Name: optical mapping of intra-sarcoplasmic reticulum ca2+ and transmembrane potential in the langendorff-perfused rabbit heart
Uploaded: 2015-09-10T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 26 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart at JoVE.com

This work was supported in part by the US National Institutes of Health (R01 HL 111600) and the American Heart Association (12SDG9010015).

כל הנהלים הקשורים בעלי חיים אושרו על ידי ועדת הטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת קליפורניה, דייוויס, ודבקו במדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה שפורסם על ידי המכון הלאומי לבריאות. 1. הכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן שתי מניות (25x) מרוכזות של הפתרון של Tyrode שונה מראש ולאחסן ב 4 ° C: (1) במלאי אני (מ&quot;מ: 3,205 NaCl, CaCl 2 32.5, KCl 117.5, Nah 2 PO 4 29.75, MgCl 2 26.25) ו (2) במלאי II (מ&quot;מ: NaHCO 3 500). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טרי להכין הפתרון של 2 L Tyrode של הרכב הבא (מ&quot;מ): NaCl 128.2, CaCl 2 1.3, KCl 4.7, MgCl 2 1.05, Nah 2 4 1.19 PO, NaHCO 3 20 וגלוקוז 11.1 על ידי שילוב של 1,840 מיליליטר של deionized (DI) מים, 80 מיליליטר צילומים אני, 80 מיליליטר של המלאי השני, ו4 גרם של גלוקוז. אל ישירות לערבב צילומים אני וצילומים השני; להוסיף אתמ &#39;ל1,840 מיליליטר DI כדי למנוע משקעים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון מניות של blebbistatin uncoupler עירור-ההתכווצות ב 10 מ&quot;ג / מיליליטר בdi-methylsulfoxide נטול מים (DMSO) מראש ולאחסן את פתרון המניה ב 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרונות מניות של צבעי ניאון: (1) RH237 מתח רגיש לצבוע (1 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO) ו- (2) מחוון סידן זיקה נמוכה Fluo-5N בבוקר (2 מ&quot;ג / מיליליטר בDMSO) על פי המלצות יצרן. השתמש בהכנות מייד כדי למנוע פירוק עם האובדן הבא של קיבולת טעינה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מערכת הסירקולציה המחודשת Langendorff זלוף עם חומץ (95% O 2, 5% CO 2) הפתרון של Tyrode. התאם את הזרימה של O 2 / CO 2 כדי לשמור את ה- pH של הפתרון של Tyrode 7.4 ± 0.05. השתמש במסנן נקי ב- קו ניילון ארוג (גודל נקבובית: 11 מיקרומטר) כדי לסנן את perfusate ברציפות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראש מערכת זלוף ב RT, כloadi הבאng של Fluo-5N בבוקר מתבצע על RT. לטעינה בבוקר Fluo-5N, להשתמש במספר קטן של perfusate הסירקולציה המחודשת (~ 150 מיליליטר). לאחר טעינת צבע, להשתמש נפח גדול יותר של perfusate (1 - 2 L, ראה איור 1 ג). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל מערכת רכישת נתונים ולהתכונן לניטור רציף של לחץ א.ק.ג. וזלוף. הכן מערכת לחץ ניטור: חבר מתמר לחץ לקו זלוף ולפקח על לחץ זלוף עם מגבר transbridge. התאם את לחץ זלוף בסיס ל0 מ&quot;מ כספית כאשר הלב אינו מחובר למערכת זלוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את המצלמות אופטי מיפוי על מנת להבטיח יישור המרחבי בין מ &#39;V וCa 2 + אותות SR. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ראשית, להתמקד על ידי הצבת מצלמות שליט או אובייקט עם טקסט לתוך צלחת זלוף. הפעל מצלמות מיפוי למצב תצוגה חיה ולהתאים את המיקוד עד שהטקסט הוא חד וברור. לרכוש תמונת מסגרת אחת מכל מצלמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיסויתמונות ואלה להתאים את השקיפות של תמונה העליונה כך ששני התמונות הן נראה לעין. הטקסט בתמונות צריך לחפוף בדיוק. אם לא מיושר לגמרי, להתאים את הזווית של מראה dichroic או את המיקום של כל מצלמה עד שני התמונות מיושרות. </li></ol></li></ol> 2. קציר, זלוף, ודיי-טעינה של לב ארנב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אבטח את הארנב בעוצר ארנב אושר. עמוק להרדים באמצעות הזרקה תוך ורידית (וריד אוזן שולי) של נתרן pentobarbital (50 מ&quot;ג / קילוגרם) והפרין (1,000 IU). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר מוצג הארנב חסר של רפלקסים nociceptive, לעשות חתך בעור קו האמצע כדי לחשוף את עצם החזה וצלעות. לחתוך את עצם החזה עם מספריים כירורגיות בוטים-טיפ מxyphoid לmanubrium. יש להיזהר שלא לפגוע בלב בעת פתיחת עצם החזה. מורחים את הצלעות כדי לחשוף את הלב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מהירות בלו כל גוש לב-הריאה במהירות על ידי חיתוך כל הכלים ורקמות חיבור. Immediately למקם את בלוק לב-ריאה לפתרון של Tyrode קר כקרח. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אתר את אב העורקים לזלוף מדרדר. חותך את אב העורקים עולים רק הפרוקסימלי לשלושה הסניפים של קשת אב העורקים. Cannulate אב העורקים לצינורית 8 G המחובר למערכת זלוף. השתמש בפיסת תפר 0 משי USP כדי לאבטח את אב העורקים על הצינורית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בזהירות לנתח את קנה הנשימה, ריאות, ושומן epicardial מהלב. עם מלקחיים חדים ומספריים לנתיחה, לאתר את שסתום צניפי ובזהירות נזק או להסיר עלון אחד כדי למנוע גודש פתרון בחדר השמאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את הלב בתא זלוף-מקטורן הזכוכית אופקי עם המשטח הקדמי של הלב כלפי מעלה להדמיה. אבטח את הצינורית לפיסת Sylgard עם סיכות בצורת U על תחתית סיליקון של המנה, כדי למנוע תנועה של הלב במהלך המיפוי (1D איור). אם תרצה, להכניס סיכת חרקים קטנה בשיא של הלב לSTAbilization. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רל עמדה (ECG) אלקטרודות באמבטיה בצד הימין וצד שמאל של הלב. באופן מלא להטביע את האלקטרודות באמבטיה ולוודא שהם לא במגע עם משטח הלב לספק א.ק.ג.-נערך נפח מקביל לתצורה אני עופרת. ודא מורפולוגיה אני א.ק.ג. עופרת רגילה. התאם את הזרימה (25 - 35 מיליליטר / דקה) כדי להבטיח שלחץ אב העורקים נשמר 60 - 70 מ&quot;מ כספית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות בחדר ולהוסיף 0.3-0.6 מיליליטר של תמיסת blebbistatin מניות (שלב 1.2) לperfusate (הריכוז סופי 10 - 20 מיקרומטר). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כבה את האורות בחדר, כדי למנוע photoinactivation של blebbistatin. במידת צורך, זרקור קטן או פנס יכול לשמש כדי לספק תאורת משימה. הערה: Blebbistatin הוא מעכב ATPase שרירן וuncoupler עירור-התכווצות. בגלל טעינת Fluo-5N דורשת תנאים מורחבים (60 דקות) RT (היפותרמיה) (ראה צעדים 2.8-2.10), ייצור אנרגיית לב עלול להיות בסכנה. הerefore, תוספת של blebbistatin לperfusate לפני לצבוע טעינה עשוי להפחית את הביקוש לאנרגיה 16 ולחסל חפצי תנועה במהלך הקלטות אופטיות עוקבות 17. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התכווצות של הלב חדל (10 - 15 דקות, מאומתות על הקלטת לחץ אב העורקים), לעבור למערכת זלוף הסירקולציה המחודשת הקטן-הנפח (ראה שלב 1.4.1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן ולטעון פתרון טעינת Fluo-5N בבוקר: הוסף 0.25 מיליליטר של פתרון מניות Fluo-5N בבוקר (שלב 1.3) עד 0.25 מיליליטר 20% F127 pluronic החם. הוסף 0.5 מיליליטר הפתרון של Tyrode החם לתערובת, מערבב היטב, ולהוסיף למערכת זלוף הסירקולציה המחודשת הקטן-הנפח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפקח באופן רציף לחץ זלוף וא.ק.ג. ולהתאים את הזרימה במידת צורך. טעינת צבע לוקחת כ 1 שעה ב RT. 45 דקות לאחר הטעינה החלה, להפעיל את אמבט מים במחזור להתחיל מחממים את מערכת זלוף וperfusate עד 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 60 דקות של טעינת Fluo-5N בבוקר, swiטצ זלוף למערכת זלוף הסירקולציה המחודשת נפח הגדול יותר (ראה שלב 1.4). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל 50 μl של פתרון מניות RH237 הצבע רגיש מתח (שלב 1.3) ב 1 מיליליטר של הפתרון של Tyrode החם ולהוסיף לאט (מעל ~ 5 דקות) להפרוקסימלי נמל הזרקה לצינורית. </li></ol> 3. מיפוי אופטי <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגעים האחרונים של טעינת צבע, למקם את הלב ולמקד את המצלמות אופטי מיפוי על מנת להבטיח את השדה המתאים מבט לניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם תרצה, למקם את האלקטרודה צעדה דו קוטבית על פני השטח epicardial של הלב לצעדה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים פלסטיק או זכוכית לכסות להחליק על פני השטח של תא זלוף להפחית חפץ תנועה על פני הנוזל שיכול להיות נוכח בשל מחזור של perfusate. הערה: כחלופה ללהחליק את המכסה, להשתמש כיסוי פלסטיק נקי 50 מ&quot;מ פטרי צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתמקד מדריכי האור כדי להאיר את פני השטח של הלב עם דואר אחידxcitation אור. השתמש בדיודה כחולה פולט אור (LED) מקורות אור ועוד לסנן את האור עם 475-495 מסנן bandpass ננומטר (איור 1 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף הקרינה נפלטת עם macroscope ושתי מצלמות מיפוי משלימות תחמוצת מתכת מוליכים למחצה (CMOS) אופטיות. לפצל את האור הנפלט עם מראה dichroic ב545 ננומטר. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ארוך לעבור לסנן את מחצית אורך הגל ארוכה יותר, המכיל את האות מ &#39;V, ב 700 ננומטר. להקה עוברת לסנן את מחצית אורך גל הקצרה יותר, המכיל את אות Ca 2 + SR, 502-534 ננומטר (איור 1 א). הגדר את התדירות של רכישת נתונים אופטית ל0.5-1 קילו-הרץ. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכל הקלטה אופטית, ליזום ראשון פרוטוקול צעדה הרצוי, להדליק את אור העירור, ולאסוף 1 - 4 שניות של נתונים. אם תרצה, לסנכרן את רכישת פרוטוקולי צעדה ונתונים. הערה: לא ניתן לטעון מחדש Fluo-5N בבוקר, ולכן יחס אות לרעש (SNR) יהיה decrease לאורך הניסוי בשל לצבוע דליפה מSR. הגבל את פרוטוקול ניסוי ל1 - 2 שעות על מנת להבטיח ערכי SNR גבוהים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות הניסוי, לשטוף את מערכת זלוף ברצף של מים DI, 70% אלכוהול מגיב, ושוב עם מים די. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן כל בסיס הנתונים עם מסנן מרחבי גאוס (רדיוס 3 פיקסלים) באמצעות חבילות תוכנה זמינות באופן מסחרי על פי הפרוטוקול של היצרן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במידת צורך, מרחבית ליישר מ &#39;V וערכות נתונים SR Ca 2 +. כמו בשלב 1.6, תמונות של שכבות מכל מצלמה ולוודא שהמבנים אנטומיים של הלב (כלומר., כלי דם כליליים, קצוות של הפרוזדורים או חדרי הלב) או פריטים אחרים בשדה הראייה (כלומר, צינורית, אלקטרודה צעדה) בדיוק חפיפה. אם לא, יישור המרחבי של מערכי נתונים הכרחי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Shift תמונה השקופה העליונה בX וה- Y הכיוון עד חפיפה מדויקת מושגת, מה שהופך את ההערה של מספר פיקסליםהתמונה חייבת להיות מוזז לכל כיוון. בסיס הנתונים כולו המתאימים לתמונה העליונה (או מ &#39;V או Ca SR 2 +) חייבים אז להיות מוזז במספר שנקבע של פיקסלים לכל כיוון כדי להבטיח תיאום מדויק בין מ&#39; V וCa 2 + מערכי נתונים SR. </li></ol>

