Name: simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes
Uploaded: 2015-01-06T10:15:00.000+00:00
Duration: 11 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes at JoVE.com

We thank Zhaohua Irene Tang in the W. M. Keck Science Department for the use of her epifluorescence microscope and the Werren lab for donating Nasonia for dissections. This work was supported in part by an NIH-NRSA fellowship (5F32GM105317-02) to AML.

<ol>
	<li>Blattes, R., Kas, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+on+diploid+nuclei+and+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+melanogaster+larval+tissues.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) on diploid nuclei and mitotic chromosomes from Drosophila melanogaster larval tissues.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2009 (9), (2009).</li><li>Dimitri, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+with+transposable+element+probes+to+mitotic+chromosomal+heterochromatin+of+Drosophila.">Fluorescent in situ hybridization with transposable element probes to mitotic chromosomal heterochromatin of Drosophila.</a> Methods in Molecular Biology. 260, 29-39 (2004).</li><li>Pardue, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+situ+hybridization+to+polytene+chromosomes+in+Drosophila+using+digoxigenin-labeled+probes.">In situ hybridization to polytene chromosomes in Drosophila using digoxigenin-labeled probes.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2011 (8), 1003-1006 (2011).</li><li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heterochromatic+sequences+in+a+Drosophila+whole-genome+shotgun+assembly.">Heterochromatic sequences in a Drosophila whole-genome shotgun assembly.</a> Genome Biology. 3 (12), (2002).</li><li>Hoskins, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sequence+finishing+and+mapping+of+Drosophila+melanogaster+heterochromatin.">Sequence finishing and mapping of Drosophila melanogaster heterochromatin.</a> Science. 316 (58331), 1625-1628 (2007).</li><li>Treangen, T. J., Salzberg, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Repetitive+DNA+and+next-generation+sequencing:+computational+challenges+and+solutions.">Repetitive DNA and next-generation sequencing: computational challenges and solutions.</a> Nature Reviews Genetics. 13 (1), 36-46 (2012).</li><li>He, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mapping+the+pericentric+heterochromatin+by+comparative+genomic+hybridization+analysis+and+chromosome+deletions+in+Drosophila+melanogaster.">Mapping the pericentric heterochromatin by comparative genomic hybridization analysis and chromosome deletions in Drosophila melanogaster.</a> Genome Research. 22 (12), 2507-2519 (2012).</li><li>Pimpinelli, S., Bonaccorsi, S., Fanti, L., Gatti, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+in+situ+hybridization+(FISH)+of+mitotic+chromosomes+from+Drosophila+larval+brain.">Fluorescent in situ hybridization (FISH) of mitotic chromosomes from Drosophila larval brain.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2010 (3), (2010).</li><li>Larracuente, A. M., Noor, M. A., Clark, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Translocation+of+Y-linked+genes+to+the+dot+chromosome+in+Drosophila+pseudoobscura.">Translocation of Y-linked genes to the dot chromosome in Drosophila pseudoobscura.</a> Molecular Biology and Evolution. 27 (7), 1612-1620 (2010).</li><li>Ferree, P. M., Barbash, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Species-specific+heterochromatin+prevents+mitotic+chromosome+segregation+to+cause+hybrid+lethality+in+Drosophila.">Species-specific heterochromatin prevents mitotic chromosome segregation to cause hybrid lethality in Drosophila.</a> PLoS Biology. 7 (10), e1000234 (2009).</li><li>Williams, B. C., Karr, T. L., Montgomery, J. M., Goldberg, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+l(1)zw10+gene+product,+required+for+accurate+mitotic+chromosome+segregation,+is+redistributed+at+anaphase+onset.">The Drosophila l(1)zw10 gene product, required for accurate mitotic chromosome segregation, is redistributed at anaphase onset.</a> The Journal of Cell Biology. 118 (4), 759-773 (1992).</li><li>Gatti, M., Bonaccorsi, S., Pimpinelli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Looking+at+Drosophila+Mitotic+Chromosomes.">Looking at Drosophila Mitotic Chromosomes.</a> Methods in Cell Biology. 44, 371-391 (1994).</li><li>Werren, J. H., Stouthamer, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=PSR+(paternal+sex+ratio)+chromosomes:+the+ultimate+selfish+genetic+elements.">PSR (paternal sex ratio) chromosomes: the ultimate selfish genetic elements.</a> Genetica. 117 (1), 85-101 (2003).</li></ol>

The authors declare that they have no competing financial or any other conflict of interest.

