The authors thank Colleen Van Kirk for mouse retina and cerebellum samples, and Peter Gregory for figure generation. The authors also thank Dr. Allison Gillaspy and the Laboratory for Molecular Biology and Cytometry Research core for access to the MiSeq. This work was supported by NIH grants DA029405, EY021716, and AG026607 and the Donald W. Reynolds Foundation.

<ol>
	<li>Hotchkiss, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+quantitative+separation+of+purines,+pyrimidines,+and+nucleosides+by+paper+chromatography.">The quantitative separation of purines, pyrimidines, and nucleosides by paper chromatography.</a> The Journal of Biological Chemistry. 175 (1), 315-332 (1948).</li><li>Bird, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+patterns+and+epigenetic+memory.">DNA methylation patterns and epigenetic memory.</a> Genes &amp; Development. 16 (1), 6-21 (2002).</li><li>Smith, Z. D., Meissner, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation:+roles+in+mammalian+development.">DNA methylation: roles in mammalian development.</a> Nature reviews. Genetics. 14 (3), 204-220 (2013).</li><li>Heard, E., Martienssen, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenerational+epigenetic+inheritance:+myths+and+mechanisms.">Transgenerational epigenetic inheritance: myths and mechanisms.</a> Cell. 157 (1), 95-109 (2014).</li><li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA+methylation+and+gene+silencing+in+cancer.">DNA methylation and gene silencing in cancer.</a> Nature Clinical Practice. Oncology. 2, S4-S11 (2005).</li><li>Baylin, S. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+cancer+epigenome:+its+origins,+contributions+to+tumorigenesis,+and+translational+implications.">The cancer epigenome: its origins, contributions to tumorigenesis, and translational implications.</a> Proceedings of the American Thoracic Society. 9 (2), 64-65 (2012).</li><li>Beck, S., Rakyan, V. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+methylome:+approaches+for+global+DNA+methylation+profiling.">The methylome: approaches for global DNA methylation profiling.</a> Trends in Genetics : TIG. 24 (5), 231-237 (2008).</li><li>Laird, P. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Principles+and+challenges+of+genomewide+DNA+methylation+analysis.">Principles and challenges of genomewide DNA methylation analysis.</a> Nature reviews. Genetics. 11 (3), 191-203 (2010).</li><li>Mikeska, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+quantitative+MGMT+promoter+methylation+analysis+using+pyrosequencing+and+combined+bisulfite+restriction+analysis.">Optimization of quantitative MGMT promoter methylation analysis using pyrosequencing and combined bisulfite restriction analysis.</a> The Journal of Molecular Diagnostics : JMD. 9 (3), 368-381 (2007).</li><li>Kreutz, M., Hochstein, N., Kaiser, J., Narz, F., Peist, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pyrosequencing:+powerful+and+quantitative+sequencing+technology.+Current+Protocols+In.">Pyrosequencing: powerful and quantitative sequencing technology. Current Protocols In.</a> Molecular Biology / edited by Frederick M. Ausubel ... [et al.]. 104 (Unit 7 15), (2013).</li><li>Dikow, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+the+methylation+status+of+the+PWS/AS+imprinted+region:+comparison+of+two+approaches+based+on+bisulfite+sequencing+and+methylation-sensitive+MLPA.">Quantification of the methylation status of the PWS/AS imprinted region: comparison of two approaches based on bisulfite sequencing and methylation-sensitive MLPA.</a> Molecular And Cellular Probes. 21 (3), 208-215 (2007).</li><li>Parrish, R. R., Day, J. J., Lubin, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+bisulfite+sequencing+for+examination+of+DNA+methylation+with+gene+and+nucleotide+resolution+from+brain+tissues.">Direct bisulfite sequencing for examination of DNA methylation with gene and nucleotide resolution from brain tissues.</a> Current Protocols In Neuroscience / editorial board, Jacqueline N. Crawley ... [et al.]. 7 (Unit 7 24), (2012).</li><li>Shapiro, R., Servis, R. E., Welcher, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactions+of+uracil+and+cytosine+derivatives+with+sodium+bisulfite.+A+specific+deamination+method.">Reactions of uracil and cytosine derivatives with sodium bisulfite. A specific deamination method.</a> Journal of the American Chemical Society. 92, 422-424 (1970).</li><li>Hayatsu, H., Wataya, Y., Kazushige, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+addition+of+sodium+bisulfite+to+uracil+and+to+cytosine.">The addition of sodium bisulfite to uracil and to cytosine.</a> Journal of the American Chemical Society. 92 (3), 724-726 (1970).</li><li>Wang, R. Y., Gehrke, C. W., Ehrlich, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+bisulfite+modification+of+5-methyldeoxycytidine+and+deoxycytidine+residues.">Comparison of bisulfite modification of 5-methyldeoxycytidine and deoxycytidine residues.</a> Nucleic Acids Research. 8 (20), 4777-4790 (1980).</li><li>Masser, D. R., Berg, A. S., Focused Freeman, W. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=high+accuracy+5-methylcytosine+quantitation+with+base+resolution+by+benchtop+next-generation+sequencing.">high accuracy 5-methylcytosine quantitation with base resolution by benchtop next-generation sequencing.</a> Epigenetics &amp; Chromatin. 6 (1), 33 (2013).</li><li>Caruccio, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+next-generation+sequencing+libraries+using+Nextera+technology:+simultaneous+DNA+fragmentation+and+adaptor+tagging+by+in+vitro+transposition.">Preparation of next-generation sequencing libraries using Nextera technology: simultaneous DNA fragmentation and adaptor tagging by in vitro transposition.</a> Methods in Molecular Biology. 733, 241-255 (2011).</li><li>Quail, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+tale+of+three+next+generation+sequencing+platforms:+comparison+of+Ion+Torrent,+Pacific+Biosciences+and+Illumina+MiSeq+sequencers.">A tale of three next generation sequencing platforms: comparison of Ion Torrent, Pacific Biosciences and Illumina MiSeq sequencers.</a> BMC Genomics. 13, 341 (2012).</li><li>Adey, A., Shendure, J. U. l. t. r. a. -. l. o. w. -. i. n. p. u. t. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=tagmentation-based+whole-genome+bisulfite+sequencing.">tagmentation-based whole-genome bisulfite sequencing.</a> Genome Research. 22 (6), 1139-1143 (2012).</li><li>Smallwood, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-cell+genome-wide+bisulfite+sequencing+for+assessing+epigenetic+heterogeneity.">Single-cell genome-wide bisulfite sequencing for assessing epigenetic heterogeneity.</a> Nature Methods. 11 (8), 817-820 (2014).</li><li>Wang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Universal+endogenous+gene+controls+for+bisulphite+conversion+in+analysis+of+plant+DNA+methylation.">Universal endogenous gene controls for bisulphite conversion in analysis of plant DNA methylation.</a> Plant Methods. 7, 39 (2011).</li><li>Lister, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences.">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462 (7271), 315-322 (2009).</li><li>Ivanov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In-solution+hybrid+capture+of+bisulfite-converted+DNA+for+targeted+bisulfite+sequencing+of+174+ADME+genes.">In-solution hybrid capture of bisulfite-converted DNA for targeted bisulfite sequencing of 174 ADME genes.</a> Nucleic Acids Research. 41 (6), e72 (2013).</li><li>Booth, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oxidative+bisulfite+sequencing+of+5-methylcytosine+and+5-hydroxymethylcytosine.">Oxidative bisulfite sequencing of 5-methylcytosine and 5-hydroxymethylcytosine.</a> Nature Protocols. 8 (10), 1841-1851 (2013).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

