Name: primary tumor and mef cell isolation to study lung metastasis
Uploaded: 2015-05-20T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 31 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis at JoVE.com

We would like to thank NIH, LACaTS and Ochsner clinic foundation for the financial support.

وقد أجريت جميع التجارب الماوس وفقا للبروتوكولات التي وافقت عليها مؤسسات الرعاية الحيوانية واللجان الاستخدام (IACUC) من مدرسة LSU الطب. يجب تعقيمها جميع الصكوك قبل تشريح. 1. إعداد الخلايا الأولية من الفأر أورام الثدي <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام نموذج الفأر الذي تم هندستها وراثيا مع ورم الفيروسات ماوس الثديية التورام الأوسط T-مستضد (الماوس MMTV-PyMT المعدلة وراثيا)، الذي وضع بشكل عفوي الأورام كما هو موضح سابقا 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران مع isoflurane (99.9٪) ورذاذ 75٪ من الإيثانول لضمان بيئة معقمة (الشكل 1A). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الجلد من منطقة فتحة مجرى البول في الرقبة مع مقص. دبوس الجلد أسفل للسماح سهولة الوصول إلى أجهزة (الشكل 1B). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الورم الثدي الثدي ويغسل مع الفوسفات العقيمة الباردة مخزنة المالحة (PBS) (7.4 درجة الحموضة) (الشكل 1C). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الورم إلىمعقمة لوحة الثقافة 10CM النسيج وختم عليها بشفرة حلاقة معقمة ومقص لحوالي 1 ملم 3 قطع. يجب أن يتم تنفيذ الخطوات اللاحقة في معقم غطاء تدفق الصفحي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> احتضان الأنسجة السرطانية المفروم مع كولاجيناز الذائبة في المصل وسائل الاعلام DMEM مجانا بتركيز نهائي من 1mg / مل على الكرسي الهزاز لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية. الطرد المركزي تعليق نسيج الورم لمدة 3 دقائق في 200 ز س. ملاحظة: حضانة كولاجيناز أمر ضروري لتفارق الأنزيمية للأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تجاهل طاف ويغسل الراسب 3 مرات مع برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4) بواسطة الطرد المركزي لمدة 3 دقائق في 200 ز س. بعد غسل النهائي، صب طاف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend والأنسجة مع 2 مل من التربسين EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية في حين الإيماء. الطرد المركزي تعليق لمدة 3 دقائق في 200 x ج وكرر يغسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> resuspend الكرية الأنسجة في متوسط ​​النمو الطبيعي (DMEM، و 10٪ FBS، 2X القلم / بكتيريا) على طبق من ذهب 10CM. تغييروسائل الإعلام كل يوم لمدة 3 أيام القادمة. يتم الحصول على الخلايا الثقافة حتى عدد الخلايا المطلوبة. ملاحظة: سيتم عزل ما يقرب من 1X10 7 خلايا من هذا الإجراء. نماذج تكون الأورام الثديية الماوس الأخرى، مثل MMTV-نوي، وإعطاء محصول أقل من خلايا بالمقارنة مع MMTV-PyMT. عند استخدام النماذج التي تنتج العائد أقل، فمن المفيد أن تبدأ مع أكبر ورم والثقافة الخلايا لفترة أطول. </li></ol> 2. الرئة ماوس استخراج لتصور الرئة الانبثاث <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل استخراج الرئة، وإزالة الكبد والحجاب الحاجز. طرد الأضلاع دون إزعاج الرئتين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مع زوج جيد من مقص، فتح الجزء العلوي من القصبة الهوائية والتي هي أقرب إلى حبل الوريد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام القسطرة، حقن عامل مثل 1 مل من Z-الإصلاح أو الهند الحبر من خلال القصبة الهوائية لملء الرئتين (الشكل 2A). تضمين Z-إصلاح الرئتين في البارافين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> دي صمة عار على الرئتين حقن الحبر الهند في حل فيكيت ل(100 مل الكحول 70٪، و 10 مل من 10٪ من الفورمالين مخزنة، و 5 مل من حمض الخليك الجليدي) لمدة 5 دقائق. تحديد العقيدات ورم في مواقع الثانوية مع ≥ 0.5 مم في القطر، وتحديد العقيدات باسم الانبثاث. ملاحظة: نظرا لانسداد الشعب الهوائية والقصيبة من الورم، العقيدات الورم لا يمكن أن تمتص 15٪ الهند الحبر، وبالتالي أنسجة الرئة الطبيعية ستكون باللون الأسود، وسوف العقيدات ورم يكون في اللون الأبيض 7. وهذا سوف يسمح التصور العقيدات الورم الفردية (الشكل 2B). </li></ol> 3. إعداد الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS) من أجنة الفئران <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التضحية الفئران الحوامل مع isoflurane (99.9٪) ورذاذ 75٪ من الإيثانول لضمان بيئة معقمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الجلد من منطقة فتحة مجرى البول في الرقبة مع مقص وعزل الأجنة من الرحم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يجب الحرص على عدم تعكير صفو الأجنة عند فتح الجلد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة قرون الرحم وشطف لهم في الظريف البارديثير غضب PBS (7.4 درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فصل الجنين من المشيمة بدقة بالغة والأجنة مكان في لوحة 10CM تحتوي على الجليد الباردة PBS (7.4 درجة الحموضة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الرأس والكبد والأمعاء من الجنين ووضع الجزء المتبقي في 12 جيدا لوحة زراعة الأنسجة التي تحتوي على برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني 7.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل جثة الجنين إلى 12 لوحة جيدا تحتوي على التربسين EDTA آخر ومقطعة إلى قطع صغيرة (~ 1 مم 3) باستخدام شفرة حلاقة معقمة ومقص. احتضان المواد المفروم مع 5 مل من التربسين EDTA لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعطيل التربسين بإضافة 1 مل مصل بقري جنيني (FBS) للأجنة المفروم. الطرد المركزي تعليق على 200 سرعة x ج لمدة 10 دقيقة، وإزالة بعناية طاف، resuspend وبيليه مع 1 مل من المتوسط ​​الدافئة DMEM ونقل جميع المحتويات إلى طبق 10CM تحتوي على 10 مل من DMEM (مع 20٪ FBS و2X البنسلين / الستربتوميسين ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغيير المتوسطة كل يوم لمدة يومين. ثقافة الخلايا حتى الخلية المطلوبةيتم تحقيق الرقم. </li></ol>

