית Assay העיכוב לכמת את ההשפעה של antimicrobials הנגזר חיידקים על תחרות

Competitive exclusion can occur in microbial communities when, for example, an inhibitor-producing strain outcompetes its competitor for an essential ...

Biology

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this scenario, the search for new antifungal drugs is necessary. The protocol reported here details a method to screen peptides for their antifungal properties. It is based on the broth microdilution susceptibility test from the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI) M27-A3 guidelines with modifications to suit the research of antimicrobial peptides as potential new antifungals. This protocol describes a functional assay to evaluate the activity of antifungal compounds and may be easily modified to suit any particular class of molecules under investigation. Since the assays are performed in 96-well plates using small volumes, a large-scale screening can be completed in a short amount of time, especially if carried out in an automation setting. This procedure illustrates how a standardized and adjustable clinical protocol can help the bench-work pursuit of new molecules to improve the therapy of fungal diseases.

Broth Microdilution In Vitro Screening: An Easy and Fast Method to Detect New Antifungal Compounds

An easy and adaptable broth microdilution method for screening antifungal compounds and extracts.

מרק Microdilution במבחנה הקרנה: שיטה קלה ומהירה כדי לזהות תרכובות חדשות נגד פטריות

Fungal infections have become an important medical condition in the last decades, but the number of available antifungal drugs is limited. In this ...

Rapid Antimicrobial Susceptibility Testing by Stimulated Raman Scattering Imaging of Deuterium Incorporation in a Single Bacterium

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to &#65279;quantitatively determine the &#65279;antimicrobial effects on pathogens. &#65279;It typically takes days to complete the AST by conventional methods based on the long-time culture, and they do not work directly for clinical samples. Here, we report a rapid AST &#65279;method enabled by stimulated Raman scattering (SRS) imaging of deuterium oxide (D2O) metabolic incorporation. Metabolic incorporation of D2O into biomass and the metabolic activity inhibition upon exposure to antibiotics at the single bacterium level are monitored by SRS imaging. The&#65279; single-cell metabolism inactivation concentration (SC-MIC) of bacteria upon exposure to antibiotics can be obtained after a total of 2.5 h of sample preparation and detection. Furthermore, this rapid AST method is directly applicable to bacterial samples in complex biological environments, such as urine or whole blood. SRS metabolic imaging of deuterium incorporation is transformative for rapid single-cell phenotypic AST in the clinic.

This protocol presents rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) assay within 2.5 h by single-cell-stimulated Raman scattering imaging of D2O metabolism. This method applies to bacteria in the urine or whole blood environment, which is transformative for rapid single-cell phenotypic AST in the clinic.

בדיקת רגישות אנטי-מיקרוביאלית מהירה על ידי הדמיה מגורה של פיזור ראמאן של שילוב דאוטריום בחיידק יחיד

To slow and prevent the spread of antimicrobial resistant infections, rapid antimicrobial susceptibility testing (AST) is in urgent need to ...

Evaluating the Effectiveness of a Test Compound against Mycobacteria in Broth

Source: Zheng, X., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/55273">System for Efficacy and Cytotoxicity Screening of Inhibitors Targeting Intracellular Mycobacterium tuberculosis.</a> J. Vis. Exp. (2017)
This video demonstrates an in-broth assay to determine antibiotic efficacy against Mycobacterium tuberculosis. The bacterial culture is incubated with different concentrations of a bactericidal antibiotic. The bactericidal efficacy is measured by assessing the presence of viable bacteria using a resazurin assay.

הערכת היעילות של תרכובת בדיקה נגד מיקובקטריה במרק

1. Bacterial Strain and Growth Medium

	Make albumin dextrose and salt stock solution (ADS) by solubilizing 25 g of bovine serum albumin, 10.0 g of ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Immunology

Immunodiagnostics

Specialized Assays

A Deferred Growth Inhibition Assay to Evaluate the Effect of Bacteria-Derived Antimicrobial Compounds

Source: Moran, J. C. et al., <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/54437">Deferred Growth Inhibition Assay to Quantify the Effect of Bacteria-derived Antimicrobials on Competition.</a> J. Vis. Exp.&#160;(2016)
This video showcases the deferred growth inhibition assay, used to investigate how antimicrobial compounds produced by one type of bacteria affect another competing bacterial strain.

בדיקת עיכוב גדילה נדחית להערכת ההשפעה של תרכובות אנטי-מיקרוביאליות שמקורן בחיידקים

The following method is adapted&#160;to test competitor strains with inhibitor-producing strains.
NOTE: This protocol involves aerosol generation with ...

A Microtiter Plate Method to Assess the Minimum Inhibitory Concentration of an Antibiotic

Source: Ketelboeter, L. M., et al. <a href="https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/53105">Methods to Inhibit Bacterial Pyomelanin Production and Determine the Corresponding Increase in Sensitivity to Oxidative Stress.</a> J. Vis. Exp. (2015).
This video demonstrates a microtiter plate-based method for determining the Minimum Inhibitory Concentration (MIC) of test antibiotics against bacteria. Upon adding a suspension of the bacterial pathogen Pseudomonas aeruginosa to a microtiter plate containing serial dilutions of a test antibiotic, and an inhibitor of the production of pyomelanin by the bacteria, the optical density of the wells is measured to compute the minimum inhibitory concentration of the antibiotic, and the impact of the pyomelanin production inhibitor the antibiotic sensitivity of the bacteria.

שיטת צלחת מיקרוטיטר להערכת הריכוז המעכב המינימלי של אנטיביוטיקה

1. Antibiotic Minimum Inhibitory Concentration (MIC) Assay in 96-well Plates

	Set up overnight cultures of the strains to be tested in LB (Luria-Bertani) ...

Microdilution שיטת ההפניה מרק לDalbavancin

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video