BSAS מאפשר להתמקד quantitation, מתילציה DNA מדויק עם יכולות תפוקה גבוהות בשני מספר הדגימות ומספר המטרות. בנוסף, דור ספרייה זו באמצעות tagmentation תיווך transposome דורש DNA קלט פחות, הוא מהיר יותר ומכיל פחות שלבים מאשר גז מסורתי וטכניקות קשירת מתאם שלאחר מכן. שיפורים אלה על פני שיטות קיימות מאפשרים ניתוח מתילציה DNA מדויק ברמת בסיס של כל מטרה של עניין. יתר על כן, BSAS מספק שיטה חדשה לאישור של אזורים של עניין (אזורי מתילציה באופן דיפרנציאלי (DMRS), איי CPG, אזורי רגולטורים) שזוהו באמצעות הגנום כולו 22 או 23 ללכוד גישות bisulfite. תוך שימוש בגישות המאונכות אישור ויותר כמותית שיטות מדויקות משפרת את הקשיחות אנליטי של מחקרי epigenomic. עומק הקריאה הגבוה שהושג עם BSAS מאפשר quantitation מדויק במרווח ביטחון צר, מחדשsulting בquantitation המדויק 16. בנוסף, את היכולת להפעיל דגימות רבות בניסוי אחד יכולה להגדיל את גודל המדגם לאישורים של שיטות הגנום כולו, אשר יגדילו את הכח הסטטיסטי; חולשה של מחקרים רבים אפיגנטיים הנוכחיים. חשוב לציין, BSAS מספק quantitation מתילציה CPG בסיס ספציפי, המאפשר לדור של השערות הניתנות לבדיקה למחקר אפיגנטיים. השערות כגון מתילציה עלתה באלמנט תגובה ספציפי תוביל לירידה בכריכה של גורם שעתוק ספציפי. BSAS, בשילוב עם נתונים ביטוי mRNA לזווג, מספק שיטה להשגת שתי רגולציה אפיגנטיים וביטוי mRNA בתוך פיסת רקמה או אוכלוסיית תא בודדת. מדידות מותאמים של רגולציה וביטוי גם להגדיל את הקשיחות ואת ההשפעה של הממצאים המדעיים. צעדים קריטיים בפרוטוקול BSAS כוללים עיצוב פריימר, amplicon אופטימיזציה, ודור ספרייה /QC. ההטיה PCR הוא הציג אם פריימרים אינם מתוכננים כראוי ולהגביר את יעילות בשונה 8. שימוש בסטנדרטים מתילציה, כגון תקני ציטוזין 100% ו 0% שנוצרו אנזימים מפוגלים, ניתן להשתמש כדי לקבוע את המידה, אם בכלל, של ההטיה quantitation מתילציה, ושליטה מתודולוגיים נכונה כאשר כימותי מתילציה 16. בדומה לכך, יש לנקוט בזהירות בעת ביצוע אופטימיזציה לתגובות PCR ליצירת amplicon באיכות גבוהה יחיד. אם לא amplicon נוכחת באמצעות ההנחיות הציעו מפורטות בפרוטוקול, צעדי אופטימיזציה כוללים מספר גדל והולך PCR מחזור או סכום קלט bsDNA. אם יש מוצרי PCR מרובים, כוללים פריימר-הדימרים, צעדי אופטימיזציה כוללים הפחתת כמות קלט bsDNA, הפחתת ריכוזי קלט הטוחנות פריימר PCR, עלייה בטמפרטורות חישול, או להקטין את מספר מחזור PCR. אחד או שילוב של נהלי אופטימיזציה אלה מניב תוצאות מספקות כדי ליצור HIG אחתamplicon h-איכות. לחלופין, עיצוב מחדש של פריימרים הוא גישה טובה לקבוצות פריימר שלא להניב amplicon יחידה. לאלו אזורים שבם העיצוב מחדש אינו מתאים או אפשרי, מנוון סטי פריימר כולל שניהם עלול של ציטוזין והטימין של באתרי CPG בפריימרים קדימה ואדנין של וגואנין של באתרי CPG בפריימרים הפוכים לעבוד. עם זאת, ערכות פריימר אלה צריכים אופטימיזציה נוספת כדי להבטיח שאין PCR הטיה מתרחשת, תהליך מחוץ להיקף של פרוטוקול זה. ספריות איכות הן חשובות ביותר להצלחה. ודא שאמצעי QC מתבצעים כדי לקבוע את הגודל, איכות וכמות של ספריות לפני הרצף. תגובות רצף נוטות לכישלון עם קלט של ספריות באיכות נמוכה. הטיה בquantitation מתילציה ניתן למתן על ידי הבטחה כי תדרי מתילציה נמצאים בשני קדימה לאחור רצף קורא. בנוסף, ציוני איכות של בסיסי יישור לאתרי CPG צריכים להיות ≥Q30 גבוה שיתוףnfidence בquantitation. בעוד שאחרים הראו מעט קודם לכן לשום הטיה בתגובות tagmentation של DNA המרה bisulfite 19, להבטיח את המדדים שתוארו לעיל מאפשר לאישור quantitation מתילציה ההטיה הנמוך. BSAS מודד כיום מתילציה באתרי CPG, לעומת זאת, הרחבות עתידיות של שיטה זו תאפשר מדידות מזווגות של CPG 5-HMC עם התוספת של צעדים ניסיוניים הבחנה בין 5-MC ו-5- HMC כגון החדרת perruthenate אשלגן לפני המרת bisulfite 24. זה יגביר את ההשפעה של שירות BSAS כך שהוא מאפשר למתילציה לזווג, שני 5-MC ו-5- HMC, ונתונים ביטוי על מנת לקבוע תפקידי רגולציה של ביטוי גני מתילציה DNA. הכנת ספריית תיווך Transposome של amplicons PCR אין לגרום לעומק רצף ירידה בקצוות של אזורים מוגברים. לכן, אזורים של ריבית גבוהה צריכים להיות מתוכננים לישיבה באמצע amplicons. איךאי פעם, כי BSAS יוצר רצף לקרוא מעמקי&gt; 1000 X, דיוק כמותי של 5-MC מדידות ליד הקצוות של אזורים מוגברים נותרים גבוהות.