<ol>
	<li>Minn, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genes+that+mediate+breast+cancer+metastasis+to+lung.">Genes that mediate breast cancer metastasis to lung.</a> Natur. 436 (7050), 518-524 (2005).</li><li>Poste, G., Fidler, I. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pathogenesis+of+cancer+metastasis.">The pathogenesis of cancer metastasis.</a> Natur. 283 (5743), 139-146 (1980).</li><li>Wan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumor+Metastasis+Moving+New+Biological+Insights+into+the+Clinic.">Tumor Metastasis Moving New Biological Insights into the Clinic.</a> Nat Med. 19 (11), 1450-1464 (2013).</li><li>Bergers, G., Benjamin, L. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumorigenesis+and+the+angiogenic+switch.">Tumorigenesis and the angiogenic switch.</a> Nat Rev Cancer. 3 (6), 401-410 (2003).</li><li>Frese, K. K., Tuveson, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maximizing+mouse+cancer+models.">Maximizing mouse cancer models.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 654-658 (2007).</li><li>Guy, C. T., Cardiff, R. D., Muller, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+mammary+tumors+by+expression+of+polyomavirus+middle+T+oncogene:+a+transgenic+mouse+model+for+metastatic+disease.">Induction of mammary tumors by expression of polyomavirus middle T oncogene: a transgenic mouse model for metastatic disease.</a> Mol Cell Biol. 12 (3), 954-961 (1992).</li><li>Wexler, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Accurate+Identification+of+Experimental+Pulmonary+Metastases.">Accurate Identification of Experimental Pulmonary Metastases.</a> J Natl Cancer Inst. 36 (4), 641-645 (1966).</li><li>Boczkowski, D., Nair, S. K., Nam, J. H., Lyerly, H. K., Gilboa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+tumor+immunity+and+cytotoxic+T+lymphocyte+responses+using+dendritic+cells+transfected+with+messenger+RNA+amplified+from+tumor+cells.">Induction of tumor immunity and cytotoxic T lymphocyte responses using dendritic cells transfected with messenger RNA amplified from tumor cells.</a> Cancer Res. 60 (4), 1028-1034 (2000).</li><li>Vargo-Gogola, T., Rosen, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Modelling+breast+cancer:+one+size+does+not+fit+all.">Modelling breast cancer: one size does not fit all.</a> Nat Rev Cancer. 7 (9), 659-672 (2007).</li><li>Watts, A. M., Kennedy, R. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitation+of+Tumor+Foci+in+an+Experimental+Murine+Tumor+Model+Using+Computer-Assisted+Video+Imaging.">Quantitation of Tumor Foci in an Experimental Murine Tumor Model Using Computer-Assisted Video Imaging.</a> Anal Bioche. 256 (2), 217-219 (1998).</li><li>Rosenberg, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regression+of+Established+Pulmonary+Metastases+and+Subcutaneous+Tumor+Mediated+by+the+Systemic+Administration+of+High-Dose+Recombinant+Interleukin+2.">Regression of Established Pulmonary Metastases and Subcutaneous Tumor Mediated by the Systemic Administration of High-Dose Recombinant Interleukin 2.</a> J Exp Me. 161 (5), 1169-1188 (1985).</li><li>Fantozzi, A., Christofori, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mouse+models+of+breast+cancer+metastasis.">Mouse models of breast cancer metastasis.</a> Breast Cancer Re. 8 (4), 212 (2006).</li><li>Veer, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+profiling+predicts+clinical+outcome+of+breast+cancer.">Gene expression profiling predicts clinical outcome of breast cancer.</a> Nature. 415 (6871), 530-536 (2002).</li></ol>