<ol>
	<li>Herron, T. J., Lee, P., Jalife, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+voltage+and+calcium+in+cardiac+cells.">Optical imaging of voltage and calcium in cardiac cells.</a> tissues. Circulation research. 110, 609-623 (2012).</li><li>Efimov, I. R., Nikolski, V. P., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+the+heart.">Optical imaging of the heart.</a> Circulation research. 95, 21-33 (2004).</li><li>Lou, Q., Li, W., Efimov, I. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multiparametric+optical+mapping+of+the+Langendorff-perfused+rabbit+heart.">Multiparametric optical mapping of the Langendorff-perfused rabbit heart.</a> Journal of visualized experiments : JoVE. , (2011).</li><li>Choi, B. R., Salama, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+maps+of+optical+action+potentials+and+calcium+transients+in+guinea-pig+hearts:+mechanisms+underlying+concordant+alternans.">Simultaneous maps of optical action potentials and calcium transients in guinea-pig hearts: mechanisms underlying concordant alternans.</a> The Journal of physiology. 529 (Pt 1), 171-188 (2000).</li><li>Kong, W., Fast, V. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+dye+affinity+in+optical+measurements+of+Cai(2+)+transients+in+cardiac+muscle.+American+journal+of+physiology.">The role of dye affinity in optical measurements of Cai(2+) transients in cardiac muscle. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 307, H73-H79 (2014).</li><li>Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Excitation-Contraction Coupling and Cardiac Contractile Force. , (2001).</li><li>Bers, D. M., Shannon, T. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+movements+inside+the+sarcoplasmic+reticulum+of+cardiac+myocytes.">Calcium movements inside the sarcoplasmic reticulum of cardiac myocytes.</a> Journal of molecular and cellular cardiology. , (2013).</li><li>Knollmann, B. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+roles+of+calsequestrin+and+triadin+in+cardiac+muscle.">New roles of calsequestrin and triadin in cardiac muscle.</a> The Journal of physiology. 587, 3081-3087 (2009).</li><li>Chen, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanism+of+calsequestrin+regulation+of+single+cardiac+ryanodine+receptor+in+normal+and+pathological+conditions.">Mechanism of calsequestrin regulation of single cardiac ryanodine receptor in normal and pathological conditions.</a> The Journal of general physiology. 142, 127-136 (2013).</li><li>Diaz, M. E., O'Neill, S. C., Eisner, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuation+is+the+key+to+cardiac+alternans.">Sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuation is the key to cardiac alternans.</a> Circulation research. 94, 650-656 (2004).</li><li>Shannon, T. R., Guo, T., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2++scraps:+local+depletions+of+free+[Ca2+]+in+cardiac+sarcoplasmic+reticulum+during+contractions+leave+substantial+Ca2++reserve.">Ca2+ scraps: local depletions of free [Ca2+] in cardiac sarcoplasmic reticulum during contractions leave substantial Ca2+ reserve.</a> Circulation research. 93, 40-45 (2003).</li><li>Kornyeyev, D., Reyes, M., Escobar, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminal+Ca(2+)+content+regulates+intracellular+Ca(2+)+release+in+subepicardial+myocytes+of+intact+beating+mouse+hearts:+effect+of+exogenous+buffers.">Luminal Ca(2+) content regulates intracellular Ca(2+) release in subepicardial myocytes of intact beating mouse hearts: effect of exogenous buffers.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. 298, H2138-H2153 (2010).</li><li>Picht, E., DeSantiago, J., Blatter, L. A., Bers, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cardiac+alternans+do+not+rely+on+diastolic+sarcoplasmic+reticulum+calcium+content+fluctuations.">Cardiac alternans do not rely on diastolic sarcoplasmic reticulum calcium content fluctuations.</a> Circulation research. 99, 740-748 (2006).</li><li>Shkryl, V. M., Maxwell, J. T., Domeier, T. L., Blatter, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Refractoriness+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++release+determines+Ca2++alternans+in+atrial+myocytes.+American+journal+of+physiology.">Refractoriness of sarcoplasmic reticulum Ca2+ release determines Ca2+ alternans in atrial myocytes. American journal of physiology.</a> Heart and circulatory physiology. 302, H2310-H2320 (2012).</li><li>Wang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+mapping+of+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++in+the+intact+heart:+ryanodine+receptor+refractoriness+during+alternans+and+fibrillation.">Optical mapping of sarcoplasmic reticulum Ca2+ in the intact heart: ryanodine receptor refractoriness during alternans and fibrillation.</a> Circulation research. 114, 1410-1421 (2014).</li><li>Wengrowski, A. M., Kuzmiak-Glancy, S., Jaimes, R., Kay, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=NADH+Changes+During+Hypoxia,+Ischemia,+and+Increased+Work+Differ+Between+Isolated+Heart+Preparations.">NADH Changes During Hypoxia, Ischemia, and Increased Work Differ Between Isolated Heart Preparations.</a> American journal of physiology. Heart and circulatory physiology. , (2013).</li><li>Fedorov, V. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+blebbistatin+as+an+excitation-contraction+uncoupler+for+electrophysiologic+study+of+rat+and+rabbit+hearts.">Application of blebbistatin as an excitation-contraction uncoupler for electrophysiologic study of rat and rabbit hearts.</a> Heart rhythm : the official journal of the Heart Rhythm Society. 4, 619-626 (2007).</li><li>Myles, R. C., Wang, L., Kang, C., Bers, D. M., Ripplinger, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Local+beta-adrenergic+stimulation+overcomes+source-sink+mismatch+to+generate+focal+arrhythmia.">Local beta-adrenergic stimulation overcomes source-sink mismatch to generate focal arrhythmia.</a> Circulation research. 110, 1454-1464 (2012).</li><li>Marks, A. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+cycling+proteins+and+heart+failure:+mechanisms+and+therapeutics.">Calcium cycling proteins and heart failure: mechanisms and therapeutics.</a> The Journal of clinical investigation. 123, 46-52 (2013).</li><li>Cutler, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+sarcoplasmic+reticulum+Ca2++ATPase+2a+gene+delivery+to+restore+electrical+stability+in+the+failing+heart.">Targeted sarcoplasmic reticulum Ca2+ ATPase 2a gene delivery to restore electrical stability in the failing heart.</a> Circulation. 126, 2095-2104 (2012).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial interests.