זה כבר יותר ממחצית המאה מאז הדו&quot;ח הראשון של מתרחש באופן טבעי שינויי DNA בצורה של מתילציה ציטוזין 1. מתילציה ציטוזין היא בסיס נוקלאוטיד ציטוזין שונה בי פחמן 5 th על טבעת הבסיס יש קבוצה מתיל (5-MC), שכיחה ביותר במוטיב dinucleotide CPG בגנומים של יונקים. הנוכחות הפונקציונלית של 5-MC ביזמי גן מזוהית בדרך כלל עם דיכוי תעתיק, ואילו ההעדר קשור פעילות תעתיק 2. התקדמות עצומה נעשתה בהבנה של תפקיד המתילציה של הדנ&quot;א בפיתוח 3, התפשטות transgeneration פרופילים אפיגנטיים 4, פתוגנזה סרטן 5,6, ומספר תחומי מחקר האחרים שלנו. רבים מפיתוחים אלו הגיעו בשנים האחרונות כמתודולוגיות חדשות פותחו לפרופיל מתילציה DNA 7. עם כניסתו ופופולריזציה של טכניקות של הדור הבא רצף (NGS) יש כיום מספר השיטות לפרופיל מתילציה DNA על פני הגנום כולו או אזורים גדולים של הגנום 8. גישות אלו פותחות את האפשרות של לימודי גילוי שלכמת דפוסי מתילציה DNA והבדלים במתילציה DNA. בנוסף לגישות השערת מניבה אלה, יש צורך משמעותי לשיטות לכמת מתילציה DNA בדיקות ממוקדות / השערה. Pyrosequencing, PCR הספציפי מתילציה, וסנגר רצף ישיר של ה- DNA המרה bisulfite היה השיטות הנפוצות ביותר לניתוח של אזורים ממוקדים (כלומר, אזור אמרגן של גן יחיד או אי CPG) 9-12. כל השיטות האלה מסתמכים על המרת bisulfite, תגובה כימית שבי דיאמינציה ציטוזין unmethylated של מומרות לאורציל של, בעוד ציטוזין מפוגל של להישאר 13,14 ללא פגע. ההגברה PCR של bisulfite-תוצאות המרה DNA בהחלפת אורציל של עם תימין 15 מאפשרות מתילציה ההפרש לקרוא את דרכו כהבדל בסיס. אמנם שימושי מאוד, המגבלות לשיטות אלה כוללות דיוק נמוך כמותי, אורך קריאה קצר, ותפוקת מדגם נמוכה. כדי לתת מענה למגבלות אלה פיתחנו שיטה שכינינו Bisulfite Amplicon רצף (BSAS) 16. מטרתה של שיטה זו היא להיות מסוגלת לנתח אזורים הגנומי היעד של עניין במספר גדול של דגימות עם דיוק כמותית גבוה. BSAS משתמש באלמנטים של שיטות קיימות (המרה bisulfite והגברת PCR ספציפית לאזור) ומשלב אותם עם בנייה פשוטה של הדור הבא ספרייה (בתיווך transposome) 17 וbenchtop NGS 18 (איור 1). גישה זו מספקת לשיטת תפוקה יותר גבוהה כמותי ולבחון את מתילציה ציטוזין בכל אזור של עניין. כאן אנו מציגים אתשיטה בפירוט ותיאור גישות לפתרון בעיות ובדיקת איכות תהליך BSAS.

