מתילציה של דנ"א היא אחת החתימות האפיגנטיות הנחקרות ביותר. סוגי סרטן רבים מאופיינים בשינויים ברמות מתילציה DNA, אשר קשורים עם ביטוי גנים חריגים ומומים גנומיים אחרים. יסודות גרעיניים ארוכים משולבים הם רצפים גנומיים חוזרים ונשנים שבדרך כלל יש להם רמות גבוהות של מתילציה.
עם זאת, לעתים קרובות הם הופכים hypermethylated בסרטן, אשר לגרום ההפעלה שלהם ומוביל לחוסר יציבות כרומוזומלית. במחקר זה, טיפלנו בתאי גזע mesenchymal עם ארסים חוץ תאיים שמקורם osteosarcoma כדי לראות אם כלי רכב חשמליים סרטניים יכולים להשפיע על מתילציה LINE-1 ב- MECs. סרום חזיר עוברי, שהוא מרכיב אינטגרלי במדיה של תרבות תאי היונקים, מכיל מספר רב של כלי רכב חשמליים שמקורם בבובין.
Evs אלה יפריעו לניתוח של Evs מתאים מעניינים שלנו, ולכן, כאשר גדל תאים לבידוד EV, חשוב להשתמש FBS מדולדל EV. קח את FBS בצינורות אולטרהצנטריים והצב אותם בדליים אולטרה-מרכזיים. לאזן את הדליים בתוך 10 מיליגרם אחד מהשני לפני טעינת אותם על רוטור מתנדנד.
מניחים את הרוטור באולטרהצנטריפוגה ולרוץ ב 100, 000 G במשך 19 שעות בארבע מעלות צלזיוס. לאחר הריצה, בזהירות לאסוף את השכבה העליונה בצבע בהיר של supernatant ולהעביר אותו צינור 50 מיליליטר. אין להפריע או להצינור את גלולת החום הכהה מכיוון שהיא מכילה כלי רכב חשמליים מ- FBS.
מעבירים את העל-טבעי דרך מסנן 0.22 מיקרון לצינור חדש של 50 מיליליטר. FBS מעוקר מסנן זה, מדולדל EV כעת ניתן להוסיף למדיית תרבות התא בעת גידול תאים עבור בידוד EV. לאסוף מדיה מותנה מתאים osteosarcoma גדל בתקשורת מדולדל EV.
כדי להסיר תאים ופסולת תאים, צנטריפוגה התקשורת המותנה ב 2500 G במשך 20 דקות בארבע מעלות צלזיוס. מעבירים את העל-טבעי לצינורות אולטרה-מרכזיים ומאזנים אותם כמו קודם לכן. צנטריפוגה הצינורות ב100, 000 G במשך שעתיים בארבע מעלות צלזיוס.
בזהירות להשליך את העל טבעי עוזב סביב מיליליטר אחד בתחתית. מוסיפים כ-20 מיליליטר של PBS לצינור ומצינורים בעדינות כדי לשטוף ולהשעות מחדש את גלולת ה-EV. לאזן את הצינורות ולבצע סיבוב נוסף של אולטרהצנטריות עם אותן הגדרות.
בזהירות להסיר את supernatant ולהשעות מחדש את גלולת EV ב 200 microliters של PBS על ידי צינורות עדינים. אחסן את כלי רכב חשמליים בצינורות עם כריכה נמוכה. כלי רכב חשמליים מטוהרים מאופיינים על ידי כתמים מערביים, ניתוח מעקב חלקיקים, מיקרוסקופ אלקטרונים שידור.
צלחת 15, 000 MSCs ל הבאר בצלחת 24 באר. לאחר 24 שעות, הסר מדיה ישנה, שטף את התאים באמצעות PBS ושנה למדיה המדולדל EV. לטפל בתאים עם OS-EVs בנקודות הזמן המתוזמנות.
לאחר הפסקת הטיפול EV, לחלץ DNA מהתאים בשיטה המתאימה. לניתוח מתילציה, השתמשנו בשיטת הגברה ספציפית לתילציה בהתאמה אישית. תכנן את בדיקות LINE-1 המותאמות אישית, כפי שנעשה בעבר, על ידי Pavicic ואחרים.
עבור בדיקות מתילציה, בחר שלושה רצפים המכילים את אתר הגבלת HhaI בתוך אזור האמרגן. עבור בדיקות בקרה, בחר שבעה רצפים ללא אתר הגבלת HhaI משאר רצף LINE-1. לדלל 70 ננוגרם של דגימת DNA במאגר TE לחמישה מיקרוליטרים.
מחממים את הדגימות במשך 10 דקות ב 98 מעלות צלזיוס ואז להתקרר ל 25 מעלות צלזיוס. הוסף שלושה microliters של תערובת הכלאה בדיקה לכל מדגם ולהפעיל את התרמוצ'ילר כדי לאפשר לבדיקות הכלאה ל- DNA. בטמפרטורת החדר, הוסיפו 30 מיקרוליטרים של תערובת שלאחר ההכלאה לכל מדגם.
