Name: isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine
Uploaded: 2014-10-07T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine at JoVE.com

המחברים מודים ריאן צ&#39;פלין וד&quot;ר גרג Rentfrow של אוניברסיטת קנטאקי המעבדה בשרים והמחלקה לבעלי החיים ומדעי מזון למתן הזדמנויות לאיסוף רקמות ניסיוניות מנוצלות במסמך זה.

נהלים המשמשים במחקר זה לא דורשים אישור מאוניברסיטת קנטאקי טיפול בבעלי חיים ועדת שימוש משום שאין בעלי חיים היו בשימוש. לפני האוסף של כל מדגם המשמש במסמך זה, כל בעלי החיים היו המומים עם בורג בשבי וexsanguinated. זה נערך במתקן בית מטבחיים בדק פדרלי באוניברסיטת קנטאקי. נציג רשמי של משרד החקלאות האמריקאי בטיחות מזון ופיקוח השירות נצפה כל הפעילויות שעסקו בבעלי החיים וטיפול בשידור חי של הפגר. .1 הכנת מכשור <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי למזער את כמות הזמן בין האוספים של דגימות רקמה לתחילת ניסוי, להגדיר את הציוד ולהכין מאגרים לפני איסוף רקמות ניסיוניות (או אם אנשים נוספים זמינים, משימות אלה יכולים להתרחש בו זמנית). הערה: זה לא רק מספק את הכמות הגדולה ביותר של זמן שהרקמה נשארת קיימא לבצע ניסויים, אבל חלקניסויים יכולים לרוץ במשך תקופות זמן ארוכות (או יש רצון להשלים ניסויים מרובים ביום), ולכן זה בדרך כלל רצוי להתחיל מוקדם ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יחידת כוח את המחשב קשור, ציוד רכישות נתונים, אמבט מים (לחיץ (ים)) וmyograph (ים). הנח את ציוד הכיול ביחידת myograph (ים) ולהדליק חום myograph (מוגדר מראש כדי 37.5 ° C) ולאפשר יחידות וציוד כיול לחמם למראש טמפרטורות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח קובץ הגדרות תוכנת תרשים שנוצר בעבר על המחשב ולהתחיל לרוץ (אך לא רכישת נתונים). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחמם את הציוד עבור 10 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל לרכוש נתונים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפס כל הערוצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדקו, ולנהל כיול (במידת צורך) על כל ערוץ (4 ערוצים לכל multimyograph) לתקנן את האות החשמלית המסופקת ממתמר הכוח המתאים הקשורים לערוץ זה על כוח 2-g מסופק על ידי משקל מוסמך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הכיול והמרת יחידות הושלמו, לאחסן את כל הנתונים שלאחר מכן כגרם. תשתנה בהתאם מבוסס על רצונות של כל מעבדה נפרדת; הציוד והתוכנה מתירים את השימוש ביחידות אחרות, כגון milliNewtons ווולט. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שקווי הגז ברורים של חסימות ולהדליק אספקת גז (95% O 2/5% CO 2) לmyograph יחידות (ים). ברציפות בגז את כל המאגרים (בתאי myograph) במהלך ההליך כולו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את כל תאי myograph עם 70% אתנול ולספוג עבור 10 דקות, להסיר את אתנול, ולחזור לרגע 10 דקות לספוג. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הסרת אתנול, לשטוף שלוש פעמים עם מים ללא יונים, ואחריו שלוש שטיפות עם חיץ מוכן (ראה סעיף 2 להכנת חיץ), שעזב את התוספת השלישית של חיץ בתאי. הערה: בשלב זה את הציוד יכולה להישאר ללא פעילות במדינה זו עד חיץ ורקמה מוכנה וצוות מוכן להמשיך בexperiment. </li></ol></li></ol> 2 הכנת חוצצים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון חיץ L קרבס-Henseleit 1 לשימוש בתחבורה ועיבוד של דגימות רקמה מנת להגיע לריכוזים סופיים של 11.1 מ&quot;מ D-גלוקוז; 1.2 מ&quot;מ MgSO 4; 1.2 מ&quot;מ KH 2 PO 4; 4.7 מ&quot;מ KCl; 118.1 mM NaCl; 3.4 מ&quot;מ CaCl 2; 24.9 מ&quot;מ NaHCO 3. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים 9.6 גרם של מלחי קרבס לתוך כ 900 מ&quot;ל של מים ללא יונים על צלחת ומערבבים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים במייבש סידן כלוריד 0.373 גרם ואחריו סודיום ביקרבונט 2.1 גרם לכל ליטר של החיץ הרצוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון חיץ גז ל20 דקות עם 95% O CO 2/5% 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר המתה בגז, כדי להתאים את pH 7.05 (סינון של חיץ מגביר pH; pH היעד סופי צריך להיות 7.4) ולהתאים את עוצמת קול עד 1 ל </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סנן לעקר חיץ לחיץ נקי autoclaved 1 ליטר תקשורת בקבוק ולאחסן ב 4 ° C עד מוכן לשימוש. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קרבס-H הנפרדפתרון enseleit חיץ לשימוש בניסויי myograph כמתואר בשלב 2.1 לתחבורה קרבס-Henseleit חיץ עם תרכובות נוספות הנוגעות לניסויי ההתכווצות. הערה: בדרך כלל 2 L יספיק לניסויים מתוארים במאמר זה, אבל זה נפח ייתכן שיהיה צורך מוגבר או מופחת המבוסס על האורך של הניסוי, מספר תאי myograph, והחלפות חיץ מספר (יחסית לתוספות טיפול). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני צעד ההמתה בגז (שלב 2.1.3), להוסיף 9.1 מ&quot;ג (מחיר לליטר של חיץ שמכין) של desipramine-HCl למאגר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון 1.0 מיקרומטר של propranolol-HCl ולהוסיף 1 מ&quot;ל (מחיר לליטר של חיץ שמכין) של פתרון זה לפתרון חיץ קרבס-Henseleit. הפוך חיץ זה ביום של שימוש ולשמור בטמפרטורות myograph הפעלה (טמפרטורה שמניבה טמפרטורת C ° 37.5 בmyograph). הערה: desipramine מתווספת למעכבת את הספיגה החוזרת של המנגנונים האמינים יוגנייםותאפשר סליקה של תוספות ניסיוניות ממאגר הרחצה כלי הדם להתרחש במהירות רבה יותר. התוספת של propranolol מונעת הלא ספציפי מחייב של תרכובות טיפול לβ-adrenergic receptors. </li></ol></li></ol> .3 איסוף והכנה של כלי דם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בהקדם האפשרי, להסיר את מערכת העיכול מהפגר. ברגע שבעלי החיים כבר לא מציג שום רפלקס לא רצוני, להסיר את הראש ולהסתיר ולאחר מכן להעלות את הפגר בצורה אנכית. הסרת הקרביים של מערכת העיכול (ושט אל פי הטבעת) מהפגר צריכה להתבצע על ידי אנשי בית מטבחיים מאושרים (&lt;20 דקות מהזמן של מדהים). הערה: תוך כמה זמן, מוגבל בדרך כלל על ידי המיקום / המתקן שבו מערכת העיכול שנאספה ומנהלי הפעלה סטנדרטיים או נהלי מנדט פדרלי ואחריו את הסגל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברוב המתקנים, לנהל מניפולציות של מערכת העיכולבמיקום נפרד מעיבוד של הפגר שנועד להזין את אספקת מזון. השתמש במיקום סמוך נוח שבו מערכת העיכול ניתן לקחת ופרושה לבדיקה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמערכת העיכול פרושה, לזהות את המעי הדק, פי ileocecal חיבור המעי הדק לcecum, ומקורבות ileal הארכה הפרוקסימלי לחיק ileocecal (איור 1 א). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות אזמל או סכין, מאוד קל לעשות חתך בקרום mesenteric במרכז אוגן ileal. באמצעות שתי אצבעות מורות, בבוטות לנתח את רקמת השומן וחיבור החושפת את כלי דם mesenteric (איור 1). </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאוגן או בליטה זו בלפדר המעיים, לנתח את ענפים מרובים (~ 2 סנטימטר אורך) של חבילות עורק ווריד mesenteric החשופות התומכות בחלק זה של המעי (איור 1 ג). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם uלשיר במלקחיים כדי לתפוס רקמות, לדאוג שלא לתפוס באופן ישיר או למשוך את כלי דם בכל עת הסרתם ככל סוג של מתיחה יכול לגרום נזק ובאופן שלילי משפיע ביצועי רקמה 14. הסרת כלי דם נעשית הטובה ביותר, על ידי חיתוך על פני כל קצה של הקטע שיש להסיר ולאחר מכן חיתוך לצד או במקביל לסעיף עכשיו מבודד. על מנת להקל, להסיר חלק מהרקמה הסובבת יחד עם כלי לספק כמה רקמה לתפוס עם זוג המלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם זוג המלקחיים, לצלול דגימת רקמה בצינור המכיל חיץ קרבס-Henseleit קרח קר ולאחסן על קרח עד עיבוד יכול להתרחש במעבדה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח דגימת רקמה על משטח חיתוך או בצלחת פטרי ובחלקו לצלול בקרח קר קרבס-Henseleit. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת 5 מלקחיים תכשיטנים #, איריס מספריים נויס, ומגדלת מנורה או לנתח היקף (2.5 להגדלת 5.0x היא מספיק), לנתח בזהירות את connecti השומן והסביבהve רקמות ולהפריד בין העורק לוריד. זיהוי פתיחת הכלי בקצה אחד של הקטע ולתפוס את fascia המקיף את הכלי עם המלקחיים בזהירות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעשות חתך עם המספריים במקביל לספינה על ידי הזזה קצה המספריים מתחת fascia העלה. לאחר החתך הראשוני, השומן ורקמות חיבור יכולים להיות מנותקות עוד יותר מהספינה על ידי גדיעה כל צד עם המספריים. ודא שהכולים הם נקיים ככל האפשר, תוך מזעור כמות זמן כלי מבלים על הספסל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור כלי דם לצינורות של חיץ קרבס-Henseleit הטרי ולאחסן ב 4 ° C (דגימות יכולות להישאר לאחסן עד 24 שעות לאחר איסוף ועדיין לייצר נתונים התכווצות בתוקף). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות סכין גילוח, כלי פרוס לשימוש בmyograph למספר רצוי של סעיפי 2 מ&quot;מ (כדאי להשתמש מבצעה רקמה להשיג חתכים עולים בקנה אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבחון כל סעיף תחת SCO לנתחPE (הגדלה 12.5X) כדי להבטיח כי לכל סעיף לא חריג, סניפים, שסתומים, או נזק שטחי בטעות שנעשה במהלך נתיחה וניקוי. החלף את סעיף הכלי אם יש חריגות, סניף, שסתום, או נזק שטחי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי חנות מקובלים פרוסים כלי (שקועים בחיץ קרבס-Henseleit) על קרח או על 4 מעלות צלזיוס עד מוכן להרכבה בתאי myograph (בדרך כלל &lt;30 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות לעלות על כלי השיט בmyograph ידי ההכנסה תומכת בלום ולהגדיל את המתח (באמצעות micropositioner על myograph) להיות זהיר, כדי לא למתוח את כלי מעל קריאת 2 עד 3 גרם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שכל התאים מכוסים, לשאוב חיץ מכל התאים ולמלא עם 5.0 מ&quot;ל של חיץ ולהתחיל טיימר 15 דקות כדי להתחיל את תקופת האיזון והניסוי. </li></ol> ניסוי .4 <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאזן את כל חלקי הספינה ל1.5 שעות כדי להשיג מיל יציבמתח טינג של 1.0 גרם. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את חיץ הדגירה קרבס-Henseleit כל 15 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך האיזון, כל הזמן להתאים את המתח בחלקי כלי דם עד 2 גרם ולאחר מכן לאפשר להירגע עד כ 0.80 גרם. נסה שלא לאפשר כלי להירגע יותר מדי (הם עשויים לשמוט את mounts). נסה להשיג מתח בסיס יציב, שבו הכלי מחזיק מתח 1 גרם ללא צורך בהתאמה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך האיזון, להכין 1.32 M תמיסה מימית של KCl כדי לשמש כנקודת התייחסות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות השלמת איזון משביע רצון, להוסיף 500 μl של פתרון M KCl 1.32 להביא לפתרון 0.12 M בפתרון 5.5 מ&quot;ל רחצה הכלי. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות התוספת של 1.32 M KCl, לא להתאים את המתח באופן ידני כתגובה המקסימלי מתוספת זו משמשת להערכת כדאיות רקמות והוא יכול לשמש כדי לנרמל נתונים טיפול (לדוגמא תגובות ריכוז לgonist). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החלף את החיץ במרווחי 15 דקות, עד המתח חזר לערך הבסיסי של 1.0 גרם. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע שמגיעה נקודת ההתחלה, לשנות את החיץ ובו זמנית להתחיל טיימר 1 דקות. האם זה עבור כל התאים בו זמנית, כדי למנוע מדהים של זמני הפעלה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבולת הסטנדרטי שיש להוסיף ולהכין תגובה לקאמרית 1 במהלך הספירה לאחור 1 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף את הסטנדרטים ב25 aliquots μl לכל תא כתכתיבי ניסוי (זה שומר על הטיפול בהמשך 0.5% מהנפח הכולל). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התקן האחרון נוסף, להתחיל טיימר 9 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של הדגירה סטנדרטית 9 דקות, להסיר את החיץ המכיל טיפול מהתאים ולהוסיף 5.0 מ&quot;ל של חיץ טרי, ולהתחיל את הטיימר 2.5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור על שלב 4.4.4. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסופו של שטיפת 2.5 דקות השניה, לשאוב התאים ולהוסיף למאגר טרי, ולהתחיל טיימר 1 דקות לספירה לאחור לתחילת seconבנוסף סטנדרטי ד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמשיך את המעגל הזה לכל תוספות סטנדרטי של היום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במהלך התוספת סטנדרטית הסופית ודגירת 9 דקות לאחר מכן להכין את תרכובת התייחסות M KCl 1.32 לסוף בנוסף מינון התייחסות ריצה של 500 μl. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעקבות מרווח 1 דקות לאחר תוספת הטיפול הסופית, להוסיף KCl ולהתחיל טיימר 9 דקות. הערה: בנוסף KCl הוא לאשר כדאיות רקמות בסיומו של הניסוי ושימושי אם מתן טיפול שגורם לתגובה זניחה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסיומו של הדגירה מתחם התייחסות 9 דקות הסופיות, ואקום או להסיר חיץ מכל התאים. אל תוסיף חיץ טרי. מסקנת הניסוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את קובץ תרשים, להסיר חלקים של כלי דם ולהיפטר כראוי, ולעקוב אחר הפרוטוקול הנקי עד (המסופק על ידי יצרן ויכול להיות ספציפי במעבדה) לציוד myograph. </li></ol>