<table><tbody><tr><td>Agilent 2100 Bioanlyzer</td><td>Agilent</td><td>G29393AA</td><td></td></tr><tr><td>Agilent RNA 6000 Nano kit</td><td>Agilent</td><td>5067-1511</td><td></td></tr><tr><td>Agilent High Sensitivity DNA kit</td><td>Agilent</td><td>5067-4626</td><td></td></tr><tr><td>Typhoon 9200</td><td>Amersham/GE Healthcare Life Sciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agencourt AMPure XP - PCR Purification</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>5 ml</td></tr><tr><td>PowerPac Basic Power Supply</td><td>Bio Rad</td><td>164-5050</td><td></td></tr><tr><td>twin.tech PCR plate 96&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>951020362</td><td>semi-skirted</td></tr><tr><td>Heatsealing Film</td><td>Eppendorf</td><td>0030127838</td><td></td></tr><tr><td>Heatsealing Foil</td><td>Eppendorf</td><td>0030127854</td><td></td></tr><tr><td>Heat Sealer</td><td>Eppendorf</td><td>5390000.024</td><td></td></tr><tr><td>0.1-10 &amp;#956;l Tips</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.002</td><td></td></tr><tr><td>2-200 &amp;#956;l Tips</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.045</td><td></td></tr><tr><td>50-1,000 &amp;#956;l Tips</td><td>Eppendorf</td><td>0030073.100</td><td></td></tr><tr><td>MixMate&amp;nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>5353000.014</td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml Microcentrifuge Tubes</td><td>Eppendorf</td><td>0030121.023</td><td></td></tr><tr><td>Centrifuge 5424</td><td>Eppendorf</td><td>5424000.010</td><td></td></tr><tr><td>2.0 ml Microcentrifuge Tube</td><td>Eppendorf</td><td>022363352</td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html&quot;&gt;Nextera XT DNA Sample Preparation Kit&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1024</td><td>24 rxn</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/products/nextera_xt_dna_library_prep_kit.html&quot;&gt;Nextera XT Index Kit&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td>FC-131-1001</td><td>24 indexes</td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/systems/miseq.html&quot;&gt;MiSeq Desktop Sequencer&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&lt;a href=&quot;http://www.illumina.com/products/miseq_reagent_kit_v2.html&quot;&gt;MiSeq Reagent Kit v2&lt;/a&gt;</td><td>Illumina</td><td>MS-102-2002</td><td>300 cycles</td></tr><tr><td>KAPA SYBR FAST Universal qPCR kit</td><td>KAPA Biosystems</td><td>KK4824</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT PicoGreen dsDNA Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>P7589</td><td></td></tr><tr><td>Quant-iT RiboGreen RNA Assay kit</td><td>Life Technologies</td><td>R11490</td><td></td></tr><tr><td>ProFlex 96-well PCR system</td><td>Life Technologies</td><td>4484075</td><td></td></tr><tr><td>Novex 6% TBE DNA gel</td><td>Life Technologies</td><td>EC6261BOX</td><td>10-well</td></tr><tr><td>Novex TBE Running Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6675</td><td>5x (1 L)</td></tr><tr><td>Novex Hi-Density TBE Sample Buffer</td><td>Life Technologies</td><td>LC6678</td><td>5x (10 ml)</td></tr><tr><td>1 Kb Plus DNA Ladder</td><td>Life Technologies</td><td>10787-018</td><td></td></tr><tr><td>Xcell SureLock Mini-Cell</td><td>Life Technologies</td><td>EI0001</td><td></td></tr><tr><td>UltraPure 10 mg/ml Ethidium Bromide</td><td>Life Technologies</td><td>15585-011</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Fast Real-Time PCR system</td><td>Life Technologies</td><td>4329001</td><td>384-well block</td></tr><tr><td>DynaMag-96 Side Skirted</td><td>Life Technologies</td><td>12027</td><td></td></tr><tr><td>SpectroMax M2 Multi-Mode Microplate Reader</td><td>Molecular Devices/VWR</td><td>89429-532</td><td></td></tr><tr><td>AllPrep DNA/RNA Mini Kit</td><td>Qiagen</td><td>80204</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Beads</td><td>Qiagen</td><td>69989</td><td>5 mm</td></tr><tr><td>CLC Genomics Workbench</td><td>Qiagen</td><td></td><td>Software for methylation pipeline</td></tr><tr><td>QIAQuick PCR Purification kit</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>TissueLyser II</td><td>Retsch/Qiagen</td><td>85300</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-Free Water</td><td>Sigma</td><td>W4502</td><td></td></tr><tr><td>TRIS hydrochloride</td><td>Sigma</td><td>PHG0002-100G</td><td></td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>Sigma</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>384-well Full-Skirted Plate, Standard</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1384</td><td></td></tr><tr><td>Absolute qPCR Seal</td><td>Thermo Scientific</td><td>AB-1170</td><td></td></tr><tr><td>EZ DNA Methylation-Lightning kit</td><td>Zymo Research</td><td>D5030</td><td>50 rxn</td></tr><tr><td>ZymoTaq DNA Polymerase</td><td>Zymo Research</td><td>E2001</td><td>50 rxn</td></tr></tbody></table>

targeted dna methylation analysis by next-generation sequencing

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of particular interest for epigenetic studies as it has been demonstrated to be both a long lasting and a dynamic regulator of gene expression. Efforts to examine epigenetic changes in health and disease have been hindered by the lack of high-throughput, quantitatively accurate methods. With the advent and popularization of next-generation sequencing (NGS) technologies, these tools are now being applied to epigenomics in addition to existing genomic and transcriptomic methodologies. For epigenetic investigations of cytosine methylation where regions of interest, such as specific gene promoters or CpG islands, have been identified and there is a need to examine significant numbers of samples with high quantitative accuracy, we have developed a method called Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS). This method combines bisulfite conversion with targeted amplification of regions of interest, transposome-mediated library construction and benchtop NGS. BSAS offers a rapid and efficient method for analysis of up to 10 kb of targeted regions in up to 96 samples at a time that can be performed by most research groups with basic molecular biology skills. The results provide absolute quantitation of cytosine methylation with base specificity. BSAS can be applied to any genomic region from any DNA source. This method is useful for hypothesis testing studies of target regions of interest as well as confirmation of regions identified in genome-wide methylation analyses such as whole genome bisulfite sequencing, reduced representation bisulfite sequencing, and methylated DNA immunoprecipitation sequencing.

