פרוטוקול ציטומטריה המונית זה משמר את שלמות מח העצם כולו, ומאפשר להציל את המידע שאבד במהלך הכנת מדגם קונבנציונלי לניתוח של תאים שנחקרו. פרוטוקול בידוד מח עצם מהיר ובלתי מאמץ זה מאפשר רכישה של אוכלוסיות תאי מיאלואידים קצרי מועד, כגון תת-קבוצות נדירות של שושלת נויטרופילים. שימוש בציטומטריה המונית כדי לזהות בעבר תחת תאים חיסוניים מוערכים כגון תאים נויטרופילים-שושלת עשוי להיות השלכות רחבות על מגוון רחב של מחלות.
פרוטוקול זה משמר את שלמות התאים המיאלואידיים קצרי החיים הקיימים במח העצם ונוזלים להיות מיושמים בקלות על סוגי רקמות אחרים כגון הגידול המוצק. פישטנו את הפרוטוקול כדי להפוך אותו ידידותי למשתמש ככל האפשר, אבל כמו בכל המחקרים הביולוגיים זה עשוי להזדקק לכמה ריצות תרגול כדי לנהל. כאשר אתה עושה את זה בפעם הראשונה, אתה יכול לקבל את כל reagents שלך מוכן הראשון ולאחר מכן בקפדנות בצע את הפרוטוקול.
אם אתה נתקל בבעיות כלשהן, באפשרותך להתחבר ל- CyTOForum ולדבר עם משתמשי CyTOF אחרים שיכולים לסייע בפתרון בעיות. להכנת מדגם ביולוגי, טריקים פשוטים יכולים לעשות הבדל עצום עם התוצאה הסופית. הדגמה חזותית היא הרבה יותר קלה עבור משתמש חדש לתפוס את הפרוטוקול.
אם אתה עושה את זה בפעם הראשונה, אתה יכול לקבל את reagents שלך מוכן הראשון ולאחר מכן בקפדנות בצע את הפרוטוקול. לקציר מח עצם, מניחים עכבר C57 שחור בן שישה עד עשרה שבועות בתמונת השופע על כרית כירורגית סטרילית ולהשתמש 70% אתנול כדי לעקר את הבטן ואת הגפיים האחוריות. השתמש בזוג מספריים כירורגיים לנתח כדי לפתוח את חלל הבטן ולהסיר את העור כדי לחשוף את הגפיים האחוריות.
באמצעות זוג מעצורי ההלבשה קהה הטה, להחזיק את השוקה העכבר ממש מתחת לקרסול ולהשתמש זוג מעצורי ההלבשה מעוקל לייצב את השוקה מתחת מעצורי ההלבשה קהה הטה. השתמש מאלץ ההלבשה קהה הטה לשבור את השוקה ולהסיר את השריר כדי לחשוף את העצם. לפני הנחת השוקה ב- PBS קר, להזיז את מטלפסי ההלבשה המעוקלים המייצבים אל עצם הירך ולהחליק את מעצורי ההלבשה קהה קצה מתחת למפרק הברך להחזיק את פיקת הברך.
בעדינות למשוך את כדי לסלק את פיקת הברך ולהסיר את השריר מן פיקת הברך כדי לחשוף את עצם הירך. החזק את עצם הירך החשופה על ידי מעצורי ההלבשה המעוקלים ולהשתמש במספריים כירורגיים כדי לחתוך את עצם הירך מתחתית העצם. ואז למקם את עצם הירך ב- PBS.
לאחר מכן, השתמש במחט 18 מד כדי לנקר חור בצינור מיקרו צנטריפוגה 0.5 מיליליטר ולמקום את שתי העצמות בצינור עם הקצוות הפתוחים של העצמות פונה כלפי מטה לתוך החור. מניחים את הצינור 0.5 מיליליטר לתוך צינור מיקרו צנטריפוגה 1.7 מיליליטר ולסובב את הצינורות שכבתי כפול בצנטריפוגה מיקרו. בסוף הצנטריפוגה, לאשר כי מח העצם כבר מופק לתחתית הצינור.