<ol>
	<li>Matheson, P. J., Wilson, M. A., Garrison, R. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+intestinal+blood+flow.">Regulation of intestinal blood flow.</a> The Journal of surgical research. 93, 182-196 (2000).</li><li>Dobson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Blood+flow+and+absorption+from+the+rumen.">Blood flow and absorption from the rumen.</a> Quarterly journal of experimental physiology. 69, 599-606 (1984).</li><li>Mulvany, M. J., Halpern, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+properties+of+vascular+smooth+muscle+cells+in+situ.">Mechanical properties of vascular smooth muscle cells in situ.</a> Nature. 260, 617-619 (1976).</li><li>Nielsen-Kudsk, F., Poulsen, B., Ryom, C., Nielsen-Kudsk, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+strain-gauge+myograph+for+isometric+measurements+of+tension+in+isolated+small+blood+vessels+and+other+muscle+preparations.">A strain-gauge myograph for isometric measurements of tension in isolated small blood vessels and other muscle preparations.</a> Journal of pharmacological. 16, 215-225 (1986).</li><li>Mulvany, M. J., Aalkjaer, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+and+function+of+small+arteries.">Structure and function of small arteries.</a> Physiological reviews. 70, 921-961 (1990).</li><li>Klotz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Assessment+of+vasoconstrictive+potential+of+D-lysergic+acid+using+an+isolated+bovine+lateral+saphenous+vein+bioassay.">Assessment of vasoconstrictive potential of D-lysergic acid using an isolated bovine lateral saphenous vein bioassay.</a> Journal of animal science. 84, 3167-3175 (2006).</li><li>Klotz, J. L., Bush, L. P., Strickland, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+vascular+contractility+bioassay+using+bovine+right+ruminal+artery+and+vein.">A vascular contractility bioassay using bovine right ruminal artery and vein.</a> Journal of animal science. 89, 1944-1951 (2011).</li><li>Westendorf, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+and+in+vivo+ruminal+and+physiological+responses+to+endophyte-infected+tall+fescue.">In vitro and in vivo ruminal and physiological responses to endophyte-infected tall fescue.</a> Journal of dairy science. 76, 555-563 (1993).</li><li>Strickland, J. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Board-invited+review:+St.+Anthony&amp;#34;s+Fire+in+livestock:+causes,+mechanisms,+and+potential+solutions.">Board-invited review: St. Anthony&amp;#34;s Fire in livestock: causes, mechanisms, and potential solutions.</a> Journal of animal science. 89, 1603-1626 (2011).</li><li>Eckert, H., Kiechel, J. R., Rosenthaler, J., Schmidt, R., Schreier, E., B, B. e. r. d. e., HO, S. c. h. i. l. d. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+11.">Ch. 11.</a> Ergot Alkaloids and Related Compounds. , (1978).</li><li>Rhodes, M. T., Paterson, J. A., Kerley, M. S., Garner, H. E., Laughlin, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reduced+blood+flow+to+peripheral+and+core+body+tissues+in+sheep+and+cattle+induced+by+endophyte-infected+tall+fescue.">Reduced blood flow to peripheral and core body tissues in sheep and cattle induced by endophyte-infected tall fescue.</a> Journal of animal science. 69, 2033-2043 (1991).</li><li>Foote, A. P., Harmon, D. L., Strickland, J. R., Bush, L. P., Klotz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+ergot+alkaloids+on+contractility+of+bovine+right+ruminal+artery+and+vein.">Effect of ergot alkaloids on contractility of bovine right ruminal artery and vein.</a> Journal of animal science. 89, 2944-2949 (2011).</li><li>Foote, A. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ergot+alkaloids+from+endophyte-infected+tall+fescue+decrease+reticuloruminal+epithelial+blood+flow+and+volatile+fatty+acid+absorption+from+the+washed+reticulorumen.">Ergot alkaloids from endophyte-infected tall fescue decrease reticuloruminal epithelial blood flow and volatile fatty acid absorption from the washed reticulorumen.</a> Journal of animal science. 91, 5366-5378 (2013).</li><li>Hocking, K. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detrimental+effects+of+mechanical+stretch+on+smooth+muscle+function+in+saphenous+veins.">Detrimental effects of mechanical stretch on smooth muscle function in saphenous veins.</a> Journal of vascular surgery. 53, 454-460 (2011).</li><li>Smith, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bovine+intestinal+surgery.">Bovine intestinal surgery.</a> Modern veterinary practice. 65, 705-710 (1984).</li><li>Budras, K. D., Habel, R. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bovine Anatomy An Illustrated Text. , (2003).</li><li>Klotz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antagonism+of+lateral+saphenous+vein+serotonin+receptors+from+steers+grazing+endophyte-free,+wild-type,+or+novel+endophyte-infected+tall+fescue.">Antagonism of lateral saphenous vein serotonin receptors from steers grazing endophyte-free, wild-type, or novel endophyte-infected tall fescue.</a> Journal of animal science. 91, 4492-4500 (2013).</li><li>Egert, A. M., Kim, D. H., Schrick, F. N., Harmon, D. L., Klotz, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+exposure+to+ergot+alkaloids+decreases+contractility+of+bovine+mesenteric+vasculature.">Dietary exposure to ergot alkaloids decreases contractility of bovine mesenteric vasculature.</a> Journal of animal science. 92, 1768-1779 (2014).</li></ol>