BSAS קורא מיושר כהלכה לרצף התייחסות המומר יהיה דומה איור 5. ניתן לזהות בבירור dinucleotides CPG וניתן לאמוד במדינות מתילציה על ידי התבוננות שיחות בסיס באתרי CPG בממופה קורא. לדוגמא, עם פקדי מתילציה, 0 מתילציה% תגרום לכל קורא ממופה לאתרים המכילים CPG (איור 5 א) של טי. בקרות מתילציה 100% יגרמו לכל קורא ממופה קוראת לאתרים המכילים CPG של C (איור 5). לכמת את תדירות ציטוזין (C / C + T) באתרי CPG מניב את תדירות מתילציה במדגם המקורי. עקומה סטנדרטי נציג המופקת מבקרות כל מתילציה הגנום (n = 3 / יחס מתילציה) מראה הליניאריות של quantitation מתילציה, כמו גם דיוק בquantitation בכל יחס מתילציה (איור 6). כדוגמא לשיטה זו בסך הכל, RNA ו- DNA היו שיתוף iso<html> קשורות זו לזו מהמוח הקטן עכבר ורשתית (n = 4 / קבוצה). ביטוי רודופסין, הביע באופן סלקטיבי ברקמת רשתית, נמדד באמצעות qPCR. ביטוי זוהה רק ברשתית (איור 7 א). באמצעות BSAS, רמות מתילציה CPG היו לכמת באזור אמרגן רודופסין. רמות מתילציה מצטברות ברחבי אזור האמרגן היו&gt; 80% במוח הקטן בהשוואה ל&lt; 15% ברשתית (p &lt;0.001, t-test פרמטרית) (איור 7). יתרונות BSAS quantitation מתילציה מquantitation מתילציה ספציפי לאתר, ורמות מתילציה ניתן להשוות על בסיס CPG ספציפי על פני כל אזור גנומי נתון. רמות מתילציה CPG פני אמרגן רודופסין היו גבוהות יותר משמעותי בדגימות המוח הקטן בהשוואה לדגימות רשתית (p &lt;0.001, t-test פרמטרית בכל אתר CPG) (איור 7 ג). 1highres.jpg &quot;/&gt; איור 1:. סכמטי של שיטת BSAS בשיטה זו, הדנ&quot;א הגנומי הוא bisulfite המרה לשנות cytosines unmethylation לuracils. בהמשך לכך, במהלך PCR uracils אלה השתנו לthymines. PCR הגברה מכוונת נגד אזורים של עניין ומעשירה מאוד עבור רק רצפים אלה. Amplicons PCR כתוצאה מכך הם הפכו לספריות צמודות כפולים בתהליך tagmentation פשוט. בהמשך לכך ספריות רצף ברצף הדור הבא benchtop ורצף כניסות ממופים למתילציה בסיליקון והמיר רצף התייחסות ואחוזים של ציטוזין של נקבע באופן ספציפי לבסיס. <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig2highres.jpg" /> איור 2:. בהמרת bisulfite סיליקון ושל האזור של עניין כל אזור של עניין מכל התייחסות הגנומי יכול להיות אין תמיכה בבחירהטד בהמרת bisulfite סיליקון. cytosines ללא CPG מוחלף בתימין של ברצף ההתייחסות. cytosines CPG להישאר cytosines בbisulfite המיר התייחסות. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig3highres.jpg" /> איור 3:. פריימרים מיקום פריימר Bisulfite PCR נועדו נגד בbisulfite סיליקון והמיר רצף התייחסות. Primers הוא להיות מתוכנן כך שהם אינם חופפים dinucleotides CG או תוכנן בסמוך לdinucleotides CG. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig4highres.jpg" /> איור 4: דוגמאות לamplicons PCR באיכות הגבוהה ועניה וספריות רצף עקבות electropherogram נציג ותכנית ג&#39;ל () amplicon האידיאלית עבור דור ספרייה בתיווך transposome עם אחד גבוה.<html> מוצר ריכוז. הספרייה (B) שהופקה מamplicon זה מראה ריכוז גבוה ואפילו הפצת גודל. amplicons PCR (C) מאיכות ירודה, יכולה להיות נמוכה בגודל, ריכוז, ומכיל מספר רב של מוצרים ו / או הדימרים פריימר. amplicons האיכות הירודה אלה תוביל ל( D) נכשלה דור ספרייה עם ריכוז נמוך והתפלגות גודל נמוכה. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig5highres.jpg" /> איור 5: דוגמאות לפלטי רצף מפקדי מתילציה. (א) בסיליקון והמיר רצף התייחסות עם אתרי CPG מסומן באדום. 0% שליטת מתילציה ממופות קוראת לthymines נבחר האזור מראה (שיא תאוות בצע) מיפוי באתרי CPG. שליטת מתילציה 100% (B) הממופה קוראת להראות המיפוי של ציטוזין (גולת כותרת הכחולה) באתרי CPG. together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig6highres.jpg" /> איור 6:. Quantitation מתילציה על פני מגוון של בקרות מתילציה בקרות מתילציה הגנום כולו מעורבות ביחסי מתילציה (n = 3 / יחס) בין 0% ל 100% היו לכמת באמצעות BSAS. זומם לכמת צפוי לעומת לכמת מדגים הליניאריות של quantitation שליטת מתילציה. בכל הפקדים, היה דיוק גבוה בquantitation מתילציה. <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52488/52488fig7highres.jpg" /> איור 7: דוגמא לניתוח מתילציה DNA וביטוי גנים לזווג מדגימות רקמה. מתילציה אמרגן הממוצעת Rhodopsin לכמת ידי BSAS בין המוח הקטן וDNA רשתית (*** p &lt;0.001, t-test פרמטרית) ביטוי mRNA היחסי Rhodopsin מהמוח קטן עכבר ורקמת רשתית (). (ב). &lt;רמות strong&gt; C ספציפי לאתר CPG) מתילציה פני אמרגן רודופסין (-244 +6, ביחס לאתר תחילת שעתוק [TSS]) במוח קטן עכבר וDNA הרשתית.

Watch this Scientific Journal Video about Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing at JoVE.com

Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

ממוקד DNA מתילציה ניתוח על ידי רצף של הדור הבא

The role of epigenetic processes in the control of gene expression has been known for a number of years. DNA methylation at cytosine residues is of ...

targeted-dna-methylation-analysis-by-next-generation-sequencing

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

37.0K Views.  University of Oklahoma College of Medicine. Bisulfite amplicon sequencing (BSAS) is a method for quantifying cytosine methylation in targeted genomic regions of interest. This method uses bisulfite conversion paired with PCR amplification of target regions prior to next-generation sequencing to produce absolute quantitation of DNA methylation at a base-specific level.