DNA ISH משמש לעתים קרובות כדי למפות רצפים ספציפיים לכרומוזומים. שתארנו שיטה פשוטה לDNA ISH מותאם לגבוה עותק מספר, רצפי heterochromatic. במקום להשתמש בשטיפות בתמיסת פוראמיד, אשר היא דרישה בפרוטוקולי ISH DNA קיימים אחרים, אנו שמים שקופיות רכוב רקמה ישירות על בלוק מחומם מראש ללפגל DNA. שיטה זו עוקפת את השימוש בכמויות גדולות של פוראמיד. שלב קריטי אחד להפקת אותות הכלאה פריכות הוא לשימוש פתרון קיבעון טרי; כישלון לעשות זאת (או מה שהופך את הפתרון חדש עם paraformaldehyde שהיה פתוח יותר מאחד בחודש) עשוי להקטין רזולוציה אות. מגבלה של שיטה זו היא ש, כמו לפרוטוקולי DNA ISH אחרים, טמפרטורת ההכלאה עשויה לדרוש אופטימיזציה כדי לחסל הכלאה משונית כדי רצפים מחוץ היעד. פרוטוקול זה הוא בדיקות מצומדות עם fluorop יחיד רגישות-קצרות, ssDNAhore לכל מולקולה יכול לזהות בלוקים של חזרות עם מספרים אפילו נמוכים יחסית עותק חוזר (למשל, ~ 700 RSP חוזר; איור 2 ג). אותות ללוקים בלווין עם פחות חזרות יכולים להיות דמיינו עם בדיקות ssDNA קצרות באמצעות מצלמה דיגיטלית רגישה ביותר. אמנם לא מוצג כאן, שיטה זו יעילה גם למיפוי רצפים שאינם חוזר על עצמו בeuchromatin 10. באמצעות בדיקות ארוכות, biotinylated מספק גמישות רבה יותר באיתור רצפי עותק מספר נמוכים כאות יכולה בקלות להיות מוגברת על ידי טיפולים חוזרים ונשנים של אנטי-avidin וrhodamine-avidin 9 biotinylated. כדי להמחיש את עותק יחיד רצפים, הבדיקות מרובות פורש הרצף ייתכן שתהיינה צורך. לחלופין, יכולים להיות מתויגים כרומוזומים מלאכותיים בקטריאלי (BACS) המכילים את הרצף של עניין באמצעות תרגום לכינוי או לתחולו אקראי לשימוש כבדיקה לרצפים שאינם חוזר על עצמו 10. כדי למפות רצפים בקנה מידה בסדר, בדיקות מיקוד בידולחוזר t (כל אחד עם fluorophores שונה) יכול לשמש בו זמנית כדי לקבל את עמדתו של רצפי היעד ביחס לחזרות אחרות וציוני דרך מבנית בכרומוזומים. בזמן שאנחנו משתמשים בשתי בדיקות כאן (איור 2 א, ב &#39;, ד&#39;), מספר הבדיקות יכול בקלות להיות מוגבר לשלושה 10 או יותר, תלוי במספר של מסנני הקרינה מיקרוסקופ שונים זמינים. פרוטוקול זה יכול להתארך עד אחרים-רקמות שאימתנו כי הפרוטוקול עובד גם על קישואי כרומוזום polytene מבלוטות רוק. זה מתקבל על הדעת כי בשיטה זו להיות בשילוב עם אימונו-צביעה של חלבוני הכרומטין; עם זאת, מומלץ שחיסוני מכתים להתבצע כצעד ראשון ואחריו מחדש קיבעון עם paraformaldehyde לפני DNA ISH כדי למנוע אובדן נוגדן במהלך DNA ISH.