המפתחות לטעינת צבע Fluo-5N המוצלחת הם התקנת זלוף הסירקולציה המחודשת הקטן-נפח, המאפשרת לריכוז Fluo-5N גבוה ללא הצורך בכמויות גדולות של צבע, את משך זמן טעינה (1 שעה), ומבצעים את הטעינה ב RT. אם הטעינה מתבצעת בטמפרטורות פיסיולוגיות, פעילות האנזימטית סלולרית במהירות דבק תג -AM כאשר הצבע חוצה את קרום התא, לכידת מולקולות הצבע בcytosol ולא מאפשר להם לחצות את קרום SR. ב RT, לעומת זאת, פעילות האנזימטית מואטת וכמות מספקת של צבע יכול לחצות שני קרום התא וקרום SR לפני תג -AM הוא ביקע, ההשמנה הצבע בSR. אפילו בתנאים אופטימליים טעינה, לעומת זאת, אמפליטודות אות וקרינת שינויי השבר (ΔF / F) עם גישה זו תהיה נמוכות יותר מאשר עם מיפוי מסורתי אופטי של מטר V וCa 2 + תאיים עם צבעים גבוהה זיקה. לדוגמא, עם ההתקנה האופטית המשמשת כאן שמורכבת מאור LED העירור, מטרות מקרוסקופית, מסננים גדולים ומראה dichroic (5 סנטימטרים X 5 סנטימטרים), ומצלמות CMOS, שינויי הקרינה השבר (ΔF / F) נמצא על סדר 1 - 2% לאות Fluo-5N ו -2 - 3% לאות RH237 15. הקרינה השבר תהיה, כמובן, תלויה בתצורה הספציפית האופטית, מקור אור, ומצלמות של התקנה מסוימת, אך גם בתנאים אופטימליים אות Fluo-5N היא נמוכה באופן משמעותי ממה שנצפה בדרך כלל להקלטות של Ca 2 + תאיים עם צבעים גבוהה זיקה. לדוגמא, באותו ההתקנה, ΔF / F הוא בסדר הגודל של 20 - 30% עבור Rhod-2 כאשר אור ירוק (545 ​​ננומטר) העירור משמש 18. אור העירור הירוק הוא גם קרוב יותר לשיא העירור של RH237, כך ΔF / F של RH237 הוא גם גדול יותר במקרה זה, סביב 4 - 5%. לפיכך, למעבדות אלה שכבר מבצעים מיפוי אופטי כפול של מטר V </sUB&gt; ותאי Ca 2 +, יש לנקוט זהירות כדי לייעל את כל הרכיבים של ההתקנה האופטית כדי להבטיח ΔF המקסימאלי / F לאות Fluo-5N. עם גישה זו, חוקרים יכולים דווקא לחקור Ca 2 + דינמיקת SR והשפעתו על מ &#39;V בדרכים שאינן אפשריים עם גישות קיימות. לדוגמא, מדידות כמותיות של דליפת Ca 2 + SR (כמו באיור 3 א) וקבועת הזמן המדויק של התאוששות SR Ca 2 + (מדד -a טאו של 2 + -ATPase [SERCA] פעילות Ca SR) יכולים להתבצע. שימוש בגישות קיימות למיפוי אופטי של Ca 2 + תאיים עם צבעים גבוהה זיקה, מדידות אלה עשויים להיות &quot;מזוהמות&quot; עם הטרנסממברני שטף Ca 2 + (כלומר., תרומות מסוג L-Ca 2 + ערוצים וNa + -Ca 2 + מחליף). יתר על כן, יש לי גבוהה זיקת אינדיקטורים Ca 2 + k מטבע איטיinetics מאשר מדדים נמוך זיקה 5, ובכך אותות Fluo-5N צפויים לדווח על Ca 2 + תנועות SR מדויקות עם איכות גבוהה ובעצם אין השהיית זמן בין שינויי Ca 2 + בפועל ושינויים מקביל בקרינה. היכולת לחקור את המנגנונים מפורטים שבו שחרור SR Ca 2 + וספיגה חוזרת לתרום לתופעות arrhythmogenic היא יתרון נוסף של גישה זו. לדוגמא, השימוש במתודולוגיה זו, שדיווחנו לאחרונה איך refractoriness של שחרור SR Ca 2 + תורם להופעה של Ca 2 + alternans וכי במהלך פרפור חדרים, Ca SR 2 + השחרור נשאר כמעט ברציפות עקשן 15. זה היה הדו&quot;ח הראשון של 2 + דינמיקת Ca SR במהלך פרפור ומדגיש את היתרון העיקרי של ההדמיה Ca 2 + SR בלב שלם: תופעות מרחבית שונות ומורכבות כגון alternans וF מרחבית הצורמים<html> ibrillation ניתן ללמוד. למרבה הצער, זה סוג של מידע לא יכול להיות שלוקט מהתאים מבודדים, שבו פרפור אינו אפשרי, או משיטות שלהקליט רק ממקום אחד, בלב שלם 12. יתר על כן, מיפוי אופטי בו זמנית של מטר V וCa SR 2 + החופשי בלב שלם יכול לספק כלי חדש להערכת Ca 2 + חריג טיפול במצבים פתולוגיים, כוללים אי ספיקת לב. הליקויים בויסות Ca 2 + SR, כולל הפעלה והפסקה של Ca 2 + שחרור SR, דליפת Ca SR 2 + דיאסטולי, וספיגה 2 + Ca SR - כל השלבים העיקריים בCa 2 + רכיבה על אופניים וכל פוטנציאל לשינוי באי ספיקת לב - ניתן ללמוד באופן ישיר. בנוסף, שיטה זו יכולה גם להיות כלי שימושי להערכת ההשפעות של התערבויות טיפוליות חדשניות, כגון ייצוב 19 וSERCA אפנון RyR 20. ss = &quot;jove_content&quot;&gt; גישה זו היא לא בלי מגבלות, לעומת זאת, כולל ΔF הנמוך / F כפי שפורט לעיל וחוסר היכולת לכייל בדיוק ערכי הקרינה לגבות ריכוזי SR [Ca 2 +]. למרבה הצער, השתנות בטעינת צבע, עירור לא אחיד ופליטת אור בשל המשטח המעוגל של לב, וצילום הלבנת ודליפת צבע מSR בכל מהלך הניסוי לעשות את זה קשה מאוד לכייל אותות Fluo-5N ל מדויק SR [Ca 2 +] בלב שלם. מחקרים קודמים במבחנה בפתרונות חיץ פיסיולוגיים וmyocytes permeabilized מבודד דיווחו כיולים כזה והראו כי שינויים בקרינת Fluo-5N הם פרופורציונליים לשינויים ב[ Ca 2 +] SR והקרינה לא צפויה כדי להרוות בפיסיולוגי [Ca 2 +] רמות SR 11. לפיכך, חוקרים צריכים לבחור את השיטה של מא Ca 2 +pping (צבע נמוך או גבוהה זיקה) המבוסס על מטרותיהם הספציפיות הניסיוניות וחקירות פיסיולוגיות.