الكتاب ليس لديهم الإفصاحات.

هذا البروتوكول هو لعزل الخلايا الأولية من ورم الماوس الطازجة. لست] أعدت من هذه الطريقة مفيدة للبروتين، وتحليل الحمض النووي RNA. الخلايا السرطانية من الورم الثدي الرئيسي في كثير من الأحيان metastasize إلى الدماغ والرئة والعظام 1. وشملت هو تقنية لاستخراج الرئة للكشف عن ورم خبيث. وتلطيخ الرئة مع الحبر وصمة عار السماح لتصور العقيدات الورم كما رأينا في الشكل 2B. وتحديد الرئتين في حل Z-الإصلاح تسمح لنا لجعل أجزاء من الرئتين، وصمة عار مع الأجسام المضادة التي تكون مناسبة لدراسة آليات النقيلي. وشملت أيضا هو بروتوكول لعزل الخلايا الليفية الماوس الجنينية. وهذا مفيد لمقارنة التعبير الجيني للخلايا السرطانية الأولية مع الخلايا الليفية الجنينية في نوع الحيوان نفسه. في إعداد الخلايا الأولية وMEFS، الخطوة الأكثر أهمية هي تنميق للمادة. دون انهيار الصحيح، لووسيتم تحقيق عدد الخلايا ث. إذا تم التوصل إلى عدد خلايا منخفض، والبروتوكول لا يزال من الممكن اتباعها، ولكن سوف تحتاج الخلايا إلى أن تربيتها لفترة أطول من الزمن .. في استخراج الرئة، وتلطيخ السليم وdestaining أمر ضروري للسماح للورم العقيدات التصور. لاستخراج الحمض النووي الريبي / البروتين من الرئتين، وسوف تكون جيدة لاستخدام الرئتين التي هي غير ملوثين وغير المثبتة. ومع ذلك، RNA يمكن استخلاصها من الأنسجة الثابتة فضلا 8. منذ مرحلة النقيلي سرطان الثدي يشكل أكبر تهديد للفرد 2 المتضررين، من المهم أن تصور كل مكونات تكون الأورام الثدي. ويتمثل التحدي الرئيسي في فهم آليات تطور سرطان الثدي هو توافر النماذج التي تلخص تطور المرض 9. وتتحقق توضيح الآليات الجزيئية لتكون الأورام الثدي والانبثاث باستخدام نماذج حيوانية، مثل الفئران 9، 10. وأكثر الطرق شيوعا للحث على مذكرات التفاهمالبريد الأورام الثديية والمهندس وراثيا لفئران مصابة طفرات الجينات المسرطنة أو المكثفات الورم والحيلولة دون و، وإدخال المواد المسببة للسرطان، وحقن الخلايا السرطانية الغازية غاية 10-12. ويمكن بعد ذلك الأورام التي تم الحصول عليها أن تحلل أيضا عن التعبير الجيني. لأبحاث سرطان الثدي، والتنميط التعبير الجيني مهم لأنه يتوقع نتائج السريرية للمريض 13. توجد بعض القيود مع نموذج الفأر لدراسة تكون الأورام الثديية. على الرغم من أن الفئران تشترك التشابه الجزيئية والفيزيولوجية مع البشر، فإنها لا ألخص دائما كل جوانب الأمراض التي تصيب الإنسان 5. يجب أن يؤخذ هذا في الاعتبار عند استخدام بعض الفئران المعدلة وراثيا. عموما، نماذج الماوس توفر وسيلة أكثر واقعية لتحليل الماوس الثدي تكون الأورام على النماذج الحالية أخرى مثل زراعة الأنسجة والأورام البشرية معزولة. معا، هذا البروتوكول يسمح لمزيد من التحقيقات من جوانب مختلفةمن تكون الأورام الثدي.