DNA הכלאה באתר (DNA ISH) הוא שיטה נפוצות לרצפי מיפוי לאזורים של כרומוזום מסוימים. יכולות להיות שנוצרו בדיקות לאזורי עותק יחידים בתוך euchromatin באמצעות קומץ של גישות, כולל nick-תרגום או בסופו תיוג של מוצרי DNA ארוכים 1,2 ושילוב של deoxygenin (DIG) נוקלאוטידים -attached וההכרה שלהם באמצעות מגוון רחב של נוגדנים-מצומדות קבוצה 1-3. ויזואליזציה של רצפי euchromatic בעותק מספר מעטים או בודד מחייבת השימוש בשני בדיקות יחידים, גדולות עם פעילות ספציפית גבוהה או קוקטייל של בדיקות מרובות, קטנות יותר, כי באופן קולקטיבי לשפר אות. בניגוד לכך, חוזר על עצמו מאוד רצפים נמצאו בheterochromatin, כגון DNAs לווין, הם מטרות קלים יותר לDNA ISH מכיוון שהם קיימים בדרך כלל כעשרות אלפי חזרות התקבצו באזורי כרומוזום יחידים הידועים כלוקים. אלמנטים ניידים גם יכולים להיותנמצא במספרים גבוהים בעותק לוקוסי כרומוזומליות שונים 2. במקרים אלה, בדיקות יחידים עם פעילות ספציפית נמוכה יכולות למעשה תווית רצפי heterochromatic בשל ההכלאה שלהם באתרים מרובים. בדיקות רצפים חוזרים יכולות להיות מסונתזת oligonucleotides הקצר מסחרי כ( 30-50 נ&quot;ב) וכימיות מצומדות עם כל קבוצות ניאון שונות מרובות. מיפוי רצפים חוזרים בתוך heterochromatin על ידי שימוש בטכנולוגיות הגנום רצף קשה בשל אתגרים נתקלו בפיגומי בניין בלוקי לווין חוזר על עצמו מאוד 4-6,7. נכון לעכשיו, איש עומד כדרך היעילה ביותר למיפוי רצפים אלה ברמה תת-כרומוזום. אסטרטגיה זו היא חשובה למיפוי מספרים גדולים של רצפים חוזרים הנחשפים על ידי מחקרי הגנום ורצף transcriptome מתמשכים. היעילות וקלות רצפים חוזרים מיפוי על כרומוזומים רכוב שקופיות תהיה GREמשופר atly על ידי פרוטוקול פשוט לDNA ISH. לדוגמא, פרוטוקולים קיימים לDNA ISH כרוכים שטיפות מרובות של רקמות הכלאה בפתרון פוראמיד 2,8, ובכך להוסיף משמעותי את הזמן הנדרש לרצפי מיפוי וגם לייצר כמויות גדולות של פסולת כימית למגיב יקר זה. כאן אנו מתארים שיטת DNA ISH מתוקנת שעוקפת את הצורך בשטיפת פוראמיד ומשתמש בציוד מעבדה בסיסי וחומרים כימיים. שיטה זו תוכננה במקור למיפוי המהיר של רצפי DNA חוזר על עצמו מאוד באזורי heterochromatic של neuroblasts זחל תסיסנית באמצעות oligos מסונתז מסחרי המצומדות עם צבעי הקרינה. עם זאת, שיטה זו פועלת גם למיפוי רצפים חוזרים באמצעות בדיקות גדולות יותר מסונתזים באמצעים אחרים 9,10 ועל פני סוגי רקמות וכרומוזום שונים מרובים. בנוסף, שיטה זו יכולה לשמש כדי למפות רצפי euchromatic באמצעות יותר או multiple, בדיקות קצרות בתוך רצף euchromatic של עניין.

<table><tbody><tr><td>Poly-L-lysine coated slides (regular slides also can be used)</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ultrafine tweezers (5 gauge)</td><td>Dumont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>22 x 22 mm cover slips</td><td>Fisher</td><td></td><td>Sigmacote-treated by immersion for 15 sec, blotting dry, and wiping away all traces of Sigmacote so that cover slip is clear</td></tr><tr><td>Sigmacote</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Filter paper</td><td></td><td></td><td>75 - 150 mm</td></tr><tr><td>Paraffin wax paper</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Heat block with thermometer</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dry incubator</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Razor blades</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Humidity chamber</td><td></td><td></td><td>empty pipette tip box or Tupperware, lined with moistened paper towels or Kimwipes</td></tr><tr><td>Coplin jars</td><td></td><td></td><td>with slide grooves</td></tr><tr><td>Aluminum foil</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pasteur pipettes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>1.5 ml microfuge tubes</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nail polish</td><td></td><td></td><td>clear or colored</td></tr><tr><td>P20 micropipette and plastic tips</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Paperclips</td><td></td><td></td><td>20 - 25 standard metal paperclips linked to form a chain</td></tr><tr><td colspan="4">Reagents</td></tr><tr><td>16% EM grade paraformaldehyde</td><td>Electron Microscopy Reagents</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Acetic acid</td><td>Sigma</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Liquid nitrogen</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol, chemical grade</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="4">Commercially synthesized, fluorescently labeled oligos</td></tr><tr><td>Long biotinylated probe</td><td>Invitrogen; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>&lt;em&gt;e.g.,&lt;/em&gt; nick translated and biotinylated with BioNick from Invitrogen</td></tr><tr><td>Rhodamine-Avidin</td><td>Roche; Alternative steps 2.7.1-2.7.3</td><td></td><td>for detection of long biotinylated probe</td></tr><tr><td>Hybridization buffer</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x SSCT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate + Tween</td></tr><tr><td>0.1x SSC</td><td>Recipe above</td><td></td><td>saline-sodium citrate</td></tr><tr><td>Blocking solution</td><td>Recipe above</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>SSC, bovine serum albumin, Tween</td></tr><tr><td>1x PBT</td><td>Recipe above</td><td></td><td>phosphate-buffered saline + Tween</td></tr><tr><td>1x PBS</td><td></td><td></td><td>phosphate-buffered saline</td></tr><tr><td>Hypotonic solution</td><td></td><td></td><td>0.5% sodium citrate in H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td></tr><tr><td>Formamide</td><td>Sigma Aldrich</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Vectashield mounting medium with DAPI</td><td>Vector laboratories</td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