Dual optical mapping of intracellular Ca2+ and transmembrane potential (Vm) in the intact Langendorff-perfused heart has become a mainstay of investigations in cardiac electrophysiology, including mechanisms of arrhythmia and excitation-contraction coupling1-4. This approach has provided unprecedented knowledge into normal and abnormal electrophysiology and, importantly, into the bidirectional relationship between Vm and intracellular Ca2+. However, optical mapping of intracellular Ca2+ with high-affinity fluorescent indicators (such as Rhod-2 and Fluo-4) only reports on bulk changes in intracellular Ca2+ and is unable to distinguish whether these changes are due to transmembrane Ca2+ flux, release and reuptake into intracellular stores, or in most instances, some combination of both. Furthermore, high-affinity Ca2+ indicators have slow on-off kinetics and may not accurately report rapid changes in Ca2+ concentration5.
Each action potential triggers a rise in intracellular Ca2+, known as the intracellular Ca2+ transient (CaT). In the mammalian heart, approximately 70 &#8211; 90% of the total CaT is due to release of Ca2+ from the sarcoplasmic reticulum (SR) via opening of ryanodine receptors (RyRs)6. Within the SR, approximately half of the total Ca2+ is bound to calsequestrin (CSQ) and other intra-SR buffers7, which play an important role in SR Ca2+ homeostasis8,9. The amount of free SR Ca2+ dictates the driving force for SR Ca2+ release as well as gating of RyR, and therefore has a significant impact on the intracellular CaT. Furthermore, alterations in SR Ca2+ release or reuptake can, in turn, impact Vm via the electrogenic Na+-Ca2+ exchange, which may have arrhythmogenic consequences. Therefore, in addition to the CaT, monitoring of free SR Ca2+ can provide important insights into contractile and electrophysiological dysfunction.
Over the past several years, investigators have made significant advances in the monitoring of SR Ca2+ in isolated cardiac myocytes and from a single location on the intact heart. One such method requires rapid pulses of caffeine to open RyRs and the SR Ca2+ content is then inferred or calculated from the immediate rise in intracellular Ca2+10. Another intriguing approach uses low-affinity Ca2+ indicators, such as Fluo-5N11 or Mag-Fluo412, which bind to free SR Ca2+. These indicators have dissociation constants (Kd) in the range of 10 &#8211; 400 &#956;M and therefore exhibit minimal fluorescence in the cytosol compared to the SR lumen, where the Ca2+ concentration ([Ca2+]SR) is in the millimolar range. Using low-affinity Ca2+ indicators, several aspects of SR Ca2+ cycling have been investigated at the level of the isolated myocyte, including fractional SR Ca2+ release and the mechanisms of Ca2+ alternans13,14. However, in order to fully understand the heterogeneous nature of SR Ca2+ cycling in the intact heart and the role of SR Ca2+ in spatially distinct arrhythmic phenomena, methods for imaging SR Ca2+ across the epicardial surface of the intact heart are required15.
This article describes methodology for dual optical mapping of free SR Ca2+ and Vm in the intact Langendorff-perfused rabbit heart with the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+.