Video: Targeted DNA Methylation Analysis by Next-generation Sequencing

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable development and differentiation of different tissue types. Dysregulation of this process is often the hallmark of various diseases like cancer. Here, we outline one of the recent sequencing techniques, Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq), used to quantify methylation in various normal and disease tissues for large patient cohorts. We describe a detailed protocol of this affinity enrichment approach along with a bioinformatics pipeline to achieve optimal quantification. This technique has been used to sequence hundreds of patients across various cancer types as a part of the 1,000 methylome project (Cancer Methylome System).

Here we present a protocol to investigate genome wide DNA methylation in large scale clinical patient screening studies using the Methyl-Binding DNA Capture sequencing (MBDCap-seq or MBD-seq) technology and the subsequent bioinformatics analysis pipeline.

רצף ללכוד מתיל-DNA מחייב עבור רקמות חולות

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Genetics

Comprehensive DNA Methylation Analysis Using a Methyl-CpG-binding Domain Capture-based Method in Chronic Lymphocytic Leukemia Patients

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during cancer development and progression. Despite this, the global epigenetic regulation of lncRNAs and repetitive sequences in cancer has not been well investigated, particularly in chronic lymphocytic leukemia (CLL). This study focuses on a unique approach: the immunoprecipitation-based capture of double-stranded, methylated DNA fragments using methyl-binding domain (MBD) proteins, followed by next-generation sequencing (MBD-seq). CLL patient samples belonging to two prognostic subgroups (5 IGVH mutated samples + 5 IGVH unmutated samples) were used in this study. Analysis revealed 5,800 hypermethylated and 12,570 hypomethylated CLL-specific differentially methylated genes (cllDMGs) compared to normal healthy controls. Importantly, these results identified several CLL-specific, differentially methylated lncRNAs, repetitive elements, and protein-coding genes with potential prognostic value. This work outlines a detailed protocol for an MBD-seq and bioinformatics pipeline developed for the comprehensive analysis of global methylation profiles in highly CpG-rich regions using CLL patient samples. Finally, a protein-coding gene and an lncRNA were validated using pyrosequencing, which is a highly quantitative method to analyze CpG methylation levels to further corroborate the findings from the MBD-seq protocol.

This work describes an optimized methyl-CpG-binding domain (MBD) sequencing protocol and a computational pipeline to identify differentially methylated CpG-rich regions in chronic lymphocytic leukemia (CLL) patients.

ניתוח מקיף מתילציה DNA באמצעות Methyl-CpG מחייב דומיין לכידת מבוסס שיטה בחולים לוקמיה לימפוציטית כרונית

The role of long noncoding RNAs (lncRNAs) in cancer is coming to the forefront due to growing interest in understanding their mechanistic functions during ...

Methodology for Accurate Detection of Mitochondrial DNA Methylation

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert unmethylated cytosine into uracil, in a single-stranded DNA context. Bisulfite sequencing can be targeted (using PCR) or performed on the whole genome and provides absolute quantification of cytosine methylation at the single base-resolution. Given the distinct nature of nuclear- and mitochondrial DNA, notably in the secondary structure, adaptions of bisulfite sequencing methods for investigating cytosine methylation in mtDNA should be made. Secondary and tertiary structure of mtDNA can indeed lead to bisulfite sequencing artifacts leading to false-positives due to incomplete denaturation poor access of bisulfite to single-stranded DNA. Here, we describe a protocol using an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with bioinformatic analysis pipeline to allow accurate quantification of cytosine methylation levels in mtDNA. In addition, we provide guidelines for designing the bisulfite sequencing primers specific to mtDNA, in order to avoid targeting undesirable NUclear MiTochondrial segments (NUMTs) inserted into the nuclear genome.

Here, we present a protocol to allow accurate quantification of mitochondrial DNA (mtDNA) methylation. In this protocol, we describe an enzymatic digestion of DNA with BamHI coupled with a bioinformatic analysis pipeline which can be used to avoid overestimation of mtDNA methylation levels caused by the secondary structure of mtDNA.

מתודולוגיה עבור איתור מדויק של מתילציה DNA מיטוכונדריאלי

Quantification of DNA methylation can be achieved using bisulfite sequencing, which takes advantage of the property of sodium bisulfite to convert ...

A Rat Methyl-Seq Platform to Identify Epigenetic Changes Associated with Stress Exposure

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these animal models. The rat is one particular model animal where an epigenetic tool can complement many pharmacological and behavioral studies to provide insightful mechanistic information. To this end, we adapted the SureSelect Target Capture System (referred to as Methyl-Seq) for the rat, which can assess DNA methylation levels across the rat genome. The rat design targeted promoters, CpG islands, island shores, and GC-rich regions from all RefSeq genes. 
To implement the platform on a rat experiment, male Sprague Dawley rats were exposed to chronic variable stress for 3 weeks, after which blood samples were collected for genomic DNA extraction. Methyl-Seq libraries were constructed from the rat DNA samples by shearing, adapter ligation, target enrichment, bisulfite conversion, and multiplexing. Libraries were sequenced on a next-generation sequencing platform and the sequenced reads were analyzed to identify DMRs between DNA of stressed and unstressed rats. Top candidate DMRs were independently validated by bisulfite pyrosequencing to confirm the robustness of the platform.
Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is a useful epigenetic tool that can capture methylation changes induced by exposure to stress.

Here, we describe the protocol and implementation of Methyl-Seq, an epigenomic platform, using a rat model to identify epigenetic changes associated with chronic stress exposure. Results demonstrate that the rat Methyl-Seq platform is capable of detecting methylation differences that arise from stress exposure in rats.

