Name: primary tumor and mef cell isolation to study lung metastasis
Uploaded: 2015-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis at JoVE.com

We would like to thank NIH, LACaTS and Ochsner clinic foundation for the financial support.

כל ניסויי העכבר נעשו בהתאם לפרוטוקולים שאושרו על ידי בעלי החיים המוסדיים הטיפול ושימוש בועדות (IACUC) של בית הספר לרפואה של LSU. כל המכשירים חייבים להיות autoclaved לפני הנתיחה. 1. הכנה של תאים ראשוניים מגידולי שד עכבר <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש במודל עכבר שהונדס גנטי עם וירוס עכבר החלב גידול Polyoma התיכון T-Antigen (עכבר MMTV-PyMT-מהונדס), אשר באופן ספונטני לפתח גידולים כפי שתואר בעבר 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים עם Isoflurane (99.9%) ולרסס 75% אתנול כדי להבטיח סביבת סטרילית (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את העור מאזור פתח השופכה לצוואר עם מספריים. הצמד את העור כלפי מטה, כדי לאפשר גישה קלה לאיברים (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבודד את הגידול בשד החלב ולשטוף עם פוספט סטרילי הקר שנאגרו (PBS) (pH 7.4) (איור 1 ג). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את הגידול לצלחת תרבות 10 ס&quot;מ רקמות סטריליים וקוצצת אותו בסכין גילוח סטרילי ומספריים כ 1 מ&quot;מ 3 חתיכות. יש לבצע את הפעולות הבאות בזרימה למינרית סטרילי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה רקמת גידול הקצוצה עם Collagenase מומס בתקשורת DMEM סרום ללא בריכוז סופי של 1 מ&quot;ג / מיליליטר על כיסא נדנדה לשעה 2 ב 37 מעלות צלזיוס. צנטריפוגה ההשעיה רקמת גידול 3 דקות ב 200 x גרם. הערה: הדגירה Collagenase חיונית לניתוק האנזימטית של הרקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בטל supernatant ולשטוף את המשקע 3 פעמים עם PBS (pH 7.4) על ידי צנטריפוגה במשך 3 דקות ב 200 x גרם. לאחר לשטוף הסופי, למזוג supernatant. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend רקמות עם 2 מיליליטר של EDTA טריפסין במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס בזמן nutating. צנטריפוגה ההשעיה למשך 3 דקות ב XG 200 ולחזור על שוטף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend גלולה הרקמה במדיום גידול רגיל (DMEM, 10% FBS, 2X עט / סטרפטוקוקוס) על צלחת 10 ס&quot;מ. שינויהתקשורת כל יום במשך 3 הימים הבאים. תרבות תאים עד מספר תא רצוי מתקבל. הערה: כ 1x10 7 תאים יהיו מבודדת מהליך זה. מודלים אחרים החלב עכבר tumorigenesis, כגון MMTV-Neu, נותנים תשואה נמוכה יותר של תאים בהשוואה לMMTV-PyMT. בעת שימוש במודלים המייצרים תשואה נמוכה יותר, זה מועיל להתחיל עם תאי גידול והתרבות גדולים יותר. </li></ol> 2. עכבר ריאות הפקה לדמיין ריאות גרורה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני מיצוי ריאות, להסיר את הכבד והסרעפת. לעקור את הצלעות מבלי להפריע לריאות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג נאה של מספריים, לפתוח את החלק העליון של קנה הנשימה שהוא קרוב יותר לוריד הצוואר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות קטטר, להזריק סוכן כגון 1 מיליליטר של Z-תיקון או דיו הודו דרך קנה הנשימה כדי למלא את הריאות (איור 2 א). להטביע את Z-לתקן ריאות בפרפין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דה-להכתים את הריאות הוזרקו דיו הודו בפתרון של Fekete(אלכוהול 100 מיליליטר 70%, 10 מיליליטר של 10% שנאגרו פורמלין, ו 5 מיליליטר של חומצה אצטית קרחונית) במשך 5 דקות. הגדר גושים סרטניים באתרים משניים עם ≥ 0.5 מ&quot;מ קוטר, לקבוע את הגושים כגרורות. הערה: בשל חסימת הסמפונות וbronchiole על ידי הגידול, גושים סרטניים לא יכולים לספוג 15% דיו הודו, ובכך רקמת ריאה נורמלית תהיה בשחור, וגושי גידול יהיו בצבע לבן 7. זה יאפשר להדמיה של גושים בודדים גידול (איור 2). </li></ol> 3. הכנת fibroblasts העכבר העוברית (MEFs) מהעכבר עוברים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להקריב עכברים בהריון עם Isoflurane (99.9%) ולרסס 75% אתנול כדי להבטיח סביבת סטרילית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את העור מאזור פתח השופכה לצוואר עם מספריים ולבודד את העוברים מהרחם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היזהר שלא להפריע לעוברים בעת פתיחת העור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קרן הרחם ולשטוף אותם בSTE הקרלהרגיז PBS (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את העובר מהשליה שלה בזהירות רבה ועוברי מקום בצלחת 10 ס&quot;מ המכילות קרח הקר PBS (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הראש, בכבד ובמעיים מן העובר ומניח את החלק שנותר בצלחת תרבית רקמה גם 12 המכילה PBS (pH 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר את גוף העובר לעוד EDTA טריפסין המכיל 12 צלחת היטב ולחתוך לחתיכות קטנות (~ 1 מ&quot;מ 3) באמצעות סכין גילוח סטרילי ומספריים. דגירה החומר הקצוץ עם 5 מיליליטר של EDTA טריפסין במשך 5 דקות על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשבית טריפסין על ידי הוספת 1 מיליליטר סרום שור עוברי (FBS) לעוברים הקצוצים. צנטריפוגה ההשעיה במהירות XG 200 במשך 10 דקות, להסיר בזהירות את supernatant, resuspend גלולה עם 1 מיליליטר של מדיום DMEM החם ולהעביר את כל התוכן לצלחת 10 ס&quot;מ המכילה FBS 10 מיליליטר של DMEM (עם 20% ו2X פניצילין / סטרפטומיצין ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות הבינוני בכל יום ליומיים. תרבות התאים עד תא רצוימספר מושגת. </li></ol>