<table><tbody><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-1</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>C79-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>KCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>S217-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; (6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>M33-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>NaH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt; (H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S369-500</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;3&lt;/sub&gt;</td><td>Fisher Scientific</td><td>S233-3</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Fisher Scientific</td><td>D16-1</td><td>Component of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt; 5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>AirGas</td><td>carbogen</td><td>For oxygenation and pH of Tyrode&#039;s solution</td></tr><tr><td>Blebbistatin</td><td>Tocris Bioscience</td><td>1760</td><td>Excitation-contraction uncoupler</td></tr><tr><td>RH237</td><td>Biotium</td><td>61018</td><td>Voltage-sensitive dye</td></tr><tr><td>Fluo-5N AM</td><td>Invitrogen</td><td>F-26915</td><td>Low-affinity Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; indicator; Alternative: Invitrogen F-14204; Loading must be performed at room temperature</td></tr><tr><td>Pluronic F127</td><td>Biotium</td><td>59004</td><td>For Ca&lt;sup&gt;2+&lt;/sup&gt; indicator loading; Warm until the solution is clear before use</td></tr><tr><td>Dimethyl sulphoxide (DMSO)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D2650</td><td>For dissolving blebbistatin and dyes</td></tr><tr><td>Filter</td><td>EMD Millipore</td><td>NY1104700</td><td>11 &amp;#956;m in-line filter</td></tr><tr><td>Pressure Transducer</td><td>WPI</td><td>BLPR2</td><td>For measuring perfusion pressure</td></tr><tr><td>Transbridge Transducer Amplifier</td><td>WPI</td><td>SYS-TBM4M</td><td>For transducing/amplifing pressure signal; PowerLab may also be used with appropriate BioAmp</td></tr><tr><td>PowerLab 26T</td><td>ADInstruments</td><td></td><td>For continuous recording of pressure and ECG signals</td></tr><tr><td>THT Macroscope</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Macroscopic optical setup. Details: 0.63X objective (NA = 0.31), 2X condensing objective, resultant field of view = 3.1 cm x 3.1 cm, depth of focus = ~ 1.5 mm</td></tr><tr><td>MiCam Ultima-L CMOS</td><td>SciMedia</td><td></td><td>Optical mapping cameras</td></tr><tr><td>Precision LED Spot Light</td><td>Mightex</td><td>PLS-0470-030-15-S</td><td>LED light source</td></tr></tbody></table>

optical mapping of intra-sarcoplasmic reticulum ca2+ and transmembrane potential in the langendorff-perfused rabbit heart

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a significant role in certain types of arrhythmia. Because arrhythmias are spatially distinct, emergent phenomena, they must be investigated at the tissue level. However, methods for directly probing SR Ca2+ in the intact heart remain limited. This article describes the protocol for dual optical mapping of transmembrane potential (Vm) and free intra-SR [Ca2+] ([Ca2+]SR) in the Langendorff-perfused rabbit heart. This approach takes advantage of the low-affinity Ca2+ indicator Fluo-5N, which has minimal fluorescence in the cytosol where intracellular [Ca2+] ([Ca2+]i) is relatively low but exhibits significant fluorescence in the SR lumen where [Ca2+]SR is in the millimolar range. In addition to revealing SR Ca2+ characteristics spatially across the epicardial surface of the heart, this approach has the distinct advantage of simultaneous monitoring of Vm, allowing for investigations into the bidirectional relationship between Vm and SR Ca2+ and the role of SR Ca2+ in arrhythmogenic phenomena.

איור 1 א מציג תרשים סכמטי של התצורה האופטית למטר V כפול ומיפוי Ca 2 + SR. עם ההגדרה הזאת, יש הפרדה מוחלטת של רוח רפאים מ &#39;V וCa 2 + אותות SR (איור 1). תרשים של מערכת זלוף הכפולה לולאה משמשת לטעינת צבע Fluo-5N מודגם באיור 1 ג. 1D איור מראה את הכיוון האופקי של הלב בצלחת זלוף. מ &#39;V נציג וCa 2 + עקבות אופטיות SR במהלך צעדה רציפה ממקומות שונים על פני השטח epicardial של הלב מוצגים באיור 2 א. השדה האופטי של נוף עם התקנה זו הוא 31 מ&quot;מ x 31 מ&quot;מ וכיוון של הלב בתוך שדה הראייה מוצג באיור 2. מפות הפעלה גם מוצגות באיור 2 ובנויות על ידי בחירת זמן ההפעלה של כל פיקסל ועמ &#39;lotting ערך זה על מפת isochronal (שים לב לעיכוב האופייני ~ 8 - 10 אלפיות שניים בין מ &#39;V ומפות הפעלת SR Ca 2 +). חשוב לציין, פוטנציאל פעולת מפתח (AP) מאפיינים כגון זמן עליית AP (מ -10% ל -90% ממשרעת [Trise]), ומשך AP בrepolarization 80% (APD 80), אינם שונים מבחינה סטטיסטית בין הלבבות עמוסים RH237 וFluo-5N בהשוואה לאלו עמוסים RH237 וRhod-2 (Trise: 14.9 msec ± 1.9 msec לעומת 14.2 msec ± 1.2 msec וAPD 80: 155.3 אלפיות השני ± 5.8 156.9 אלפיות השני ± 5.7 msec msec לעומת לFluo-5N ו Rhod-2, בהתאמה, p&gt; 0.05 לשניהם;. N = 8 / קבוצה), המצביע על השפעה מינימאלית של Fluo-5N או לצבוע טעינה בAP איור 2C מדגים את היכולת להתבונן ולכמת שינויים יחסי בCa SR 2 + הדיאסטולי עומס ושחרור Ca SR סיסטולי 2 + אמפליטודות באורכי מחזור צעדה שונים. ניתן qu רק שינויים יחסי בפרמטרים אלהantified, כיול מוחלט (SR [Ca 2 +]) של האות בלב שלם הוא לא אפשרי. גישה זו שימושית במיוחד לאפיון וכימות טיפול Ca 2 + SR פתולוגי, כפי שמוצגים באיור 3. בעקבות יישום של isoproterenol β-adrenergic אגוניסט קולטן (100 ננומטר), Ca 2 + הדליפה הדיאסטולי ברורה מSR הוא ציין ( חיצים אדומים, איור 3 א). אם הדליפה היא גדולה מספיק, Ca 2 + תיווך פעילות מאולצת עלולה להתרחש (איור 3). <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/53166/53166fig1.jpg" /> הגדרת מערכת באיור 1. לDual מיפוי של מטר V וCa SR 2 +. () תרשים של ההתקנה האופטית, כולל מסננים הכרחיים ומראה dichroic להפרדת רפאים נכון. (ההדמיה B) של לב עמוס או Fluo-5N בלבד (i) או RH237 בלבד (ii) מצביעה על הפרדה מוחלטת של רוח רפאים של מטר V וCa 2 + אותות ניאון SR. Ex: עירור, Em:. פליטה (ג) תרשים של מערכת זלוף הכפולה לולאה לזלוף הנורמלי וטעינת צבע Fluo-5N (ד) תמונה של אלקטרודות לב וא.ק.ג. cannulated בצלחת זלוף.. לוחות A ו- B לשכפל באישור מet al וואנג. 15. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53166/53166fig1large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/53166/53166fig2.jpg" /> איור 2. מ &#39;V וCa SR 2 + עקבות אופטיות במהלך צעדה רציפה וללא רציפה. מ&#39; V נציג (א) ואופטיקה Ca 2 + SRl עוקב במהלך צעדה רציפה באורך מחזור של 300 אלפיות שניים. אותות מוצגים במיקומים הבודדים מצויינים ב( B). שים לב לעיכוב של ~ 8 - 10 אלפיות שניים בין מ &#39;V וזמני הפעלת SR Ca 2 + כאופייני לצימוד עירור-התכווצות נורמלית. (ב) תמונה של לב בתחום מיפוי מבט (ראש החץ לבן מציינת צעדה אלקטרודות) ומפות הפעלה של מטר V וCa SR 2 +. (ג) Ca 2 + עקבות אופטיות SR מדגימות שינויים בCa 2 + עומס SR הדיאסטולי ואת המשרעת של שחרור Ca 2 + SR בעקבות שינויים פתאומיים בצעדת שיעור. כל העקבות להתחיל עם צעדה בCL = 300 אלפיות שניים. צעדה שיעור לאחר מכן שינה פתאום לCL = 500 אלפיות שני (i), CL = 400 אלפיות שני (II), או CL = 250 אלפיות שני (iii). כאשר CLS כבר הם יזמו (i - ii), שחרור גדול SR Ca 2 + מתרחשת ראשונה (בשל המרווח הדיאסטולי יותר והתאוששות של RyRs) וCa SR הדיאסטולי2 + עומס מעט יורד למצב יציב חדש (קו מקווקו אופקי). כאשר CL קצר הוא יזם, לעומת זאת, משרעת קטן SR Ca 2 + שחרור מתרחש (עקב התאוששות מרווח והשלם הדיאסטולי הקצר של RyRs) ועליית עומס הדיאסטולי SR Ca 2 + ל( קו מקווקו אופקי) מצב יציב חדש . התחלפות של משרעת שחרור SR Ca 2 + מתרחשת גם בCL = 250 אלפיות שני. S: משרעת שחרור קטן, L: משרעת שחרור גדול. (CL: אורך מחזור) <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53166/53166fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/53166/53166fig3.jpg" /> איור 3. Ca 2 + SR הדיאסטולי דליפה ופעילות שהופעלה לאחר. () א.ק.ג., מ &#39;V, וCa SR 2 + העקבות בתחילת מחקר (משמאל) והבאטיפול עם 100 isoproterenol ננומטר (ISO, מימין). עם ISO, דליפת 2 + Ca SR הדיאסטולי המשמעותי הוא ציין (חצים אדומים). אמפליטודות אות Ca 2 + SR כבר מנורמל לפני ואחרי Iso. צומת סין-פרוזדורים הייתה ablated כדי לאפשר לצעדת CL = 300 אלפיות שניים בשני המקרים. (ב) אם דליפת Ca 2 + SR היא גדולה מספיק, זה עשוי לעורר פעילות מוקד (מתחמי חדרית מוקדמים, PVCs). בדוגמא זו, PVCs הם קוטעים את קצב סינוס הרגיל. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/53166/53166fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart at JoVE.com