simple method for fluorescence dna in situ hybridization to squashed chromosomes

DNA הכלאה באתר (DNA ISH) הוא שיטה נפוצות לרצפי מיפוי לאזורים של כרומוזום מסוימים. גישה זו היא יעילה במיוחד במיפוי רצפים חוזרים מאוד לאזורי heterochromatic, שבו גישות חישוביות להתמודד עם אתגרי אוסרני. כאן אנו מתארים פרוטוקול יעיל עבור DNA ISH שעוקף שוטף פוראמיד שהם צעדים סטנדרטיים בפרוטוקולי DNA ISH אחרים. הפרוטוקול שלנו מותאם להכלאה עם בדיקות יחידים קצרות גדיל DNA שנושאים צבעי ניאון, אשר למעשה לסמן רצפי DNA חוזר על עצמו באזורי כרומוזומים heterochromatic על פני מספר סוגים שונים של רקמות חרקים של. עם זאת, יישומים ניתן להאריך להשתמש עם בדיקות ויזואליזציה של רצפי DNA עותק יחיד (לא חוזר על עצמו) גדולים יותר. אנו מדגימים שיטה זו על ידי מיפוי כמה רצפים חוזרים שונים לכרומוזומים מעוכים מדרוזופילה melanogaster תאים עצביים וNasoniaspermatocytes vitripennis. אנחנו מראים דפוסי הכלאה של שני חלליות קטנות, מסונתזים באופן מסחרי ולבדיקה גדולה יותר להשוואה. הליך זה משתמש ציוד מעבדה פשוט וריאגנטים, והוא אידיאלי לחוקרים שיש להם ניסיון מועט עם ביצוע DNA ISH.

כדי להדגים שיטה זו, אנו הכלאה סט של oligos המסונתזת מסחרי הקטנה ששונו כימיים עם conjugates ניאון (איור 2) ובדיקה ארוכה יותר biotinylated (שנעשתה באמצעות תרגום ניק של מוצר ה- PCR; איור 2), לכרומוזומים מכמה רקמות שונות סוגים (ראה טבלה 1). רצפי היעד כללו חזרות לווין ממוקמות באזורי pericentromeric (heterochromatic) של כרומוזומים mitotic מד melanogaster neuroblasts זחל (איור 2 א-ג), והכרומוזומים meiotic מנ גלמים האשכים vitripennis (איור 2 ד). הכלאות בכל אחד מהמקרים הללו חשפו דפוסי פסים דיסקרטיים באזורים תת-כרומוזומלית. נקודה ראויה לציון היא אחד שהחללית לד melanogaster 359 חוזר לווין נ&quot;ב מכיר שני בלוק גדול רב megabase זוג על X, ואזור קטן בהרבה בכרומוזום 3(איור 2 א). בדיקה ארוכה יותר נגד הלווין מגיב גם מזהה בלוקים חוזרים בהיקף של מספרים נמוכים יחסית עותק חוזר (~ 700 עותקים; איור 2). לכן, שיטה זו מאפשרת הדמיה של בלוקים לווין קטנים מאוד. כדי לעזור לחשוף מבנה הכרומוזומים וסיוע בזיהוי כרומוזום, זה יכול להיות שימושי לטיפול בכרומוזומים עם פתרון hypotonic (המתואר בשלב 1.5). הרקמות ב2B ו2C לוחות דמות טופלו בפתרון hypotonic ל5 ו -10 דקות, בהתאמה. שים לב להפרדת chromatids האחות גדולה עם הטיפול הארוך יותר (איור 2 ג). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52288/52288fig2highres.jpg" width="600" /> איור 2: DNA הכלאה באתר ל() כרומוזומים neuroblast זחל מד melanogaster /ד simulans כלאיים; (ב) ו- (ג) כרומוזומים neuroblast זחל מד melanogaster טופל בפתרון hypotonic (ראה Dissection וצעד קיבוע 1); (ד) כרומוזומים meiotic מרקמת אשך גלמים של הצרעה תכשיט Nasonia vitripennis. ב (א), חיצים ירוקים מצביעים על אזורים קטנים של לווין AATAT על ד simulans 4 th כרומוזום, ואילו נקודות ראש החץ הירוקות לAATAT על ד melanogaster X כרומוזום. חץ אדום מדגיש אזור קטן של 359 נ&quot;ב בלווין ד melanogaster 3 rd כרומוזום, בעוד שהחץ האדום מסמן 359 רצפים נ&quot;ב על X. כל הלוויינים ב (א) היו הכלאה עם oligos קצר, שכותרתו fluorescently. ב( B), את האות הירוקה מתאימה ללווין AAGAG (אוליגו מסונתז) והאות האדומה היא נ&quot;ב 120 מגיב בלווין (בדיקה biotinylated; מסומןעם חצים אדומים). (אותו לווין מגיב עם אוליגו קצר שכותרתו fluorescently (חצים אדומים) C). ב( D), החץ האדום מסמן לווין שממוקם באופן ייחודי על כרומוזום יחס מינים האבהיים (PSR), שבו הוא B כרומוזום שאינו חיוני, עודפים שנמצא באוכלוסיות טבעיות של נ &#39; vitripennis 13, בעוד שהחץ הירוק מצביע בלווין באחד מהכרומוזומים הרגילים; הכלאה זו בוצעה באמצעות oligos קצר, שכותרתו fluorescently. כל הבדיקות מפורטות בטבלה 1. בר סולם בפנל () הוא 10 מיקרומטר. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52288/52288fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> שם בדיקה </td><td> סוג הבדיקה </td><td> Oligos </td><td><stro<html> ng&gt; לייבל </td></tr><tr><td> לווין AAGAG </td><td> אוליגו </td><td> (AAGAG) 7 </td><td> 5 &#39;6-FAM (העמסה) </td></tr><tr><td> לווין AATAT </td><td> אוליגו </td><td> (AATAT) 6 </td><td> 5&#39;-Cy3 </td></tr><tr><td> לווין 359-נ&quot;ב </td><td> אוליגו </td><td> CAT AAT AAT TCA TCA TTT TCC AAA TTT CGG </td><td> 5&#39;-Alexa555 </td></tr><tr><td> לווין PSR </td><td> אוליגו </td><td> AAC TGT TGG AAA AGG AAA ATG TAT TAT TGA </td><td> 5&#39;-Alexa555 </td></tr><tr><td> לווין אוטוזום Nasonia </td><td> אוליגו </td><td> GTC GGT AAT TTT GTG AAT TTT TCC ATC </td><td> 5&#39;-Alexa633 </td></tr><tr><td rowspan="2"> מגיב </td><td rowspan="2"> PCR </td><td> F-5 &#39;GGA AAA TCA CCC ATT TTG ATC GC </td><td rowspan="2"> ביוטין-14-dATP </td></tr><tr><td> &quot;R-5 CCG AAT TCA AGT ACC AGA C </td></tr></tbody></table>&gt; לוח 1: נסה לעורר סוגים המשמשים באיור 2.