<ol>
	<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).</li><li>Poste, G., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis.">The pathogenesis of cancer metastasis.</a> Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).</li><li>Wan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Metastasis+Moving+New+Biological+Insights+into+the+Clinic.">Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic.</a> Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li><li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch.">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).</li><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Identification+of+Experimental+Pulmonary+Metastases.">Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases.</a> J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).</li><li>Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+immunity+and+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+using+dendritic+cells+transfected+with+messenger+RNA+amplified+from+tumor+cells.">Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells.</a> Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li><li>Watts, A. M., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Tumor+Foci+in+an+Experimental+Murine+Tumor+Model+Using+Computer-Assisted+Video+Imaging.">Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging.</a> Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Established+Pulmonary+Metastases+and+Subcutaneous+Tumor+Mediated+by+the+Systemic+Administration+of+High-Dose+Recombinant+Interleukin+2.">Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2.</a> J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).</li><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis.">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).</li><li>Veer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer.">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li></ol>

יש הסופרים לא גילויים.

פרוטוקול זה הוא לבידוד תאים ראשוניים מגידול עכבר טרי. Lysates הוכן משיטה זו שימושי לחלבון, DNA וניתוח RNA. תאים סרטניים מהגידול השד הראשוני לעתים קרובות לשלוח גרורות למוח, הריאות ועצמות 1. כלול הוא טכניקה כדי לחלץ את הריאות לגילוי של גרורות. מכתים את הריאות עם כתם דיו יאפשר להדמיה של גושים סרטניים כפי שניתן לראות באיור 2. תיקון הריאות בפתרון Z-תיקון יאפשר לנו להפוך את הקטעים של ריאות, ואת הכתם עם נוגדנים המתאימים ללמוד מנגנונים גרורתי. כמו כן, נכלל הוא פרוטוקול לבידוד של fibroblasts העוברי של העכבר. זה שימושי להשוואת ביטוי גנים של תאי גידול הראשוניים עם פיברובלסטים העובריים באותו הסוג של בעלי החיים. בהכנה של תאים וMEFs ראשוניים, השלב הקריטי ביותר הוא המעושה של החומר. ללא פירוט ראוי, loמספר תא w יושג. אם ספירת תאים נמוכה מושגת, עדיין יכול להיות אחרי פרוטוקול, אבל התאים צריכים להיות מתורבת לתקופה ארוכה יותר של זמן .. בחילוץ הריאות, כתמים וdestaining נכונים הוא חיוניים כדי לאפשר להדמיה גולה גידול. כדי לחלץ RNA / חלבון מריאות, זה יהיה טוב לשימוש ריאות שבלא כתם ומבולבל. עם זאת, ניתן לחלץ RNA מרקמות קבועות וכן 8. מאז השלב גרורתי של סרטן השד מהווה את האיום הגדול ביותר לאדם המושפע 2, חשוב לדמיין את כל המרכיבים של יצירת גידולי שד. אתגר גדול בהבנת מנגנונים של התקדמות סרטן השד הוא הזמינות של דגמים שלסכם את ההתקדמות של המחלה 9. הבהרת המנגנונים המולקולריים של tumorigenesis שד וגרורות מושגות באמצעות מודלים של בעלי חיים, כגון עכברים 9, 10. הדרכים הנפוצות ביותר כדי לגרום לmousגידולי החלב דואר גנטית להנדס עכברים עם מראש סילוק מוטציות של אונקוגנים או מדכאי גידול, החדרת חומרים מסרטנים, והזרקת תאי סרטן פולשני מאוד 10-12. גידולים שהתקבלו לאחר מכן ניתן לנתח נוספים לביטוי גנים. למחקר סרטן השד, פרופיל ביטוי גנים הוא חשוב שכן הוא צופה תוצאה הקלינית של החולה 13. מגבלות מסוימות קיימות עם מודל העכבר של לימוד tumorigenesis החלב. למרות שעכברים לשתף דמיון מולקולרי ופיזיולוגי עם בני אדם, שהם לא תמיד לשחזר את כל ההיבטים של מחלות בבני אדם 5. זה צריך להילקח בחשבון בעת ​​שימוש בעכברים מהונדסים גנטי מסוימים. בסך הכל, מודלים עכבר מספקים דרך מציאותית יותר לנתח tumorigenesis החלב עכבר מעל דגמים הנוכחיים אחרים כגון תרבית רקמה וגידולים אנושיים מבודדים. יחדיו, פרוטוקול זה מאפשר לחקירה נוספת של היבטים שוניםשל tumorigenesis שד.