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

מאמר זה מתאר את הפרוטוקול מפורט וציוד הכרחי למיפוי כפול אופטי של (מ &#39;V) פוטנציאל הטרנסממברני וחופשי רשתית תוך-sarcoplasmic (SR) Ca 2 + בלב ארנב Langendorff-perfused. שיטה זו מאפשרת לתצפית ישירה וכימות של מטר V ו2+ דינמיקת Ca SR בלב שלם.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca<sup&gt; 2 +</sup&gt; ופוטנציאל הטרנסממברני בלב ארנב Langendorff-perfused

Sarcoplasmic reticulum (SR) Ca2+ handling plays a key role in normal excitation-contraction coupling and aberrant SR Ca2+ handling is known to play a ...

optical-mapping-intra-sarcoplasmic-reticulum-ca2-transmembrane

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

9.2K Views.  University of California Davis.  מאמר זה מתאר את הפרוטוקול מפורט וציוד הכרחי למיפוי כפול אופטי של (מ 'V) פוטנציאל הטרנסממברני וחופשי רשתית תוך-sarcoplasmic (SR) Ca 2 + בלב ארנב Langendorff-perfused. שיטה זו מאפשרת לתצפית ישירה וכימות של מטר V ו2+ דינמיקת Ca SR בלב שלם. 

Video: Optical Mapping of Intra-Sarcoplasmic Reticulum Ca2+ and Transmembrane Potential in the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Multiparametric Optical Mapping of the Langendorff-perfused Rabbit Heart

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not have been accomplished by other approaches1. With the use of the calcium- and voltage-sensitive dyes, optical mapping allows measurement of transmembrane action potentials and calcium transients with high spatial resolution without the physical contact with the tissue. This makes measurements of the cardiac electrical activity possible under many conditions where the use of electrodes is inconvenient or impossible1. For example, optical recordings provide accurate morphological changes of membrane potential during and immediately after stimulation and defibrillation, while conventional electrode techniques suffer from stimulus-induced artifacts during and after stimuli due to electrode polarization1. 
The Langendorff-perfused rabbit heart is one of the most studied models of human heart physiology and pathophysiology. Many types of arrhythmias observed clinically could be recapitulated in the rabbit heart model. It was shown that wave patterns in the rabbit heart during ventricular arrhythmias, determined by effective size of the heart and the wavelength of reentry, are very similar to that in the human heart2. It was also shown that critical aspects of excitation-contraction (EC) coupling in rabbit myocardium, such as the relative contribution of sarcoplasmic reticulum (SR), is very similar to human EC coupling3. Here we present the basic procedures of optical mapping experiments in Langendorff-perfused rabbit hearts, including the Langendorff perfusion system setup, the optical mapping systems setup, the isolation and cannulation of the heart, perfusion and dye-staining of the heart, excitation-contraction uncoupling, and collection of optical signals. These methods could be also applied to the heart from species other than rabbit with adjustments to flow rates, optics, solutions, etc.
Two optical mapping systems are described. The panoramic mapping system is used to map the entire epicardium of the rabbit heart4-7. This system provides a global view of the evolution of reentrant circuits during arrhythmogenesis and defibrillation, and has been used to study the mechanisms of arrhythmias and antiarrhythmia therapy8,9. The dual mapping system is used to map the action potential (AP) and calcium transient (CaT) simultaneously from the same field of view10-13. This approach has enhanced our understanding of the important role of calcium in the electrical alternans and the induction of arrhythmia14-16.

This article describes the basic procedures for conducting optical mapping experiments in the Langendorff-perfused rabbit heart using the panoramic imaging system, and the dual (voltage and calcium) imaging modality.

Multiparametric מיפוי אופטי של הלב Langendorff-perfused הארנב

Optical imaging and fluorescent probes have significantly advanced research methodology in the field of cardiac electrophysiology in ways that could not ...

Bioengineering

Optical Mapping of Action Potentials and Calcium Transients in the Mouse Heart

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. Cardiovascular physiological phenotyping of the mouse heart can be easily done using fluorescence imaging employing various probes for transmembrane potential (Vm), calcium transients (CaT), and other parameters. Excitation-contraction coupling is characterized by action potential and intracellular calcium dynamics; therefore, it is critically important to map both Vm and CaT simultaneously from the same location on the heart1-4. Simultaneous optical mapping from Langendorff perfused mouse hearts has the potential to elucidate mechanisms underlying heart failure, arrhythmias, metabolic disease, and other heart diseases. Visualization of activation, conduction velocity, action potential duration, and other parameters at a myriad of sites cannot be achieved from cellular level investigation but is well solved by optical mapping1,5,6. In this paper we present the instrumentation setup and experimental conditions for simultaneous optical mapping of Vm and CaT in mouse hearts with high spatio-temporal resolution using state-of-the-art CMOS imaging technology. Consistent optical recordings obtained with this method illustrate that simultaneous optical mapping of Langendorff perfused mouse hearts is both feasible and reliable.