Metastasis is the final step in the progression of breast cancer 1. It involves a series of steps in which malignant cells are released from the primary tumor and disseminated to other organs 2. The cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system 3. Each step in tumorigenesis is tightly controlled by cells through various genetic and epigenetic changes 4. To study the mechanisms of breast cancer tumorigenesis, mouse model systems have been utilized due to their short lifespan, small size and fast breeding time. Some major advantages of using mouse models in cancer research are the molecular and physiological similarities they share with humans 5. 
Established mouse and human cell lines have been used extensively in breast cancer research. Although we can obtain some information about the steps in metastasis using these cells, genetically manipulated animal models with tumor suppressors/oncogenes will give far more information about tumor development and metastasis starting from the embryonic stage. Thus, with these mouse models, we can obtain genetic and developmental regulation of tumor growth. Furthermore, the tumor microenvironment also plays an important role in tumor cell gene expression and it can be difficult to mimic the same scenario with studies using established cell lines. Primary human mammary tumors can also be used to study mouse mammary tumorigenesis. The main disadvantage of using isolated breast tumors is that this newly implanted tumor does not have the mouse&#8217;s vasculature and lymphatic tissue. Whereas the genetic mouse model systems for studying mammary tumorigenesis will allow us to monitor the steps of metastasis, analyze the tumor microenvironment, and access to the entire body 5.
The overall goal of this protocol is to study breast tumorigenesis in mice. It is known that breast cancers typically metastasize to the brain, lung and bone. This protocol allows for the isolation of primary mammary tumor cells, as well as, studying breast cancer metastasis to the lung. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis.

<table><tbody><tr><td>DMEM</td><td>HyClone</td><td>SH30243.01</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>0.05% Trypsin-EDTA</td><td>Life&amp;nbsp; technologies</td><td>25300-062</td><td>Store at &amp;ndash; 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Collagenase Type IV</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C5138</td><td>Store at &amp;ndash; 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3506</td><td>Store at &amp;ndash; 20 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Pen Strep</td><td>Life&amp;nbsp; technologies</td><td>15140-122</td><td>Store at 4 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Fetal Bovine Serum (FBS)</td><td>Gemini Bio-Products</td><td>100-106</td><td>Store at &amp;ndash; 80 &amp;deg;C</td></tr><tr><td>Z-fix</td><td>ANATECH</td><td>#174</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>India Ink</td><td>Yasutomo</td><td></td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>AERRANE (Isoflurane)</td><td>Baxter</td><td>NDC 10019-773-60</td><td>Store at RT</td></tr><tr><td>Ethanol</td><td>EMD</td><td>AX0441-3</td><td>Store at RT</td></tr></tbody></table>