Watch this Scientific Journal Video about Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes at JoVE.com

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

שיטה פשוטה DNA הקרינה<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה לכרומוזומים &quot;סתמת

DNA in situ hybridization (DNA ISH) is a commonly used method for mapping sequences to specific chromosome regions. This approach is particularly ...

simple-method-for-fluorescence-dna-situ-hybridization-to-squashed

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

18.0K Views.  University of Rochester. Here, we present a simple method for performing fluorescence DNA in situ hybridization (DNA ISH) to visualize repetitive heterochromatic sequences on slide-mounted chromosomes. The method requires minimal reagents and it is versatile for use with short or long probes, different tissues, and detection with fluorescence or non-fluorescence-based signals.

Video: Simple Method for Fluorescence DNA In Situ Hybridization to Squashed Chromosomes

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization (smFISH) Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect and count individual RNA molecules. Complementary to deep sequencing-based methods, smFISH provides information about the cell-to-cell variation in transcript abundance and the subcellular localization of a given RNA. Recently, we have used smFISH to study the expression of the gene&#160;NDC80&#160;during meiosis in budding yeast, in which two transcript isoforms exist and the short transcript isoform has its entire sequence shared with the long isoform. To confidently identify each transcript isoform, we optimized known smFISH protocols and obtained high consistency and quality of smFISH data for the samples acquired during budding yeast meiosis. Here, we describe this optimized protocol, the criteria that we use to determine whether high quality of smFISH data is obtained, and some tips for implementing this protocol in&#160;other yeast strains and growth conditions.

Single Molecule Fluorescence In Situ Hybridization smFISH Analysis in Budding Yeast Vegetative Growth and Meiosis

This single molecule fluorescence in situ hybridization protocol is optimized to quantify the number of RNA molecules in budding yeast during vegetative growth and meiosis.

קרינה פלואורסצנטית מולקולה בודדת ב באתרו הכלאה (smFISH) ניתוח הנצה גידול וגטטיבי שמרים, מיוזה

Single molecule fluorescence in situ hybridization (smFISH) is a powerful technique to study gene expression in single cells due to its ability to detect ...