Metastasis is the final step in the progression of breast cancer 1. It involves a series of steps in which malignant cells are released from the primary tumor and disseminated to other organs 2. The cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system 3. Each step in tumorigenesis is tightly controlled by cells through various genetic and epigenetic changes 4. To study the mechanisms of breast cancer tumorigenesis, mouse model systems have been utilized due to their short lifespan, small size and fast breeding time. Some major advantages of using mouse models in cancer research are the molecular and physiological similarities they share with humans 5. 
Established mouse and human cell lines have been used extensively in breast cancer research. Although we can obtain some information about the steps in metastasis using these cells, genetically manipulated animal models with tumor suppressors/oncogenes will give far more information about tumor development and metastasis starting from the embryonic stage. Thus, with these mouse models, we can obtain genetic and developmental regulation of tumor growth. Furthermore, the tumor microenvironment also plays an important role in tumor cell gene expression and it can be difficult to mimic the same scenario with studies using established cell lines. Primary human mammary tumors can also be used to study mouse mammary tumorigenesis. The main disadvantage of using isolated breast tumors is that this newly implanted tumor does not have the mouse&#8217;s vasculature and lymphatic tissue. Whereas the genetic mouse model systems for studying mammary tumorigenesis will allow us to monitor the steps of metastasis, analyze the tumor microenvironment, and access to the entire body 5.
The overall goal of this protocol is to study breast tumorigenesis in mice. It is known that breast cancers typically metastasize to the brain, lung and bone. This protocol allows for the isolation of primary mammary tumor cells, as well as, studying breast cancer metastasis to the lung. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life&amp;nbsp; technologies</td><td>25300-062</td><td>Store at &amp;ndash; 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>Store at &amp;ndash; 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Store at &amp;ndash; 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life&amp;nbsp; technologies</td><td>15140-122</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>Store at &amp;ndash; 80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Z-fix</td><td>ANATECH</td><td>#174</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>India Ink</td><td>Yasutomo</td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>AERRANE (Isoflurane)</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-773-60</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMD</td><td>AX0441-3</td><td>Store at RT</td></tr></tbody></table>

primary tumor and mef cell isolation to study lung metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

שלב התקדמות גידול שבלהקריב בעלי החיים תלויים במחקר המסוים והנחיות IACUC. באיור 1 א, C57BL / 6 עכבר בן 100 יום עם וירוס גידול עכבר החלב Polyoma התיכון T-Antigen (MMTV-PyMT) הוקרב בשלושה חודשים. העור נפתח מאזור פתח השופכה לצוואר עם המספריים והעור היה מרותק כדי לאפשר גישה קלה לאיברים כפי שמוצגים באיור 1. זה אפשר גישה קלה לגידול שהושג באיור 1 ג. התאים הראשוניים המתקבלים מהגידולים הם דמיינו באיור 1D. מאז גנים רבים לתווך גרורות סרטן שד לריאות 1, חלצנו את הריאות (איור 2 א) ללמוד את התהליך גרורתי. הריאות היו מנופחת עם Z-תיקון ומוכתם בדיו הודו (איור 2) כדי להמחיש את הגושים הסרטניים. איור 3 מראה fibr העוברי של העכבר<html> אובלסט מבודד מעוברי עכברי זן FVB. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52609/52609fig1.jpg" /> איור 1. הכנה של תאים ראשוניים מגידולים בשד. () נקבת עכבר בן 100 יום עם Polyoma התיכון T-Antigen (PyMT) הוקרב. (ב) העור היה מרותק כדי לאפשר גישה קלה לגידול החלב. (ג) הגידול בשד נחתך מבעלי החיים . (ד) התאים הראשוניים המבודדים היו בתרבית בנשר בינוני השתנה Dulbecco (DMEM) בתוספת 10% בסרום שור עוברי ואנטיביוטיקה (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). התמונות מציגות את התאים ביום 3. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52609/52609fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> להעלות / 52,609 / 52609fig2.jpg &quot;/&gt; איור 2. מיצוי ריאות עכבר כדי להמחיש גרורות ריאות. () הריאות נופחו עם Z-תיקון ו (ב) מוכתם בכתמי דיו הודו לדמיין גושים סרטניים (סרגל קנה מידה: 500 מיקרומטר). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52609/52609fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52609/52609fig3.jpg" /> . תאי איור 3. הכנת fibroblasts העכבר העוברית (MEFs) מהעכבר עוברים MEF חולצו מעובר עכבר FVB (סרגל קנה מידה: 100 מיקרומטר). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52609/52609fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis at JoVE.com