primary tumor and mef cell isolation to study lung metastasis

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered genotypes now possess the ability to invade and survive in other tissues. In this protocol, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. The cells isolated from this procedure are then available for gene profiling experiments. For successful metastasis, these cells must be able to intravasate, survive in circulation, extravasate to distant organs, and survive in that new organ system. The lungs are the typical target of breast cancer metastasis. A set of genes have been discovered that mediates the selectivity of metastasis to the lung. Here we describe a method of studying lung metastasis from a genetically engineered mouse model.. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts (MEFs) from the mouse embryo is included. MEF cells from the same animal type provide a clue of non-cancer cell gene expression. Together, these techniques are useful in studying mouse mammary tumorigenesis, its associated signaling mechanisms and pathways of the abnormalities in embryos.

مرحلة تطور الورم الذي للتضحية الحيوان تعتمد على دراسة معينة ومبادئ توجيهية IACUC. في الشكل 1A، وهو القديم C57BL / 6 الماوس 100 يوم مع ورم الفيروسات ماوس الثديية التورام الأوسط T-مستضد (MMTV-PyMT) وضحى في ثلاثة أشهر. وافتتح الجلد من منطقة فتحة مجرى البول في الرقبة مع مقص والجلد وتمركزها للسماح سهولة الوصول إلى الأجهزة كما هو مبين في الشكل 1B. هذا يسمح سهولة الوصول إلى الورم التي تم الحصول عليها في الشكل 1C. وتصور الخلايا الأولية التي تم الحصول عليها من الأورام في الشكل 1D. منذ العديد من الجينات توسط الثدي الانبثاث سرطان الرئة إلى 1، ونحن استخراج الرئتين (الشكل 2A) لدراسة عملية النقيلي. وقد تضخم الرئة مع Z-الإصلاح وملطخة الهند الحبر (الشكل 2B) لتصور العقيدات الورم. ويبين الشكل 3 الماوس fibr الجنينية<html> أقاليم معزولة عن FVB أجنة سلالة الماوس. <img alt="الشكل 1" src="/files/ftp_upload/52609/52609fig1.jpg" /> الشكل 1. إعداد الخلايا الأولية من أورام الثدي. (A) فأر الإناث البالغ 100 يوم مع تورام الأوسط T-مستضد (PyMT) وضحى (B) والجلد وتمركزها للسماح سهولة الوصول إلى الورم الثديية. (C) وقطع ورم الثدي من الحيوان (D) وكانت الخلايا الأولية المعزولة المستزرعة في Dulbecco لتعديل النسر المتوسطة (DMEM) تستكمل مع 10٪ مصل بقري جنيني والمضادات الحيوية (شريط مقياس: 100 ميكرون). الصور تعرض الخلايا في اليوم 3. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52609/52609fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> تحميل / 52609 / 52609fig2.jpg &quot;/&gt; الشكل 2. استخراج الرئة ماوس لتصور الانبثاث الرئة. (A) وتضخم الرئة مع Z-الإصلاح و(B) ملطخة الهند الحبر لتصور العقيدات الورم (شريط مقياس: 500 ميكرون). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52609/52609fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a> <img alt="الشكل (3)" src="/files/ftp_upload/52609/52609fig3.jpg" /> تم استخراج الرقم 3. إعداد الفأر الجنينية الخلايا الليفية (MEFS) من أجنة الفئران MEF خلايا من جنين فأر FVB (شريط مقياس: 100 ميكرون). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52609/52609fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis at JoVE.com

Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

ورم الابتدائي وMEF عزل الخلايا لدراسة الرئة الانبثاث

In breast tumorigenesis, the metastatic stage of the disease poses the greatest threat to the affected individual. Normal breast cells with altered ...

primary-tumor-and-mef-cell-isolation-to-study-lung-metastasis

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

15.8K Views.  Louisiana State University Health Sciences Center. The goal of this protocol is to study breast tumorigenesis. With this technique, mouse mammary tumors are removed and primary cells are prepared from tumors. A lung extraction protocol is included for studying lung metastasis. Furthermore, another protocol for analyzing mouse embryonic fibroblasts from the mouse embryo is included.