Genetics

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. One important application of this method is the development of high-quality physical maps useful for improving the genome assemblies for various organisms. The natural banding pattern of polytene and mitotic chromosomes provides guidance for the precise ordering and orientation of the genomic supercontigs. Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, a well-established chromosome-based mapping technique has been developed only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes 1. As a result of genome mapping efforts, 88% of the An. gambiae genome has been placed to precise chromosome positions 2,3 . Two other mosquito genera, Aedes and Culex, have poorly polytenized chromosomes because of significant overrepresentation of transposable elements in their genomes 4, 5, 6. Only 31 and 9% of the genomic supercontings have been assigned without order or orientation to chromosomes of Ae. aegypti 7 and Cx. quinquefasciatus 8, respectively. Mitotic chromosome preparation for these two species had previously been limited to brain ganglia and cell lines. However, chromosome slides prepared from the brain ganglia of mosquitoes usually contain low numbers of metaphase plates 9. Also, although a FISH technique has been developed for mitotic chromosomes from a cell line of Ae. aegypti 10, the accumulation of multiple chromosomal rearrangements in cell line chromosomes 11 makes them useless for genome mapping. Here we describe a simple, robust technique for obtaining high-quality mitotic chromosome preparations from imaginal discs (IDs) of 4th instar larvae which can be used for all three genera of mosquitoes. A standard FISH protocol 12 is optimized for using BAC clones of genomic DNA as a probe on mitotic chromosomes of Ae. aegypti and Cx. quinquefasciatus, and for utilizing an intergenic spacer (IGS) region of ribosomal DNA (rDNA) as a probe on An. gambiae chromosomes. In addition to physical mapping, the developed technique can be applied to population cytogenetics and chromosome taxonomy/systematics of mosquitoes and other insect groups.

Fluorescent in situ Hybridization on Mitotic Chromosomes of Mosquitoes

Among the three mosquito genera, namely Anopheles, Aedes, and Culex, physical genome mapping techniques were established only for Anopheles, whose members possess readable polytene chromosomes. For the genera of Aedes and Culex, however, cytogenetic mapping remains challenging because of the poor quality of polytene chromosomes. Here we present a universal protocol for obtaining high-quality preparations of mitotic chromosomes and an optimized FISH protocol for all three genera of mosquitoes.

פלואורני<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה על כרומוזומים mitotic של יתושים

Fluorescent in situ hybridization (FISH) is a technique routinely used by many laboratories to determine the chromosomal position of DNA and RNA probes. ...

Immunology and Infection

Preparation of Drosophila Polytene Chromosome Squashes for Antibody Labeling

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological advantages provided by the giant salivary gland polytene chromosomes of third instar larvae.  In this tissue the chromosomes undergo many rounds of replication in the absence of cell division giving rise to approximately 1000 copies.  The DNA remains aligned after each replicative cycle resulting in greatly enlarged chromosomes that provide a unique opportunity to correlate chromatin morphology with the localization of specific proteins.  Consequently, there has been a high level of interest in defining the epigenetic modifications present at different genes and at different stages of the transcription process. An important tool for such studies is the labeling of polytene chromosomes with antibodies to the enzyme, transcription factor, or histone modification of interest. This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

This video protocol illustrates the squash technique used in the Johansen laboratory to prepare Drosophila polytene chromosomes for antibody labeling.

הכנת מועכת תסיסנית Polytene כרומוזום עבור סימון נוגדן

Drosophila has long been a favorite model system for studying the relationship between chromatin structure and gene regulation due to the cytological ...

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological processes. In particular, appropriate regulation of calcium activity patterns during embryogenesis is necessary for many aspects of vertebrate neural development, including proper neural tube closure, synaptogenesis, and neurotransmitter phenotype specification. While the observation that calcium activity patterns can differ in both frequency and amplitude suggests a compelling mechanism by which these fluxes might transmit encoded signals to downstream effectors and regulate gene expression, existing population-level approaches have lacked the precision necessary to further explore this possibility. Furthermore, these approaches limit studies of the role of cell-cell interactions by precluding the ability to assay the state of neuronal determination in the absence of cell-cell contact. Therefore, we have established an experimental workflow that pairs time-lapse calcium imaging of dissociated neuronal explants with a fluorescence in situ hybridization assay, allowing the unambiguous correlation of calcium activity pattern with molecular phenotype on a single-cell level. We were successfully able to use this approach to distinguish and characterize specific calcium activity patterns associated with differentiating neural cells and neural progenitor cells, respectively; beyond this, however, the experimental framework described in this article could be readily adapted to investigate correlations between any time-series activity profile and expression of a gene or genes of interest.

Fluorescent Calcium Imaging and Subsequent In Situ Hybridization for Neuronal Precursor Characterization in Xenopus laevis

We present a two-part protocol that combines fluorescent calcium imaging with in situ hybridization, allowing the experimenter to correlate patterns of calcium activity with gene expression profiles on a single-cell level.

סידן פלואורסצנטי הדמיה ובעקבות היברידיזציה באתרו לאפיון עצבי בלתי מבשר בקספוס זריזה

Spontaneous intracellular calcium activity can be observed in a variety of cell types and is proposed to play critical roles in a variety of physiological ...