אזכור של שם המסחרי, מוצר קנייני, או ציוד שצוין אינו מהווה ערובה או אחריות על ידי משרד החקלאות ואינו מעיד על אישור להרחקה של מוצרים אחרים שעשויה להיות זמין.

האתגר הראשוני בפיתוח של המבדק זה היה הקמתו של אתר אוסף הדיר לכלי דם mesenteric. עקביות אתר מדגם היא קריטית, כחלק מהפונקציות של שינוי המעי הדק במהלך ההתקדמות מהמעי הריק דרך המעי וכתוצאה מכך לפדר להשתנות בדפוס דומה. סניפי ileal של עורק ווריד mesenteric היו הכי מזוהה באמצעות ציוני דרך אנטומיים בקלות. על ידי איתור cecum והבא של פי ileocecal לתחנה הסופי שלה בצד השמאל של לפדר, זה ליד הסיום של עורק mesenteric גולגולת 15. האזור של לפדר ארוך יותר (המכונה מקורבות) ואת הסיומת של קפל ileocecal (ייחודית לבעלי חי שור) 16 דגימה שנעשתה על פני מספר רב של בעלי חיים מאוד הדיר. אחד החסרונות הגדולים יותר שניתן לעשות הוא בשלב זה של המבדק. יש מתיחה מכאנית השפעה שלילית גדולה על p כלי שלאחר מכןerformance 14 והחוקר להבחין כי כלי שיט שהם מוגזמים מניפולציות או מתוח במהלך ההסרה וניקוי שלאחר מכן לא יגיבו לשימוש במתחם ההתייחסות. זה למרבה הצער הוא הדרך היחידה באמת להעריך את האיכות של הכנת כלי הדם ברמה וכלי שיט שאינו מגיבים לKCl לא צריך להיחשב עוד לדור של נתונים אמינות פונקציונליות. שני שלבי אימות שיטה אחרים (לא מוצג) שהובילו לשיטה הסופית המוצגת כאן היו שימוש בכימיקלים אחרים כתרכובות התייחסות ובדיקת הכדאיות של כלי הדם הבא 24 אחסון שעה. נוראפינפרין וסרוטונין הוערכו כתרכובות התייחסות, אבל תגובות של העורק ווריד mesenteric היו משתנים מדי על פני סוג כלי ועל פני בעלי חיים להם לשמש בהצלחה. לעומת זאת, התוספת של 120 מ&quot;מ KCl הביאה תגובה מאוד לשחזור פני שני הכנות העורק ווריד.סימפוני, תגובות עורק והווריד הוערכו היום של איסוף וההערכה מחודשת 24 הודעה שעה איסוף ולא היו הבדלים בתגובה אגוניסט או על ידי העורק או הווריד. זה היה היבט חשוב של המבדק, כפי שיש לעתים קרובות מספר גדול של טיפולים (או שילובי טיפול שונים) שניתן ליישם, אך חוקרים מוגבלים על ידי המרחב בmyograph והזמן. על ידי הארכת תקופת הכדאיות החוצה 24 שעות מאוסף, הזמן לניסויים נוספים הוא גדל מאוד. זה חשוב לחוקר להבין את הגמישות של מבנה הטיפול מיושם על המבדק זה. חוקר יכול להוסיף כל מתחם למאגר הדגירה שהוא או היא מעוניין בחשיפה כרונית של כלי הדם לכדי לשלוט משהו רלוונטי ביולוגי או כטיפול (במקרה של et al קלוץ. 17, זה נעשה עם ורידי saphenous רוחב נחשפו ברציפות לKEtanserin, שקומם קולט סרוטונין של ריבית). כלי דם mesenteric יכולים להיות pretreated עם תרכובת של עניין לפני ביצוע ניסוי תגובת התכווצות. המבדק, כפי שהוצג, נועד לנהל ניסוי תגובת ריכוז מצטבר מסתכל על אלקלואידים ergot כאגוניסטים והאם חשיפה תזונתית לפני אלקלואידים ergot השפיעו על התגובה של כלי דם 18. תוצאות הנציג מראות כי שיטה זו יכולה לייצר תגובה של כלי דם למדידה ורק ארבעה ריכוזים שמשו כדי להשיג זאת. במקרה של אגרט et al. 18, היו עד 10 ריכוזים שונים המשמשים לבניית עקומת תגובה. שיטה זו היא דרך להעריך מספר גדול של תרכובות או קולטנים על כלי דם שונים מבעלי חיים יחידים בחלון קטן של זמן.