Video: Primary Tumor and MEF Cell Isolation to Study Lung Metastasis

Lung Tumor Cell Recruitment Assay

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we demonstrate a simple assay to evaluate tumor cell extravasation or micrometastasis. In this assay, tumor cells were injected through the tail vein, and after a short period, the lungs were dissected and digested to count the accumulated labeled tumor cells. This assay skips the initial step of primary tumor invasion into the blood vessel and facilitates the study of events in the distant organ where tumor metastasis occurs. The number of cells injected into the blood vessel can be optimized to observe a limited number of metastases. It has been reported that stromal cells in the distant organ contribute to metastasis. Thus, this assay could be a useful tool to explore potential therapeutic drugs or devices for prevention of tumor metastasis.

This manuscript describes a method to quantify tumor cell accumulation in the lungs in an animal model of tumor metastasis.

الرئة ورم الخلية تجنيد الإنزيم

To investigate the molecular mechanisms governing tumor metastasis, various assays using the mouse as a model animal have been proposed. Here, we ...

Cancer Research

Experimental Metastasis Assay

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients. To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established using immunodeficient mice. This article delineates the procedures involved in this assay, including sample preparation, intravenous injection, and culturing cells from lung metastases. Briefly, a pre-determined number of human cancer cells were prepared in vitro and directly injected into the circulation of immunodeficient mice through their tail veins. A small number of cells survive the turbulence in the circulation and grow as metastases in internal organs, such as lung. The injected mice are dissected after a certain period. The tissue distribution of metastases is determined under a dissecting microscope. The number of metastases in a specific tissue is counted and it directly correlates with the metastatic ability of the injected cancer cells. The arisen metastases are isolated and cultured in vitro as cell lines, which often show enhanced metastatic abilities than the parental line when injected again into immunodeficient mice. These highly metastatic derivatives become useful tools for identifying genes or molecular pathways that regulate metastatic progression.

This article describes the procedures of an experimental metastasis assay that is used to determine the metastatic potential of human cancer cell lines.

الفحص التجريبي الإنبثاث

Metastasis is the leading cause of death in cancer patients.  To understand the mechanism of metastasis, an experimental metastasis assay was established ...

Practical Considerations in Studying Metastatic Lung Colonization in Osteosarcoma Using the Pulmonary Metastasis Assay

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung colonization in osteosarcoma (OS) by fluorescence microscopy. This article provides a detailed description of the protocol, and discusses examples of obtaining image data on metastatic growth using widefield or confocal fluorescence microscopy platforms. The flexibility of the PuMA model permits researchers to study not only the growth of OS cells in the lung microenvironment, but also to assess the effects of anti-metastatic therapeutics over time. Confocal microscopy allows for unprecedented, high-resolution imaging of OS cell interactions with the lung parenchyma. Moreover, when the PuMA model is combined with fluorescent dyes or fluorescent protein genetic reporters, researchers can study the lung microenvironment, cellular and subcellular structures, gene function, and promoter activity in metastatic OS cells. The PuMA model provides a new tool for osteosarcoma researchers to discover new metastasis biology and assess the activity of novel anti-metastatic, targeted therapies.

The goal of this article is to provide a detailed description of the protocol for the pulmonary metastasis assay (PuMA). This model permits researchers to study metastatic osteosarcoma (OS) cell growth in lung tissue using a widefield fluorescence or confocal laser-scanning microscope.

الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

The pulmonary metastasis assay (PuMA) is an ex vivo lung explant and closed cell culture system that permits researchers to study the biology of lung ...

The Establishment of a Lung Colonization Assay for Circulating Tumor Cell Visualization in Lung Tissues