Developmental Biology

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place over the next 5 years. For example, the sequencing of the genomes for 15 malaria mosquitospecies is currently being done using an Illumina platform3,4. This Anopheles species cluster includes both vectors and non-vectors of malaria. When the genome assemblies become available, researchers will have the unique opportunity to perform comparative analysis for inferring evolutionary changes relevant to vector ability. However, it has proven difficult to use next-generation sequencing reads to generate high-quality de novo genome assemblies5. Moreover, the existing genome assemblies for Anopheles gambiae, although obtained using the Sanger method, are gapped or fragmented4,6.
Success of comparative genomic analyses will be limited if researchers deal with numerous sequencing contigs, rather than with chromosome-based genome assemblies. Fragmented, unmapped sequences create problems for genomic analyses because: (i) unidentified gaps cause incorrect or incomplete annotation of genomic sequences; (ii) unmapped sequences lead to confusion between paralogous genes and genes from different haplotypes; and (iii) the lack of chromosome assignment and orientation of the sequencing contigs does not allow for reconstructing rearrangement phylogeny and studying chromosome evolution. Developing high-resolution physical maps for species with newly sequenced genomes is a timely and cost-effective investment that will facilitate genome annotation, evolutionary analysis, and re-sequencing of individual genomes from natural populations7,8.
Here, we present innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization (FISH), and imaging that facilitate rapid development of physical maps. Using An. gambiae as an example, we demonstrate that the development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies and, thus, the quality of genomic analyses. First, we use a high-pressure method to prepare polytene chromosome spreads. This method, originally developed for Drosophila9, allows the user to visualize more details on chromosomes than the regular squashing technique10. Second, a fully automated, front-end system for FISH is used for high-throughput physical genome mapping. The automated slide staining system runs multiple assays simultaneously and dramatically reduces hands-on time11. Third, an automatic fluorescent imaging system, which includes a motorized slide stage, automatically scans and photographs labeled chromosomes after FISH12. This system is especially useful for identifying and visualizing multiple chromosomal plates on the same slide. In addition, the scanning process captures a more uniform FISH result. Overall, the automated high-throughput physical mapping protocol is more efficient than a standard manual protocol.

High-throughput Physical Mapping of Chromosomes using Automated in situ Hybridization

Genome assemblies based on massively parallel DNA sequencing technologies are usually highly fragmented. The development of physical chromosome maps can potentially improve genome assemblies. Here, we demonstrate innovative approaches to chromosome preparation, fluorescent in situ hybridization, and imaging that significantly increase throughput of the physical map development.

תפוקה גבוהה מיפוי פיזי של הכרומוזומים באמצעות אוטומטי<em&gt; באתרו</em&gt; הכלאה

Projects to obtain whole-genome sequences for 10,000 vertebrate species1 and for 5,000 insect and related arthropod species2 are expected to take place ...

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The specification of replication timing is thought to be a dynamic process regulated by tissue-specific and developmental cues that are responsive to epigenetic modifications. However, the mechanisms regulating where and when DNA replication initiates along chromosomes remains poorly understood. Homologous chromosomes usually replicate synchronously, however there are notable exceptions to this rule. For example, in female mammalian cells one of the two X chromosomes becomes late replicating through a process known as X inactivation1. Along with this delay in replication timing, estimated to be 2-3 hr, the majority of genes become transcriptionally silenced on one X chromosome. In addition, a discrete cis-acting locus, known as the X inactivation center, regulates this X inactivation process, including the induction of delayed replication timing on the entire inactive X chromosome. In addition, certain chromosome rearrangements found in cancer cells and in cells exposed to ionizing radiation display a significant delay in replication timing of &gt;3 hours that affects the entire chromosome2,3. Recent work from our lab indicates that disruption of discrete cis-acting autosomal loci result in an extremely late replicating phenotype that affects the entire chromosome4. Additional 'chromosome engineering' studies indicate that certain chromosome rearrangements affecting many different chromosomes result in this abnormal replication-timing phenotype, suggesting that all mammalian chromosomes contain discrete cis-acting loci that control proper replication timing of individual chromosomes5.
Here, we present a method for the quantitative analysis of chromosome replication timing combined with fluorescent in situ hybridization. This method allows for a direct comparison of replication timing between homologous chromosomes within the same cell, and was adapted from6. In addition, this method allows for the unambiguous identification of chromosomal rearrangements that correlate with changes in replication timing that affect the entire chromosome. This method has advantages over recently developed high throughput micro-array or sequencing protocols that cannot distinguish between homologous alleles present on rearranged and un-rearranged chromosomes. In addition, because the method described here evaluates single cells, it can detect changes in chromosome replication timing on chromosomal rearrangements that are present in only a fraction of the cells in a population.

Chromosome Replicating Timing Combined with Fluorescent In situ Hybridization

A quantitative method for the analysis of chromosome replication timing is described. The method utilizes BrdU incorporation in combination with fluorescent in situ hybridization (FISH) to assess replication timing of mammalian chromosomes. This technique allows for the direct comparison of rearranged and un-rearranged chromosomes within the same cell.

עיתוי מעתיק כרומוזום בשילוב עם פלורסנט<em&gt; באתר</em&gt; הכלאה

Mammalian DNA replication initiates at multiple sites along chromosomes at different times during S phase, following a temporal replication program. The ...