שינויים בזרימת דם למיטת רקמה יכולים להיות השפעה גדולה על תפקוד איבר. תפקידו עיקרי של המעי הדק הוא מזין קליטה. זרימת דם העורקי למשטח הקליטה של המעי נדרש לעליית קליטה וזרימת דם מזינה כדי לסייע בקליטת חומרים מזינים כמו digesta נע לאורך המשטח 1. ירידה בזרימת דם יכולה לגרום לירידה בספיגת חומרי מזון בשל ירידה בשיפוע transepithelial 2. בנוסף לחומרים מזינים, המעי הדק יכול גם להיות חשוף למטבוליטים משניים, תרופות, או רעלים שיפעילו השפעה על זרימת דם מקומי בלפדר. במקרה של החיים מעלה הגירה, יכולות להיות משוחררות תרכובות מfeedstuff (למשל, חומרים מזינים כגון חומצות אמינו, או רעלים כגון אלקלואידים ergot) באמצעות תהליכי תסיסה של המעי הקדמי. אם תרכובות אלו לשרוד את חילוף החומרים של חיידקים תסיסה בכרס, הם זמינים כעת לקליטהאו אינטראקציה כשהם נוסעים דרך מערכת העיכול של בעלי החיים. ישנן מספר השיטות שונות זמין כדי למדוד את זרימת דם בגוף חי (למשל, אולטראסאונד דופלר, שכינת מדידת תצרוכת דם, microspheres radiolabeled, וטכניקות מחוון דילול) שתאפשר הערכה של תרחישים ניסיוניים שונים או טיפולים. עם זאת, כדי להשיג מידע לגבי התכונות מכאניות או תרופתית של שריר חלק בכלי הדם, שיטות נותרת מוגבלות לכלי גדול עד Mulvany והלפרן 3 פרסמו מאמר המתאר את הטכניקה באמצעות חוט רכוב הכנות טבעת כלי דם בmyograph. מאז הפיתוח של טכניקה זו, שינויים ימשיכו להתבצע למערכות myograph הקשורות המאפשרות מגוון רחב של יישומים שונים להערכת מבנים צינוריים. המערכת גם הותאמה לנצל מוטות קבועות להרכבת כלי גדול יותר 4 שבו זלוףטכניקות לא רצויים. בגלל השוני בכלי ממקורות שונים אנטומיים והבחנות באותו כלי ממינים שונים של בעלי חיים, נתונים מכלי שיט והסוג של בעלי חיים לא יכול בקלות להיות אקסטרפולציה על פני כלי שונים או אותו כלי השיט בסוגים שונים של בעלי חיים 5. כתוצאה מכך, bioassays הנפרד חייב להיות מפותח ומאומתים בכל עת היבטים אלה השתנו. לאחרונה כמה bioassays פותחו עם טכנולוגיות אלה לשימוש בבקר לרוחב וריד saphenous ועורק כרס תקין ווריד 6,7. המבדק זה פותח כדי לחקור באופן ספציפי את ההשפעות שיש לי אלקלואידים ergot על כלי דם התומכים במעי הדק. נמסר כי 50-60% מאלקלואידים האכילו מופיעים בתוכן abomasal, אבל רק 5% הם התאוששו בצואת 8. סטריקלנד et al. 9 האמור בסקירה של אלקלואידים ergot, שsugg נתונים זמיןבהערכה שהמעי דקה עשויה להיות האתר החשוב ביותר לקליטת ergopeptine. אקרט et al. 10 היבטים ביולוגיים בביקורת של אלקלואידים ergot וקבע כי ברגע שהם חוצים את מחסום האפיתל, אלקלואידים ergot מועברים גם על ידי מערכת הלימפה לוריד subclavian או באמצעות וריד mesenteric ולדם פורטל. רודוס et al. 11 דיווח על ירידה בזרימת דם לתריסריון ומעי גס בפרים רב דיאטה עתירת נגוע endophyte (אלקלואיד ergot הגבוה). באמצעות המבדק עורק ווריד הכרס תקין, פוט et al. 12 הוכיחו כי אלקלואידים ergot הם vasoactive בכלי דם בכרס. פוט et al. 13 הפגינו לאחר מכן in vivo כי חשיפת כרס לתוצאות אלקלואידים ergot בזרימה דם אפיתל כרס פנימית ירד. ירידה בזרימת דם אל פני השטח הקליטה של ​​הכרס הפנימי זו בו זמנית, גרמה לירידה במזין שטף (חומצת שומן נדיפות). בהתחשב quantity של אלקלואידים ergot מעבירים למעי הדק מהמעי הקדמי; זה היה שיערו כי השפעה דומה על מערכת כלי דם של מעי דק ומזין קליטה תתרחש. הדבר זה הצריך את הפיתוח של המבדק ileal הפרוקסימלי שור עורק mesenteric ווריד.