פלטפורמה מתיל-Seq חולדה כדי לזהות שינויים Epigenetic הקשורים בחשיפה מתח

As genomes of a wider variety of animals become available, there is an increasing need for tools that can capture dynamic epigenetic changes in these ...

Biochemistry

Optimized Analysis of DNA Methylation and Gene Expression from Small, Anatomically-defined Areas of the Brain

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to the display of physiological and behavioural phenotypes. Such environmental programming is likely to increase the susceptibility to metabolic, cardiovascular and mental diseases 3,4.
DNA methylation and histone modifications are considered key processes in the mediation of the gene-environment dialogue and appear also to underlay environmental programming 5. In mammals, DNA methylation typically comprises the covalent addition of a methyl group at the 5-position of cytosine within the context of CpG dinucleotides.
CpG methylation occurs in a highly tissue- and cell-specific manner making it a challenge to study discrete, small regions of the brain where cellular heterogeneity is high and tissue quantity limited. Moreover, because gene expression and methylation are closely linked events, increased value can be gained by comparing both parameters in the same sample.
Here, a step-by-step protocol (Figure 1) for the investigation of epigenetic programming in the brain is presented using the 'maternal separation' paradigm of early life adversity for illustrative purposes. The protocol describes the preparation of micropunches from differentially-aged mouse brains from which DNA and RNA can be simultaneously isolated, thus allowing DNA methylation and gene expression analyses in the same sample.

A streamlined workflow to study DNA methylation and gene expression changes upon early-life stress is shown. Starting from maternal separation of newborn mice and isolation of discrete brain tissues, we represent a protocol to simultaneously isolate DNA and RNA from brain tissue punches for subsequent bisulfite sequencing and RT-PCR analysis.

ניתוח אופטימיזציה של מתילציה דנ&quot;א ביטוי גנים מ, אזורים קטנים אנטומית מוגדרים של המוח

Exposure to diet, drugs and early life adversity during sensitive windows of life 1,2 can lead to lasting changes in gene expression that contribute to ...

Neuroscience

LINE-1 Methylation Analysis in Mesenchymal Stem Cells Treated with Osteosarcoma-Derived Extracellular Vesicles

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of DNA samples. It is resourceful, requires small amounts of DNA, and takes around 4&#8211;5 h of hands-on work. In the presented technique, DNA samples are first denatured then hybridized to probes that target DNA at either methylated or reference sites as a control. Hybridized DNA is separated into parallel reactions, one undergoing only ligation and the other undergoing ligation followed by HhaI-mediated digestion at unmethylated GCGC sequences. The resultant DNA fragments are amplified by PCR and separated by capillary electrophoresis. Methylated GCGC sites are not digested by HhaI and produce peak signals, while unmethylated GCGC sites are digested and no peak signals are generated. Comparing the control-normalized peaks of digested and undigested versions of each sample provides the methylation dosage ratio of a DNA sample. Here, MSPA is used to detect the effects of osteosarcoma-derived extracellular vesicles (EVs) on the methylation status of long interspersed nuclear element-1 (LINE-1) in mesenchymal stem cells. LINE-1s are repetitive DNA elements that typically undergo hypomethylation in cancer and, in this capacity, may serve as a biomarker. Ultracentrifugation is also used as a cost-effective method to separate extracellular vesicles from biological fluids (i.e., when preparing EV-depleted fetal bovine serum [FBS] and isolating EVs from osteosarcoma conditioned media [differential centrifugation]). For methylation analysis, custom LINE-1 probes are designed to target three methylation sites in the LINE-1 promoter sequence and seven control sites. This protocol demonstrates the use of MSPA for LINE-1 methylation analysis and describes the preparation of EV-depleted FBS by ultracentrifugation.

Described here is the use of a methylation-specific probe amplification method to analyze methylation levels of LINE-1 elements in mesenchymal stem cells treated with osteosarcoma-derived extracellular vesicles. Ultracentrifugation, a popular procedure for separating extracellular vesicles from fetal bovine serum, is also demonstrated.

קו 1 ניתוח מתילציה בתאי גזע מסנמצ'אל מטופלים עם אוסטאוסרקומה-מסחטות שלפוחיות

Methylation-specific probe amplification (MSPA) is a simple and robust technique that can be used to detect relative differences in methylation levels of ...

Genome-Wide Analysis of DNA Methylation in Gastrointestinal Cancer

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is a useful measure to provide an accurate analysis of the methylation status of gastrointestinal (GI) malignancies. Given the multiple potential translational uses of DNA methylation analysis, practicing clinicians and others new to DNA methylation studies need to be able to understand step by step how these genome-wide analyses are performed. The goal of this protocol is to provide a detailed description of how this method is used for the biomarker identification in GI malignancies. Importantly, we describe three critical steps that are needed to obtain accurate results during genome-wide analysis. Clearly and concisely written, these three methods are often lacking and not noticeable to those new to epigenetic studies. We used 48 samples of a GI malignancy (gastric cancer) to highlight practically how genome-wide DNA methylation analysis can be performed for GI malignancies.

Herein, we describe a procedure for genome-wide analysis of DNA methylation in gastrointestinal cancers. The procedure is of relevance to studies that investigate relationships between methylation patterns of genes and factors contributing to carcinogenesis in gastrointestinal cancers.

ניתוח גנום רחב של מתילציה DNA בסרטן מערכת העיכול

DNA methylation is an important epigenetic change that is biologically meaningful and a frequent focus of cancer research. Genome-wide DNA methylation is ...