This paper details the dissection procedure, instrumental setup, and experimental conditions during optical mapping of transmembrane potential (Vm) and intracellular calcium transient (CaT) in intact isolated Langendorff perfused mouse hearts.

מיפוי אופטי של פוטנציאלים פעולה ו הארעית סידן בלב מאוס

The mouse heart is a popular model for cardiovascular studies due to the existence of low cost technology for genetic engineering in this species. ...

High-Resolution Endocardial and Epicardial Optical Mapping in a Sheep Model of Stretch-Induced Atrial Fibrillation

Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance seen in clinical practice and its prevalence is expected to increase in the coming years.3 Increased intra-atrial pressure and dilatation have been long recognized to lead to AF,1,4 which highlights the relevance of using animal models and stretch to study AF dynamics. Understanding the mechanisms underlying AF requires visualization of the cardiac electrical waves with high spatial and temporal resolution. While high-temporal resolution can be achieved by conventional electrical mapping traditionally used in human electrophysiological studies, the small number of intra-atrial electrodes that can be used simultaneously limits the spatial resolution and precludes any detailed tracking of the electrical waves during the arrhythmia. The introduction of optical mapping in the early 90's enabled wide-field characterization of fibrillatory activity together with sub-millimeter spatial resolution in animal models5,6 and led to the identification of rapidly spinning electrical wave patterns (rotors) as the sources of the fibrillatory activity that may occur in the ventricles or the atria.7-9 Using combined time- and frequency-domain analyses of optical mapping it is possible to demonstrate discrete sites of high frequency periodic activity during AF, along with frequency gradients between left and right atrium. The region with fastest rotors activates at the highest frequency and drives the overall arrhythmia.10,11 The waves emanating from such rotor interact with either functional or anatomic obstacles in their path, resulting in the phenomenon of fibrillatory conduction.12 Mapping the endocardial surface of the posterior left atrium (PLA) allows the tracking of AF wave dynamics in the region with the highest rotor frequency. Importantly, the PLA is the region where intracavitary catheter-based ablative procedures are most successful terminating AF in patients,13 which underscores the relevance of studying AF dynamics from the interior of the left atrium. Here we describe a sheep model of acute stretch-induced AF, which resembles some of the characteristics of human paroxysmal AF. Epicardial mapping on the left atrium is complemented with endocardial mapping of the PLA using a dual-channel rigid borescope c-mounted to a CCD camera, which represents the most direct approach to visualize the patterns of activation in the most relevant region for AF maintenance.

This report provides a detailed description of the methodology and results of simultaneous endocardial and epicardial optical mapping of electrical excitation in the intact left atrium of a Langendorff-perfused sheep heart during stretch-induced atrial fibrillation.

ברזולוציה גבוהה מיפוי אופטי Endocardial ו Epicardial במודל הכבשים של פרפור פרוזדורי למתוח-induced

 Atrial fibrillation (AF) is a complex cardiac arrhythmia with high morbidity and mortality.1,2 It is the most common sustained cardiac rhythm disturbance ...

Medicine

Optical Mapping of Langendorff-perfused Rat Hearts

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in experimental models that range in scale from cell cultures to whole-organs[1, 2]. Using state-of-the-art optical imaging systems, generation and propagation of action potentials during normal cardiac rhythm or throughout initiation and maintenance of arrhythmias can be visualized almost instantly[1]. The latest commercially-available systems can provide information at exceedingly high spatiotemporal resolutions and were based on custom-built equipment initially developed to overcome the obstacles imposed by more conventional electrophysiological methods[1]. Advancements in high-resolution and high-speed complementary metal-oxide-semiconductor (CMOS) cameras and intensely-bright, light-emitting diodes (LEDs) as well as voltage-sensitive dyes, optics, and filters have begun to make electrical signal acquisition practical for cardiovascular cell biologists who are more accustomed to working with microscopes. Although the newest generation of CMOS cameras can acquire 10,000 frames per second on a 16,384 pixel array, depending on the type of sample preparation, long-established fluorescence acquisition technologies such as photodiode arrays, laser scanning systems, and cooled charged-coupled device (CCD) cameras still have some distinct advantages with respect to dynamic range, signal-to-noise ratio, and quantum efficiency[1, 3]. In the present study, Lewis rat hearts were perfused ex vivo with a crystalloid perfusate (Krebs-Henseleit solution) at 37&deg;C on a modified Langendorff apparatus. After a 20 minute stabilization period, the hearts were intermittently perfused with 11 mMol/L 2,3-butanedione monoxime to eliminate contraction-associated motion during image acquisition. For optical mapping, we loaded hearts with the fast-response potentiometric probe di-8-ANEPPS[4] (5 &mu;Mol/L) and briefly illuminated the preparation with 475&plusmn;15 nm excitation light. During a typical 2 second period of illumination, &gt;605 nm light emitted from the cardiac preparation was imaged with a high-speed CMOS camera connected to a horizontal macroscope. For this demonstration, hearts were paced at 300 beats per minute with a coaxial electrode connected to an isolated electrical stimulation unit. Simultaneous bipolar electrographic recordings were acquired and analyzed along with the voltage signals using readily-available software. In this manner, action potentials on the surface of Langendorff-perfused rat hearts can be visualized and registered with electrographic signals.

This article describes a high temporal and spatial resolution technique to optically image action potential movement on the surface of Langendorff-perfused rat hearts using a potentiometric dye (di-8-ANEPPS).

מיפוי אופטי של Langendorff-perfused לבבות עכברוש

Optical mapping of the cardiac surface with voltage-sensitive fluorescent dyes has become an important tool to investigate electrical excitation in ...

Optical Imaging of Isolated Murine Ventricular Myocytes

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances in calcium sensitive dyes have permitted the robust optical recording of single cell calcium dynamics, recording of robust transmembrane optical voltage signals has remained difficult. Arguably, this is because of the low single to noise ratio, phototoxicity, and photobleaching of traditional potentiometric dyes. Therefore, single cell voltage measurements have long been confined to the patch clamp technique which while the gold standard, is technically demanding and low throughput. However, with the development of novel potentiometric dyes, large, fast optical responses to changes in voltage can be obtained with little to no phototoxicity and photobleaching. This protocol describes in detail how to isolate adult murine myocytes which can be used for cellular shortening, calcium, and optical voltage measurements. Specifically, the protocol describes how to use a ratiometric calcium dye, a single-excitation calcium dye, and a single excitation voltage dye. This approach can be used to assess the cardiotoxicity and arrhythmogenicity of various chemical agents. While phototoxicity is still an issue at the single cell level, methodology is discussed on how to reduce it.

We present the methodology for the isolation of murine myocytes and how to obtain voltage or calcium traces simultaneously with sarcomere shortening traces using fluorescence photometry with simultaneous digital cell geometry measurements.

הדמיה אופטית של מודציטים מבודדים המוח החדרית

The ability to isolate adult cardiac myocytes has permitted researchers to study a variety of cardiac pathologies at the single cell level. While advances ...