<table><tbody><tr><td>Multi Myograph</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>610M</td><td>A myograph is critical to this bioassay, but there are other platforms available for use that will suffice.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>Powerlab 8/sp</td><td>ADIntruments</td><td>ML785</td><td></td></tr><tr><td>LabChart 7</td><td>ADInstruments</td><td>Version 7</td><td></td></tr><tr><td>Force Calibration Kit</td><td>Danish Myo Technologies</td><td>100055</td><td>Specific to DMT myographs</td></tr><tr><td>Bottle-top Filter</td><td>Nalgene</td><td>595-4520</td><td>0.22 &amp;#956;m pore size; 45 mm neck size</td></tr><tr><td>#5 Jewler&amp;rsquo;s Forceps</td><td>Miltex</td><td>555008FT</td><td>Any brand of forceps can be used</td></tr><tr><td>Noyes Iris Scissors</td><td>Miltex</td><td>18-1510</td><td>Any brand of scissors can be used</td></tr><tr><td>Dissecting Scope</td><td>Zeiss</td><td>Stemi 2000-C</td><td>Any brand of dissecting light microscope will suffice</td></tr><tr><td>Adjustable Tissue Matrice</td><td>Braintree Scientific</td><td>TM C12</td><td>This is not critical to the assay, but greatly reduces section to section variation in length and speeds up the slicing process greatly</td></tr><tr><td>Krebs-Hensleit Buffer</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>K3753-10x1L</td><td>It is not necessary to buy Krebs, this can be made in house</td></tr><tr><td>Calcium chloride dehydrate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C7902-500G</td><td></td></tr><tr><td>Sodium bicarbonate</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S5761-500G</td><td></td></tr><tr><td>Desipramine-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D3900-5G</td><td></td></tr><tr><td>Propranolol-HCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0884-1G</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>95% O&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;/5% CO&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Scott Gross</td><td>UN3156</td><td></td></tr></tbody></table>

isolating and using sections of bovine mesenteric artery and vein as a bioassay to test for vasoactivity in the small intestine

מערכות עיכול של יונקים כל הזמן נחשפות לתרכובות (רצויות ולא רצויים), כי יכולה להיות השפעה על זרימת דם ומהמערכת ש. שינויים בזרימת דם למעי דק עלולים לגרום להשפעות על פונקציות הקליטה של ​​האיבר. עניין מיוחד ברעלים שוחררו ממספוא באמצעות תהליכי תסיסה ועיכול פיתח במעלי גירה כאזור שבו אפשר לשפר את היעילות יצרנית. הווידאו הקשורים במאמר זה מתאר המבדק במבחנה פותח לתרכובות מסך לvasoactivity בחתכים מבודדים של עורק mesenteric שור והווריד באמצעות multimyograph. ברגע שכלי הדם הם רכובים וequilibrated בmyograph, המבדק עצמו יכול להיות בשימוש: ככלי מיון כדי להעריך את תגובת ההתכווצות או vasoactivity של תרכובות של עניין; לקבוע את הנוכחות של סוגי קולט ידי פרמקולוגית מיקוד קולטנים עם אגוניסט הספציפיים; לקבוע את תפקידו של קולטן עם הנוכחות של יריבים אחד או יותר; או לקבוע אינטראקציות פוטנציאליות של תרכובות של עניין עם יריבים. דרך כל זה, הנתונים נאספים בזמן אמת, רקמה שנאספו מבעלי חיים יחידים יכולה להיות חשופה למספר רב של טיפולים ניסיוניים שונים (יתרון במבחנה), ומייצגת את כלי דם בכל צד של מיטת הנימים לספק מדויק תמונה של מה שיכול להיות שזה קורה באספקת הדם מביא וefferent תמיכה המעי הדק.