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by CTCs critically contributes to early lung metastatic processes, has been vigorously investigated. As such, animal models are the only approach that captures the full systemic process of metastasis. Given that problems occur in previous experimental designs for examining the contributions of CTCs to blood vessel extravasation, we established an in vivo lung colonization assay in which a long-term-fluorescence cell-tracer, carboxyfluorescein succinimidyl ester (CFSE), was used to label suspended tumor cells and lung perfusion was performed to clear non-specifically trapped CTCs prior to lung removal, confocal imaging, and quantification. Polymeric fibronectin (polyFN) assembled on CTC surfaces has been found to mediate lung colonization in the final establishment of metastatic tumor tissues. Here, to specifically test the requirement of polyFN assembly on CTCs for lung colonization and extravasation, we performed short term lung colonization assays in which suspended Lewis lung carcinoma cells (LLCs) stably expressing FN-shRNA (shFN) or scramble-shRNA (shScr) and pre-labeled with 20 &#956;M of CFSE were intravenously inoculated into C57BL/6 mice. We successfully demonstrated that the abilities of shFN LLC cells to colonize the mouse lungs were significantly diminished in comparison to shScr LLC cells. Therefore, this short-term methodology may be widely applied to specifically demonstrate the ability of CTCs within the circulation to colonize the lungs.

An animal model is needed to decipher the role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting lung colonization during cancer metastasis. Here, we established and successfully performed an in vivo assay to specifically test the requirement of polymeric fibronectin (polyFN) assembly on CTCs for lung colonization.

إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة

Metastasis is the major cause of cancer death. The role of circulating tumor cells (CTCs) in promoting cancer metastasis, in which lung colonization by ...

Acellular and Cellular Lung Model to Study Tumor Metastasis

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor cells with a natural matrix and continual flow of nutrients, as well as a model that shows the interaction of tumor cells with normal cellular components and a natural matrix. The acellular ex vivo lung model is created by isolating a rat heart-lung block and removing all the cells using the decellularization process. The right main bronchus is tied off and tumor cells are placed in the trachea by a syringe. The cells move and populate the left lung. The lung is then placed in a bioreactor where the pulmonary artery receives a continual flow of media in a closed circuit. The tumor grown on the left lung is the primary tumor. The tumor cells that are isolated in the circulating media are circulating tumor cells and the tumor cells in the right lung are metastatic lesions. The cellular ex vivo lung model is created by skipping the decellularization process. Each model can be used to answer different research questions.

Here, we present a protocol for an ex vivo lung cancer model that mimics the steps of tumor progression and helps to isolate a primary tumor, circulating tumor cells, and metastatic lesions.

نموذج الرئة اللاخلوي والخلوية لدراسة ورم خبيث

It is difficult to isolate tumor cells at different points of tumor progression. We created an ex vivo lung model that can show the interaction of tumor ...

Generation and Expansion of Primary, Malignant Pleural Mesothelioma Tumor Lines

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary tumor cells from surgically resected, malignant pleural mesothelioma (MPM) by providing a complete overview of the process from digestion to enrichment, expansion, cryopreservation, and phenotypic characterization. In addition, this protocol introduces concepts for tumor generation that may be useful for multiple tumor types such as differential trypsinization and the impact of dissociation methods on the detection of cell surface markers for phenotypic characterization. The major limitation of this study is the selection of tumor cells that will expand in a two-dimensional (2D) culture system. Variations to this protocol, including three-dimensional (3D) culture systems, media supplements, plate coating to improve adhesion, and alternate disaggregation methods, could improve this technique and the overall success rate of establishing a tumor line. Overall, this protocol provides a base method for establishing and characterizing tumor cells from this rare tumor.

The goal of this method paper is to demonstrate a robust and reproducible methodology for the enrichment, generation, and expansion of primary tumor cell lines from surgically resected pleural mesothelioma.

توليد وتوسيع خطوط ورم المتوسطة الجنبي الأولي الخبيث

Current methodologies for the expansion of primary tumor cell lines from rare tumor types are lacking. This protocol describes methods to expand primary ...

فحص انتشار الخلايا السرطانية من نقائل الرئة

Tracking Tumor Cell Dissemination from Lung Metastases Using Photoconversion

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional process wherein cells from the primary tumor disseminate and seed metastases, tumor cells in existing metastases can also redisseminate and give rise to new lesions in tertiary sites in a process known as &#34;metastasis-from-metastases&#34; or &#34;metastasis-to-metastasis seeding.&#34; Metastasis-to-metastasis seeding may increase the metastatic burden and decrease the patient&#39;s quality of life and survival. Therefore, understanding the processes behind this phenomenon is crucial to refining treatment strategies for patients with metastatic cancer.
Little is known about metastasis-to-metastasis seeding, due in part to logistical and technological limitations. Studies on metastasis-to-metastasis seeding rely primarily on sequencing methods, which may not be practical for researchers studying the exact timing of metastasis-to-metastasis seeding events or what promotes or prevents them. This highlights the lack of methodologies that facilitate the study of metastasis-to-metastasis seeding. To address this, we have developed - and describe herein - a murine surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, allowing specific marking and fate tracking of tumor cells redisseminating from the lung to tertiary sites. To our knowledge, this is the only method for studying tumor cell redissemination and metastasis-to-metastasis seeding from the lungs that does not require genomic analysis.