Preclinical Cardiac Electrophysiology Assessment by Dual Voltage and Calcium Optical Mapping of Human Organotypic Cardiac Slices

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between animal and clinical trials. Numerous animal and cell models have been used to examine the effects of drugs, yet these responses often differ in humans. Human cardiac slices offer an advantage for drug testing in that they are directly derived from viable human hearts. In addition to having preserved multicellular structures, cell-cell coupling, and extracellular matrix environments, human cardiac tissue slices can be used to directly test the effect of innumerable drugs on adult human cardiac physiology. What distinguishes this model from other heart preparations, such as whole hearts or wedges, is that slices can be subjected to longer-term culture. As such, cardiac slices allow for studying the acute as well as chronic effects of drugs. Furthermore, the ability to collect several hundred to a thousand slices from a single heart makes this a high-throughput model to test several drugs at varying concentrations and combinations with other drugs at the same time. Slices can be prepared from any given region of the heart. In this protocol, we describe the preparation of left ventricular slices by isolating tissue cubes from the left ventricular free wall and sectioning them into slices using a high precision vibrating microtome. These slices can then either be subjected to acute experiments to measure baseline cardiac electrophysiological function or cultured for chronic drug studies. This protocol also describes dual optical mapping of cardiac slices for simultaneous recordings of transmembrane potentials and intracellular calcium dynamics to determine the effects of the drugs being investigated.

This protocol describes the procedure for sectioning and culturing human cardiac slices for preclinical drug testing and details the use of optical mapping for recording transmembrane voltage and intracellular calcium signals simultaneously from these slices.

מיפוי אופטי של הערכת החשמל לניתוחי לב באמצעות מתח כפול וסידן

Human cardiac slice preparations have recently been developed as a platform for human physiology studies and therapy testing to bridge the gap between ...

Electrophysiological Assessment of Murine Atria with High-Resolution Optical Mapping

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and electrophysiological phenotype in the atria. That encourages us to utilize a genetically-engineered mouse model to elucidate the mechanism of AF. However, it is difficult to evaluate the electrophysiological properties in murine atria due to their small size. This protocol describes the electrophysiological evaluation of atria using an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution in Langendorff perfused murine hearts. The optical mapping system is assembled with dual high-speed complementary metal oxide semiconductor cameras and high magnification objective lenses, to detect the fluorescence of a voltage-sensitive dye and Ca2+ indicator. To focus on the assessment of murine atria, optical mapping is performed with an area of 2 mm &#215; 2 mm or 10 mm x 10 mm, with a 100 &#215; 100 resolution (20 &#181;m/pixel or 100 &#181;m/pixel) and sampling rate of up to 10 kHz (0.1 ms) at maximum. A 1-French size quadripolar electrode pacing catheter is placed into the right atrium through the superior vena cava avoiding any mechanical damage to the atrium, and pacing stimulation is delivered through the catheter. An electrophysiological study is performed with programmed stimulation including constant pacing, burst pacing, and up to triple extrastimuli pacing. Under a spontaneous or pacing rhythm, the optical mapping recorded the action potential duration, activation map, conduction velocity, and Ca2+ transient individually in the right and left atria. In addition, the programmed stimulation also determines the inducibility of atrial tachyarrhythmias. Precise activation mapping is performed to identify the propagation of the excitation in the atrium during an induced atrial tachyarrhythmia. Optical mapping with a specialized setting enables a thorough electrophysiological evaluation of the atrium in murine pathological models.

This protocol describes the electrophysiological evaluation of murine atria utilizing an optical mapping system with a high temporal and spatial resolution, including dual recordings of the membrane voltage and Ca2+ transient under programmed stimulation through a specialized electrode catheter.

אלקטרופיזיולוגיות להערכת אטריה מאתר עם מיפוי אופטי ברזולוציה גבוהה

Recent genome-wide association studies targeting atrial fibrillation (AF) have indicated a strong association between the genotype and ...

Optocardiography and Electrophysiology Studies of Ex Vivo Langendorff-perfused Hearts

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to larger animals. Yet, larger mammals are better suited for translational research questions related to normal cardiac physiology, pathophysiology, and preclinical testing of therapeutic agents. To overcome the technical barriers associated with employing a larger animal model in cardiac research, we describe an approach to measure physiological parameters in an isolated, Langendorff-perfused piglet heart. This approach combines two powerful experimental tools to evaluate the state of the heart: electrophysiology (EP) study and simultaneous optical mapping of transmembrane voltage and intracellular calcium using parameter sensitive dyes (RH237, Rhod2-AM). The described methodologies are well suited for translational studies investigating the cardiac conduction system, alterations in action potential morphology, calcium handling, excitation-contraction coupling and the incidence of cardiac alternans or arrhythmias.

The objective of this study was to establish a method for investigating cardiac dynamics using a translational animal model. The described experimental approach incorporates dual-emission optocardiography in conjunction with an electrophysiological study to assess electrical activity in an isolated, intact porcine heart model.

אופקרדיוגרפיה ולימודי אלקטרופיזיולוגיה של לשעבר Vivo נגדורף

Small animal models are most commonly used in cardiovascular research due to the availability of genetically modified species and lower cost compared to ...

Voltage and Calcium Dual Channel Optical Mapping of Cultured HL-1 Atrial Myocyte Monolayer

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte monolayers. HL-1 cells have been widely used as a 2-Dimensional cellular model for studying diverse aspects of cardiac physiology. However, it has been a great challenge to optically map calcium (Ca) transients and action potentials simultaneously from the same field of view in a cultured HL-1 atrial cell monolayer. This is because special handling and care is required to prepare healthy cells that can be electrically captured and optically mapped. Therefore, we have developed an optimal working protocol for dual channel optical mapping. In this manuscript, we have described in detail how to perform the dual channel optical mapping experiment. This protocol is a useful tool to enhance the understanding of action potential propagation and Ca kinetics in arrhythmia development.

This article describes the technique used to perform dual channel optical mapping in cultured HL-1 atrial cell monolayers. This unique protocol allows the simultaneous visualization of both calcium (Ca) and voltage (Vm) activity in the same area for the detailed detection and analysis of electrophysiological properties of culture monolayers.

מתח וסידן ערוץ כפול אופטי מיפוי של תרבית HL-1 פרוזדורים Myocyte חד שכבתי

Optical mapping has proven to be a valuable technique to detect cardiac electrical activity on both intact ex vivo hearts and in cultured myocyte ...

Local Field Fluorescence Microscopy: Imaging Cellular Signals in Intact Hearts

In the heart, molecular signaling studies are usually performed in isolated myocytes. However, many pathological situations such as ischemia and arrhythmias can only be fully understood at the whole organ level. Here, we present the spectroscopic technique of local field fluorescence microscopy (LFFM) that allows the measurement of cellular signals in the intact heart. The technique is based on a combination of a Langendorff perfused heart and optical fibers to record fluorescent signals. LFFM has various applications in the field of cardiovascular physiology to study the heart under normal and pathological conditions. Multiple cardiac variables can be monitored using different fluorescent indicators. These include cytosolic [Ca2+], intra-sarcoplasmic reticulum [Ca2+] and membrane potentials. The exogenous fluorescent probes are excited and the emitted fluorescence detected with three different arrangements of LFFM epifluorescence techniques presented in this paper. The central differences among these techniques are the type of light source used for excitation and on the way the excitation light is modulated. The pulsed LFFM (PLFFM) uses laser light pulses while continuous wave LFFM (CLFFM) uses continuous laser light for excitation. Finally, light-emitting diodes (LEDs) were used as a third light source. This non-coherent arrangement is called pulsed LED fluorescence microscopy (PLEDFM).

In the heart, molecular events coordinate the electrical and contractile function of the organ. A set of local field fluorescence microscopy techniques presented here enables the recording of cellular variables in intact hearts. Identifying mechanisms defining the cardiac function is critical in understanding how the heart works under pathological situations.

מיפוי אופטי של Intra-sarcoplasmic reticulum Ca

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video