כלי הדם המשמשים לייצור התוצאות כללו נאספו מ6 שוורי הולשטיין (425 קילוגרם ± 8) בתוך מרווח 3 שבוע. דוגמא לתגובה התכווצות וריד mesenteric האופייני לKCl ותוספות טיפול ההולך וגוברות בריכוז מוצגת באיור 2. סדר הגודל של תגובה ישתנה חלקם עם הגודל של כלי השיט (מתואם עם הגודל של החיה התורם), אבל גם יכולה להיות מושפע (לרעה) מטיפול לא נכון (מתיחה) של כלי במהלך איסוף וניקוי. לכן, חשוב לבחון את תגובת התכווצות משמעותית בחשיפת כלי לKCl. אם תגובה זניחה הוא ציין בשלב זה, זה לא מומלץ להמשיך הלאה להליך עם כלי ש. כפי שניתן לראות בתקופות הדגירה 9 דקות באיור 2, יש עליות מצטברות בתגובה, כי להתכתב עם ריכוזים הולכים וגדל. למרות שרצוי לpartic זהעיצוב ניסיוני ular, זה לא תמיד מתרחש או להיות מבוקש עם טיפולים אחרים. בנוסף KCl בסיומו של הניסוי, אם כי לא נעשה שימוש בעיבוד של הנתונים שנאסף, הוא מאוד חשוב כמו זה מאשר את הכדאיות של הרקמות בסיומה של תקופת הניסוי (הופך להיות חשוב יותר אם הכלי אינו מגיב לכל תוספות הטיפול). הנתונים מוצגים באיור 2 נרשמים בגרם של מתח. חשוב לנרמל את הנתונים הללו כדי למזער כל בעל חיים לבעלי חיים ווריאצית כלי לכלי. כך, בנוסף להיות משמש כמדד ליכולת קיום, תגובת KCl המרבית משמשת לנרמל את כל תוספות הטיפול. זה מייצר נתונים תגובת התכווצות כאחוז ממקסימום KCl. כך עקומות עורק ווריד mesenteric תגובה לריכוז גובר של 5-hydroxytryptamine (סרוטונין; איור 3) ונוראפינפרין ( <strאונג&gt; איור 4) מוצגים. הנתונים בנתונים אלה היו עקום תגובת ריכוז sigmoidal כושר באמצעות רגרסיה שאינה ליניארי. תגובת וריד mesenteric לשניהם 5-hydroxytryptamine (איור 3) ונוראפינפרין (איור 4) החלה את דרכו ערכים שליליים. זו היא תוצאה של תיקון המתח המרבי שנרשם במהלך כל תקופת דגירה 9 דקות על ידי המתח הבסיסי שנרשם לפני בנוסף KCl הראשוני. תיקון בסיס זה מבטיח שכל הבדלים קלים במתח אינם כלולים בניתוחים ולאפשר הנתונים שהוצגו על מנת לשקף רק שינוי במתח. תוצאות הערך השליליות מכלי הדם מרגיעים ושחרור מתחת לרמות בסיס טרום KCl לפני תוספת טיפול שלאחר מכן. זה נפוץ במיוחד בדגימות ורידים שבו הריכוזים הראשוניים של הטיפול או אגוניסט נמוכים מדי כדי לגרום תגובת התכווצות. זה לא היה במקרה שלי<html> תגובת עורק senteric לאו אמין יוגניים, אשר החזיק מתח מעל הבסיס עד הספינה החלה להגיב לטיפול שנוספו. הבדל זה מדגים את ההבדלים בכלי משני צדי מיטת נימים ולמה שניהם נחשבים כחלק ממבדק זה. המבדק זה יכול לשמש כדי להעריך vasoactivity של תרכובות על כלי דם המספקים חומרים מזינים למעי הדק, כמו גם כלי דם שנשאו חומרים מזינים נספגים מהמעי הדק. הנתונים באיורים 3 ו 4 הם דוגמאות פשוטות של איך זה יכול להיות מושלם. במקרה של 5-hydroxytryptamine (איור 3), שלא היה הבדל בעורקים או תגובת התכווצות ורידים. לעומת זאת, תגובת ההתכווצות ידי וריד mesenteric לגידול בריכוזי של נוראפינפרין הייתה גדולה יותר מזה של עורק mesenteric. תרשים 1 &quot;FO: תוכן width =&quot; &quot;src =&quot; 3in / קבצים / ftp_upload / 52020 / &quot;width =&quot; 52020fig1highres.jpg 300 &quot;/&gt; איור 1:. דוגמא של מערכת עיכול שור משמשת כמקור של כלי דם mesenteric הכוכבית האדומה מציינת את החלק הגלוי של קפל ileocecal בכל שלוש השמשות כנקודת התייחסות. מערכת כולה עם סגלגל האדום המציינים את מקורבות ileal בי דגימה של כלי דם התרחשה (). חשיפה (B) של מיטת כלי דם mesenteric. מספריים (C) איריס והצביעו לעבר סניף חשוף של וריד mesenteric (גלוי) ועורק (לא נראה לעין) רק לפני האוסף. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52020/52020fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2: דוגמא לתגובת ריכוז של וריד mesenteric לריכוזים הולכים וגדל של נוראפינפרין (1 × 10 -7 עד 1× 10 -4 M). אירועים הגדולים בהתחלה ואת הסוף של העקבות הם תגובות ל0.12 נוספה M KCl. המלבן האדום מסמן את אזור איסוף הנתונים המתאימים עם תקופת הדגירה 9 דקות לכל תוספת טיפול. הקוצים 3 הדקים שמעקב זה הם חפצים שנוצרו על ידי החלפת החיץ ואינם נכללים בניתוח. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/52020/52020fig2highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52020/52020fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3: ממוצע תגובות התכווצות של עורק mesenteric (MA) ווריד (MV, n = 6 שוורים) לריכוזים הולכים וגדל של 5-hydroxytryptamine (סרוטונין) קווים הראו היו שנוצרו באמצעות ניתוח רגרסיה שאינו ליניארי כדי להתאים את הנתונים לsigmoidal. r ריכוזעקומת esponse אשר ניצלה את המשוואה הבאה: y = תחתון + [(למעלה - למטה) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], שבו חלק העליון ותחתון הם אחוז 120 תגובת התכווצות המרבית מ&quot;מ KCl במישורים, ו50 EC הוא הריכוז טוחנת של אלקלואיד הפקת 50% מהתגובה המרבית KCl. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/52020/52020fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4: ממוצע תגובות התכווצות של עורק mesenteric (MA) ווריד (MV, n = 6 שוורים) לגידול בריכוזי של נוראפינפרין קווים הראו היו שנוצרו באמצעות ניתוח רגרסיה שאינו ליניארי כדי להתאים את הנתונים לעקומת תגובת ריכוז sigmoidal שנוצלה. המשוואה הבאה: + y = התחתון [(למעלה - למטה) / (1 ​​+ 10 (logEC 50 - x))], שבו חלק העליון ותחתון הם אחוז 120 מ&quot;מ KCl המרבי גontractile תגובה במישורים, ו50 EC הוא הריכוז טוחנת של אלקלואיד הפקת 50% מהתגובה המרבית KCl.