تسليط الضوء على المؤلف: فك تشفير البذر من ورم خبيث إلى ورم خبيث باستخدام تقنية جديدة في الجسم الحي لتتبع انتشار سرطان الثدي 

We present a method for studying tumor cell redissemination from lung metastases involving a surgical protocol for the selective photoconversion of lung metastases, followed by the identification of redisseminated tumor cells in tertiary organs.

تتبع انتشار الخلايا السرطانية من نقائل الرئة باستخدام التحويل الضوئي

Metastasis - the systemic spread of cancer - is the leading cause of cancer-related deaths. Although metastasis is commonly thought of as a unidirectional ...

Isolation and Characterization of Neutrophils with Anti-Tumor Properties

Neutrophils, the most abundant of all white blood cells in the human circulation, play an important role in the host defense against invading microorganisms. In addition, neutrophils play a central role in the immune surveillance of tumor cells. They have the ability to recognize tumor cells and induce tumor cell death either through a cell contact-dependent mechanism involving hydrogen peroxide or through antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity (ADCC). Neutrophils with anti-tumor activity can be isolated from peripheral blood of cancer patients and of tumor-bearing mice. These neutrophils are termed tumor-entrained neutrophils (TEN) to distinguish them from neutrophils of healthy subjects or na&#239;ve mice that show no significant tumor cytotoxic activity. Compared with other white blood cells, neutrophils show different buoyancy making it feasible to obtain a &#62; 98% pure neutrophil population when subjected to a density gradient. However, in addition to the normal high-density neutrophil population (HDN), in cancer patients, in tumor-bearing mice, as well as under chronic inflammatory conditions, distinct low-density neutrophil populations (LDN) appear in the circulation. LDN co-purify with the mononuclear fraction and can be separated from mononuclear cells using either positive or negative selection strategies. Once the purity of the isolated neutrophils is determined by flow cytometry, they can be used for in vitro and in vivo functional assays. We describe techniques for monitoring the anti-tumor activity of neutrophils, their ability to migrate and to produce reactive oxygen species, as well as monitoring their phagocytic capacity ex vivo. We further describe techniques to label the neutrophils for in vivo tracking, and to determine their anti-metastatic capacity in vivo. All these techniques are essential for understanding how to obtain and characterize neutrophils with anti-tumor function.

Neutrophils play an important role not only in host defense against invading microorganisms, but are also involved in the immune surveillance of tumor cells. Here, we describe techniques related to the isolation of neutrophils with anti-tumor properties and methods for monitoring anti-tumor neutrophil function in vitro and in vivo.

ورم الابتدائي وMEF عزل الخلايا لدراسة الرئة الانبثاث

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

الرئة ورم الخلية تجنيد الإنزيم

الفحص التجريبي الإنبثاث

الاعتبارات العملية في دراسة الاستعمار الرئة المنتشر في أوستيوساركوما باستخدام مقايسة خبيث الرئوية

إنشاء مقايسة الاستعمار الرئة لتعميم التصور خلية الورم في أنسجة الرئة

نموذج الرئة اللاخلوي والخلوية لدراسة ورم خبيث

توليد وتوسيع خطوط ورم المتوسطة الجنبي الأولي الخبيث

تتبع انتشار الخلايا السرطانية من نقائل الرئة باستخدام التحويل الضوئي

تتبع انتشار الخلايا السرطانية من نقائل الرئة باستخدام التحويل الضوئي

تتبع انتشار الخلايا السرطانية من نقائل الرئة باستخدام التحويل الضوئي

عزل وتوصيف العدلات مع خصائص مضادة للورم