Cancer Research

Continuous Fluorescence-Based Endonuclease-Coupled DNA Methylation Assay to Screen for DNA Methyltransferase Inhibitors

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) establish and maintain the DNA methylation pattern. Changes to the normal DNA methylation pattern are linked to cancer development and progression, making DNMTs potential cancer drug targets. Thus, identifying and characterizing novel small molecule inhibitors of these enzymes is of great importance. This paper presents a protocol that can be used to screen for DNA methyltransferase inhibitors. The continuous coupled kinetics assay allows for initial velocities of DNA methylation to be determined in the presence and absence of potential small molecule inhibitors. The assay uses the methyl-sensitive endonuclease Gla I to couple methylation of a hemimethylated DNA substrate to fluorescence generation.
This continuous assay allows for enzyme activity to be monitored in real time. Conducting the assay in small volumes in microtiter plates reduces the cost of reagents. Using this assay, a small example screen was conducted for inhibitors of DNMT1, the most abundant DNMT isozyme in humans. The highly substituted anthraquinone natural product, laccaic acid A, is a potent, DNA-competitive inhibitor of DNMT1. Here, we examine three potential small molecule inhibitors &#8212; anthraquinones or anthraquinone-like molecules with one to three substituents &#8212; at two concentrations to describe the assay protocol. Initial velocities are used to calculate the percent activity observed in the presence of each molecule. One of three compounds examined exhibits concentration-dependent inhibition of DNMT1 activity, indicating that it is a potential inhibitor of DNMT1.

DNA methyltransferases are potential cancer drug targets. Here, a protocol is presented to assess small molecules for DNA methyltransferase inhibition. This assay utilizes an endonuclease to couple DNA methylation to fluorescence generation and allows for enzyme activity to be monitored in real time.&#160;

בדיקת מתילציה רציפה של דנ"א מצומד אנדונוקלאז מבוססת פלואורסצנציה לסינון מעכבי מתיל-טרנספראז של DNA

DNA methylation, a form of epigenetic gene regulation, is important for normal cellular function. In cells, proteins called DNA methyltransferases (DNMTs) ...

DNA Methylation: Bisulphite Modification and Analysis

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene regulation is complex, but essentially involves modifications to the DNA itself or the proteins with which DNA associates. The predominant epigenetic modification of DNA in mammalian genomes is methylation of cytosine nucleotides (5-MeC). DNA methylation provides instruction to gene expression machinery as to where and when the gene should be expressed. The primary target sequence for DNA methylation in mammals is 5'-CpG-3' dinucleotides (Figure 1). CpG dinucleotides are not uniformly distributed throughout the genome, but are concentrated in regions of repetitive genomic sequences and CpG "islands" commonly associated with gene promoters (Figure 1). DNA methylation patterns are established early in development, modulated during tissue specific differentiation and disrupted in many disease states including cancer. To understand the biological role of DNA methylation and its role in human disease, precise, efficient and reproducible methods are required to detect and quantify individual 5-MeCs.
This protocol for bisulphite conversion is the "gold standard" for DNA methylation analysis and facilitates identification and quantification of DNA methylation at single nucleotide resolution. The chemistry of cytosine deamination by sodium bisulphite involves three steps (Figure 2). (1) Sulphonation: The addition of bisulphite to the 5-6 double bond of cytosine (2) Hydrolic Deamination: hydrolytic deamination of the resulting cytosine-bisulphite derivative to give a uracil-bisulphite derivative (3) Alkali Desulphonation: Removal of the sulphonate group by an alkali treatment, to give uracil. Bisulphite preferentially deaminates cytosine to uracil in single stranded DNA, whereas 5-MeC, is refractory to bisulphite-mediated deamination. Upon PCR amplification, uracil is amplified as thymine while 5-MeC residues remain as cytosines, allowing methylated CpGs to be distinguished from unmethylated CpGs by presence of a cytosine "C" versus thymine "T" residue during sequencing.
DNA modification by bisulphite conversion is a well-established protocol that can be exploited for many methods of DNA methylation analysis. Since the detection of 5-MeC by bisulphite conversion was first demonstrated by Frommer et al.1 and Clark et al.2, methods based around bisulphite conversion of genomic DNA account for the majority of new data on DNA methylation. Different methods of post PCR analysis may be utilized, depending on the degree of specificity and resolution of methylation required. Cloning and sequencing is still the most readily available method that can give single nucleotide resolution for methylation across the DNA molecule.

The gold standard for DNA methylation analysis is genomic sequencing of bisulphite converted DNA. This method takes advantage of the increased sensitivity of cytosine compared with 5-methylcytosine (5-MeC) to bisulphite deamination under acidic conditions. Unmethylated cytosines can be distinguished from methylated cytosines after PCR amplification of the target genomic DNA.

מתילציה DNA: Bisulphite שינוי וניתוח

Epigenetics describes the heritable changes in gene function that occur independently to the DNA sequence. The molecular basis of epigenetic gene ...

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing for Assessment of DNA Methylation at Base Pair Resolution

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine methylation patterns in cells. Reduced representation of whole genome bisulfite sequencing was developed to detect quantitative base pair resolution cytosine methylation patterns at GC-rich genomic loci. This is accomplished by combining the use of a restriction enzyme followed by bisulfite conversion. Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing (ERRBS) increases the biologically relevant genomic loci covered and has been used to profile cytosine methylation in DNA from human, mouse and other organisms. ERRBS initiates with restriction enzyme digestion of DNA to generate low molecular weight fragments for use in library preparation. These fragments are subjected to standard library construction for next generation sequencing. Bisulfite conversion of unmethylated cytosines prior to the final amplification step allows for quantitative base resolution of cytosine methylation levels in covered genomic loci. The protocol can be completed within four days. Despite low complexity in the first three bases sequenced, ERRBS libraries yield high quality data when using a designated sequencing control lane. Mapping and bioinformatics analysis is then performed and yields data that can be easily integrated with a variety of genome-wide platforms. ERRBS can utilize small input material quantities making it feasible to process human clinical samples and applicable in a range of research applications. The video produced demonstrates critical steps of the ERRBS protocol.

Enhanced Reduced Representation Bisulfite Sequencing is a method for the preparation of sequencing libraries for DNA methylation analysis based on restriction enzyme digestion combined with cytosine bisulfite conversion. This protocol requires 50 ng of starting material and yields base pair resolution data at GC-rich genomic regions.

משופר מופחת ייצוג Bisulfite רצף להערכה של DNA מתילציה ברזולוציה בסיסי זוג

DNA methylation pattern mapping is heavily studied in normal and diseased tissues. A variety of methods have been established to interrogate the cytosine ...