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

primary-tumor-and-mef-cell-isolation-to-study-lung-metastasis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K Views.  Louisiana State University Health Sciences Center. The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Video: Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

ריאות הגידול תא גיוס Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Cancer Research

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

גרורה ניסויית Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary tumor cells from surgically resected, malignant pleural mesothelioma (MPM) by providing a complete overview of the process from digestion to enrichment, expansion, cryopreservation, and phenotypic characterization. In addition, this protocol introduces concepts for tumor generation that may be useful for multiple tumor types such as differential trypsinization and the impact of dissociation methods on the detection of cell surface markers for phenotypic characterization. The major limitation of this study is the selection of tumor cells that will expand in a two-dimensional (2D) culture system. Variations to this protocol, including three-dimensional (3D) culture systems, media supplements, plate coating to improve adhesion, and alternate disaggregation methods, could improve this technique and the overall success rate of establishing a tumor line. Overall, this protocol provides a base method for establishing and characterizing tumor cells from this rare tumor.

The goal of this method paper is to demonstrate a robust and reproducible methodology for the enrichment, generation, and expansion of primary tumor cell lines from surgically resected pleural mesothelioma.

ייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים וממאירים במליאה של Pleural

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

בדיקת הפצת תאי גידול מגרורות ריאה

Tracking Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases Using Photoconversion

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional process wherein cells from the primary tumor disseminate and seed metastases, tumor cells in existing metastases can also redisseminate and give rise to new lesions in tertiary sites in a process known as &#34;metastasis-from-metastases&#34; or &#34;metastasis-to-metastasis seeding.&#34; Metastasis-to-metastasis seeding may increase the metastatic burden and decrease the patient&#39;s quality of life and survival. Therefore, understanding the processes behind this phenomenon is crucial to refining treatment strategies for patients with metastatic cancer.
Little is known about metastasis-to-metastasis seeding, due in part to logistical and technological limitations. Studies on metastasis-to-metastasis seeding rely primarily on sequencing methods, which may not be practical for researchers studying the exact timing of metastasis-to-metastasis seeding events or what promotes or prevents them. This highlights the lack of methodologies that facilitate the study of metastasis-to-metastasis seeding. To address this, we have developed - and describe herein - a murine surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, allowing specific marking and fate tracking of tumor cells redisseminating from the lung to tertiary sites. To our knowledge, this is the only method for studying tumor cell redissemination and metastasis-to-metastasis seeding from the lungs that does not require genomic analysis.

מחבר זרקור: פענוח זריעת גרורות לגרורות באמצעות טכניקת In Vivo חדשה למעקב אחר התפשטות סרטן השד 

We present a method for studying tumor cell redissemination from lung metastases involving a surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, followed by the identification of redisseminated tumor cells in tertiary organs.

מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

גידול ראשוני ובידוד תא MEF לחקר ריאות גרורה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

ריאות הגידול תא גיוס Assay

גרורה ניסויית Assay

שיקולים מעשיים בלימוד כיבוש ריאות גרורתי אוסטאוסרקומה באמצעות וזמינותו גרורות בריאות

הקמת Assay קולוניזציה הריאה עבור מחזור הגידול ויזואליזציה תאים ברקמות הריאה

דגם לונג acellular וסלולריות ללמוד גרורות הגידול

ייצור והרחבה של קווי גידול ראשוניים וממאירים במליאה של Pleural

מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה

מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה

מעקב אחר הפצת תאי גידול מגרורות ריאה באמצעות פוטו-המרה

בידוד ואפיון של נויטרופילים עם תכונות אנטי-סרטניים