כדי להכתים את תאי מח העצם עבור ציטומטריה המונית, להשעות מחדש את מח העצם במיליליטר אחד של חיץ תריס תא דם אדום במשך 10 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה במיליליטר אחד של PBS קר. לסנן את התאים דרך מסננת 70 מיקרומטר לתוך צינור חרוט 15 מיליליטר ולשטוף את התאים עם תשעה מיליליטר של PBS טרי, קר.
להשעות מחדש את גלולת תא מח העצם ב 10 מיליליטר של PBS טרי, קר לספירה ולהעביר חמש פעמים 10 כדי aliquot התא השישי לתוך צינור חדש 15 מיליליטר. לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את התאים במיליליטר אחד של חיץ הכתמת ציטומטריה המונית, בתוספת 125 ציספלטין ננומולרי. לאחר חמש דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף את התאים בארבעה מיליליטר של חיץ ציטומטריה מסה טרי.
להשעות מחדש את גלולה ב 50 microliters של פתרון חסימת קולטן FC. לאחר 10 דקות בארבע מעלות צלזיוס, מוסיפים 50 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים המעניין את התאים ומערבבים בעדינות. הטמפרטורה בשלבי דגירה שונים חשובה מאוד בשימור הכדאיות של תאי מח העצם.
לאחר 30 דקות בארבע מעלות צלזיוס, לשטוף את התאים פעמיים בשני מיליליטר של חיץ ציטומטריה מסה טרי לכל לשטוף לפני השעיית התאים במיליליטר אחד של פורמלדהיד מוכן טרי 1.6% במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. בסוף הדגירה, לאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה מחדש להשעות את גלולה במיליליטר אחד של חיץ סלם קבוע בתוספת 125 פתרון אינטרקלציה ננומולרי עבור דגירה לילה בארבע מעלות צלזיוס. לפני ניתוח התאים על ידי ציטומטריה המונית, בעדינות מערבולת צנטריפוגה ההשעיה התא לפני שטיפת התאים בשני מיליליטר של חיץ כתמים ציטומטריה מסה טרי.
לאחר מכן, לשטוף את התאים פעמיים במיליליטר אחד של מים מזוקקים לכל לשטוף, בזהירות שאף את supernatant לאחר לשטוף השני לפני השעיית התאים באחת פעמים 10 לתאים השישי למיליליטר של ריכוז חיץ ציטומטריה המונית לניתוח ציטומטריה המונית. בעלילה זו של הטבעה של שכן סטוכסטי מבוזר T, התאים על פני רקמות עכבר מרובות היו מקובצים בתת-קבוצות בהתבסס על הדמיון של פרופילי ביטוי סמן פני השטח שלהם כפי שנמדדו על-ידי לוח ציטומטריה של מסה של 33 פרמטרים. תאים בעלי מאפיינים דומים יותר קובצו יחד באופן אוטומטי בהתבסס על הביטוי של סמנים אלה בכל תא.
בשיטה זו, שלמות מח העצם כולו נשמרה, מה שהוביל לגילוי אוכלוסיית תאים שלא הייתה ידועה קודם לכן, המבטאת בו זמנית נויטרופילים ותאי ההמוטופיטיים וסמני משטח חתימה של תאי ההמה. אוכלוסיית תאים זו, שהושמטה בעבר במחקרי אבי מיאלואידים, עקב דלדול תאים חיובי Ly6G, מציגה תבנית ברורה של ביטוי סמן פני השטח. חשוב מכך, נתונים אלה הובילו לגילוי תת-קבוצה קטנה של אשכול התאים החיובי Ly6G שאינו מבטא Ly6G, אך היה מקובץ בשיתוף פעולה הדוק לתאים החיוביים של CD117 Ly6G, מה שמרמז על הדמיון בין תאים אלה לשושלת הנויטרופילים בהתבסס על הביטוי של 33 סמני פני השטח המשמשים בניסוי ציטומיה המוני זה.
לאחר מכן ניתן היה לבנות לוח מיון תאים המופעל על ידי 13 צבעים, המאפשר בידוד של הצייטומיטורים הנויטרופילים על ידי ציטומטריית זרימה לצורך בדיקות תפקודיות במורד הזרם. חשוב לבצע את הליך בידוד מח העצם מהר ככל האפשר ולשמור על התאים בארבע מעלות צלזיוס במהלך הליך הכתם.