מעבירים 10 מיקרוליטרים לצינור שני. מניחים את שני סטים של צינורות בתרמוצ'ילר ודגירה ב 48 מעלות צלזיוס לפחות דקה אחת. בעוד הדגימות הן ב 48 מעלות צלזיוס, להוסיף 10 microliters של תערובת קשירה לקבוצה הראשונה של צינורות ו 10 microliters של תערובת עיכול קשירה לסט השני של צינורות.
הפעל את תוכנית התרמוצ'ילסר הבאה. לאחר מכן, לסובב את הצינורות בו זמנית להגדיר את התרמוצ'ילר ל 72 מעלות צלזיוס. מוסיפים חמישה מיקרוליטרים של תערובת פולימראז לכל צינור ומ מניחים את הצינורות בתרמוציקלר.
הפעל את תוכנית PCR. בזמן שתוכנית ה-PCR פועלת, הכינו פתרון של תרכובת מיליליטר אחת המכילה 2.5 מיקרוליטרים בתקן גודל. Pipet 10 מיקרוליטרים של פתרון זה לכל שורה של צלחת באר אופטית 96.
לאחר PCR, לדלל את דגימות מעוכל מעוכל אחד עד מאה ואחד עד מאתיים, בהתאמה במים טהורים במיוחד. הוסף שני מיקרוליטרים של מוצר PCR מדולל לצלחת 96 באר. צנטריפוגה הצלחת ב 200 G במשך 15 עד 20 שניות כדי להסיר בועות אוויר.
לבצע ניתוח שבר של דגימות על ידי אלקטרופורזה נימי. פתח את תוצאות האלקטרופורזה נימי בתוכנת ניתוח אלקטרופרוגרמה. בחרו דוגמה והגדירו את החלונית ל-MLPA מהתפריט.
לחץ על הלוח ולחץ על פקד D כדי להחיל הגדרה זו על כל הדגימות. באופן דומה, הגדר את שיטת הניתוח כברירת מחדל microsatellite עבור כל הדגימות. בחר את כל הדגימות ולחץ על כפתור המשחק הירוק כדי להפעיל ניתוח, ולאחר מכן בחר את כל הדגימות ולחץ על כפתור הגרף כדי לדמיין את פסגות הבדיקה.
הגדל את אזור השיא לקבלת רזולוציה גבוהה יותר של הפסגות הבודדות. ודא כי כל 10 פסגות המתאימות לבדיקות מתערובת החללית LINE-1 מסומנים. בכרטיסיה גנוטיפים, יצא את התוצאות בתבנית CSV.
פתח את קובץ ה- CSV בתוכנה לניתוח נתונים ומיין את הנתונים לעמודות. סמן את שלושת פסגות אתר המתילציה לפי הגדלים שלהן. שבע הפסגות הנותרות תואמות את בדיקות הבקרה.
כאן אנו משתמשים בפסגות הגשושית LINE-1 2M שגודלן כ-117 זוגות בסיסים. עבור כל מדגם, חשב את אזור שיא הסכום של כל שבע פסגות הבקרה. חלק את אזור השיא של כל בדיקה LINE-1 בסכום זה.
עבור כל מדגם, לחלק את הערך של המדגם מתעכל על ידי זה של המדגם מעוכל כדי לקבל את יחס המינון מתילציה. ניתוח סופג מערבי אישר את נוכחותם של כלי רכב חשמליים עם אותות שנצפו עבור TSG101, HSP70 ו- CD63. היעדר אות calnexin הצביע על כך שדגימה EV היה טהור.
אינדיקציה נוספת של טוהר נצפתה עם TEM עם תנודות שלמות בגדלים שונים נוכח מדגם OS-EV. ריכוז חלקיקי OS-EV והתפלגות הגודל נמדדו על ידי NTA. 80% מהרכבים התת-חשמליים היו בטווח גודל של 50 עד 200 ננומטר.
כאן אנו יכולים לראות את יחסי המינון מתילציה של LINE-1 מ MSCs בנקודות זמן שונות של הטיפול EV. הקו האפור מייצג רמת מתילציה בסיסית מנקודת זמן אפס. בנקודת זמן שלוש, יש ירידה ביחס המינון מתילציה הממוצע לאחר הממשל של כלי רכב חשמליים, ובכך מצביע על היפרמתילציה.
אפקט זה hypermethylating של כלי רכב חשמליים בולט פחות בנקודת זמן שבע. כאן הראינו טכניקה פשוטה, רגישה וחזקה לניתוח מתילציה. זה דורש כמות נמוכה של DNA ללא המרה bisulfite מעורב וזה מתאים גם DNA מבודד מדגימות מוטבע פרפין.
השיטה כולה, עם החלקים הניסיוניים והאנליטיים, אורכת כיומיים. בשל מספר עותק גבוה של LINE-1 בגנום, המתילציה הבסיסית של LINE-1 גבוהה בדגימות רגילות. לכן, ההבדלים ברמות מתילציה של דגימות, כפי שנצפה בשיטה זו, עשויים להיות עדינים.