Combined Immunofluorescence and DNA FISH on 3D-preserved Interphase Nuclei to Study Changes in 3D Nuclear Organization

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA FISH) represents the most direct way to visualize the location of gene loci, chromosomal sub-regions or entire territories in individual cells. This type of analysis provides insight into the global architecture of the nucleus as well as the behavior of specific genomic loci and regions within the nuclear space. Immunofluorescence, on the other hand, permits the detection of nuclear proteins (modified histones, histone variants and modifiers, transcription machinery and factors, nuclear sub-compartments, etc). The major challenge in combining immunofluorescence and 3D DNA FISH is, on the one hand to preserve the epitope detected by the antibody as well as the 3D architecture of the nucleus, and on the other hand, to allow the penetration of the DNA probe to detect gene loci or chromosome territories 1-5. Here we provide a protocol that combines visualization of chromatin modifications with genomic loci in 3D preserved nuclei.

Here we describe a protocol for simultaneous detection of histone modifications by immunofluorescence and DNA sequences by DNA FISH followed by 3D microscopy and analyses (3D immuno-DNA FISH).

Immunofluorescence שילוב ודגי DNA על 3D-השתמרו גרעיני Interphase לחקר שינויים בארגון גרעיני 3D

Fluorescent in situ hybridization using DNA probes  on 3-dimensionally preserved nuclei followed by 3D confocal microscopy (3D DNA  FISH) represents the ...

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

3D DNA FISH has become a major tool for analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations of the technique have been published. In this article we describe a protocol which has been optimized for robustness, reproducibility, and ease of use. Brightly fluorescent directly labeled probes are generated by nick-translation with amino-allyldUTP followed by chemical coupling of the dye. 3D DNA FISH is performed using a freeze-thaw step for cell permeabilization and a heating step for simultaneous denaturation of probe and nuclear DNA. The protocol is applicable to a range of cell types and a variety of probes (BACs, plasmids, fosmids, or Whole Chromosome Paints) and allows for high-throughput automated imaging. With this method we routinely investigate nuclear localization of up to three chromosomal regions.

We describe a robust and versatile protocol for analyzing nuclear architecture by 3D DNA FISH using directly labeled fluorescent probes.

דגי ה-DNA 3D חזקים באמצעות בדיקות שכותרתו ישירות

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

Fluorescence In Situ Hybridization on DNA Halo Preparations to Reveal Whole Chromosomes, Telomeres and Gene Loci

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These structures are collectively known as the nucleoskeleton and include the nuclear lamina, the nucleoli, and nuclear bodies. Although many variants of fluorescence in situ hybridization (FISH) exist to study the genome and its organization, these are often limited by resolution and provide insufficient information on the genome&#39;s association with nuclear structures. The DNA halo method uses high salt concentrations and nonionic detergents to generate DNA loops that remain anchored to structures within nuclei through attachment regions within the genome. Here, soluble nuclear proteins, such as histones, lipids, and DNA not tightly bound to the nuclear matrix, are extracted. This leads to the formation of a halo of unattached DNA surrounding a residual nucleus which itself contains DNA closely associated with internal nuclear structures and extraction-resistant proteins. These extended DNA strands enable increased resolution and can facilitate physical mapping. In combination with FISH, this method has the added advantage of studying genomic interactions with all the structures that the genome is anchored by. This technique, termed HALO-FISH, is highly versatile whereby DNA halos can be coupled with nucleic acid probes to reveal gene loci, whole chromosomes, alpha satellite, telomeres and even RNA. This technique provides an insight into nuclear organization and function in normal&#160;cells and in disease progression such as with cancer.

Combining DNA halo preparations with fluorescence in situ hybridization enables high-resolution analysis of genomic interactions with the nucleoskeleton. Attached genome leads to hybridized fluorescent signals located within the residual extracted nuclei, whereas non-attached genome is in the halo of DNA surrounding the residual nuclei.

הכלאה פלואורסצנטית באתרה על תכשירי הילה של DNA לחשיפת כרומוזומים שלמים, טלומרים ומיקומי גנים

The genome is associated with several structures inside cell nuclei, in order to regulate its activity and anchor it in specific locations. These ...

HCR-DNA FISH: A Fluorescence In Situ Hybridization Technique to Detect Viral DNA in Infected Cells

Source: Wei Liu&#160;et al., <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58950"> Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection</a>, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions were subjected to in situ hybridization chain reaction to detect MCPyV specific genomes. Further, the DNA-HCR technique was combined with FISH to visualize the MCPyV DNA in infected human skin cells.

דגי HCR-DNA: טכניקת הכלאה פלואורסצנטית באתרה לזיהוי DNA נגיפי בתאים נגועים

Source: Wei Liu&#160;et al.,  Merkel Cell Polyomavirus Infection and Detection, J. Vis. Exp. (2019).
In this video, the cells infected with MCPyV virions ...

שיטה פשוטה DNA הקרינה

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video