Watch this Scientific Journal Video about Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine at JoVE.com

Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

המעי הדק הוא לעתים קרובות נחשף לרעלים שיכולים להשפיע על זרימת דם ולהשפיע לרעה על מזין קליטה. שימוש בעורק multimyograph וmesenteric ווריד מבודד, תרכובות או רעלים של עניין יכול להיות מוקרן לvasoactivity.

בידוד ושימוש בסעיפים של עורקי שור mesenteric ווריד כמבדק לבדיקת Vasoactivity במעי הדק

Mammalian gastrointestinal systems are constantly exposed to compounds (desirable and undesirable) that can have an effect on blood flow to and from that ...

isolating-using-sections-bovine-mesenteric-artery-vein-as-bioassay-to

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Medicine

9.6K Views.  USDA-Agricultural Research Service.  המעי הדק הוא לעתים קרובות נחשף לרעלים שיכולים להשפיע על זרימת דם ולהשפיע לרעה על מזין קליטה. שימוש בעורק multimyograph וmesenteric ווריד מבודד, תרכובות או רעלים של עניין יכול להיות מוקרן לvasoactivity. 

Video: Isolating and Using Sections of Bovine Mesenteric Artery and Vein as a Bioassay to Test for Vasoactivity in the Small Intestine

Mesenteric Artery Contraction and Relaxation Studies Using Automated Wire Myography

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between 100-400 &mu;m in diameter function primarily in directing blood flow to various organs according to the overall requirements of the body. The rat mesenteric artery has a diameter greater than 100 &mu;m. The myography technique, first described by Mulvay and Halpern1, was based on the method proposed by Bevan and Osher2. The technique provides information about small vessels under isometric conditions, where substantial shortening of the muscle preparation is prevented. Since force production and sensitivity of vessels to different agonists is dependent on the extent of stretch, according to active tension-length relation, it is essential to conduct contraction studies under isometric conditions to prevent compliance of the mounting wires. Stainless steel wires are preferred to tungsten wires because of oxidation of the latter, which affects recorded responses3.The technique allows for the comparison of agonist-induced contractions of mounted vessels to obtain evidence for normal function of vascular smooth muscle cell receptors.
We have shown in several studies that isolated mesenteric arteries that are contracted with phenylyephrine relax upon addition of cumulative concentrations of extracellular calcium (Ca2+e). The findings led us to conclude that perivascular sensory nerves, which express the G protein-coupled Ca2+-sensing receptor (CaR), mediate this vasorelaxation response. Using an automated wire myography method, we show here that mesenteric arteries from Wistar, Dahl salt-sensitive(DS) and Dahl salt-resistant (DR) rats respond differently to Ca2+e. Tissues from Wistar rats showed higher Ca2+-sensitivity compared to those from DR and DS. Reduced CaR expression in mesenteric arteries from DS rats correlates with reduced Ca2+e-induced relaxation of isolated, pre-contracted arteries. The data suggest that the CaR is required for relaxation of mesenteric arteries under increased adrenergic tone, as occurs in hypertension, and indicate an inherent defect in the CaR signaling pathway in Dahl animals, which is much more severe in DS.
The method is useful in determining vascular reactivity ex vivo in mesenteric resistance arteries and similar small blood vessels and comparisons between different agonists and/or antagonists can be easily and consistently assessed side-by-side6,7,8.

An automated myography method for force measurements in isolated mesenteric arteries is described. It employs a Mulvany-Halpern Auto Dual Wire Myograph 510A to determine responses to phenylephrine and extracellular calcium. The method allows consistent determination of isometric responses to agonists in small vessels of diameters of 60 - 300 &mu;m, independently.

התכווצות העורקים mesenteric ללימודי הרפיה באמצעות Myography בנקאית אוטומטית

Proximal resistance vessels, such as the mesenteric arteries, contribute substantially to the peripheral resistance. These small vessels of between ...

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under physiologic conditions the endothelium is impermeable to albumin, so Evans blue bound albumin remains restricted within blood vessels. In pathologic conditions that promote increased vascular permeability endothelial cells partially lose their close contacts and the endothelium becomes permeable to small proteins such as albumin. This condition allows for extravasation of Evans Blue in tissues. A healthy endothelium prevents extravasation of the dye in the neighboring vascularized tissues. Organs with increased permeability will show significantly increased blue coloration compared to organs with intact endothelium. The level of vascular permeability can be assessed by simple visualization or by quantitative measurement of the dye incorporated per milligram of tissue of control versus experimental animal/tissue. Two powerful aspects of this assay are its simplicity and quantitative characteristics. Evans Blue dye can be extracted from tissues by incubating a specific amount of tissue in formamide. Evans Blue absorbance maximum is at 620 nm and absorbance minimum is at 740 nm. By using a standard curve for Evans Blue, optical density measurements can be converted into milligram dye captured per milligram of tissue. Statistical analysis should be used to assess significant differences in vascular permeability.

An in vivo Assay to Test Blood Vessel Permeability

We are presenting an in vivo assay to test blood vessel permeability. This assay is based on intravenous injection of a dye and subsequent visualization of its diffusion into interstitial spaces.

<em&gt; In vivo</em&gt; Assay לבדיקת חדירות כלי דם

This method is based on the intravenous injection of Evans Blue in mice as the test animal model. Evans blue is a dye that binds albumin. Under ...

Assessing Myogenic Response and Vasoactivity In Resistance Mesenteric Arteries Using Pressure Myography

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic response is a key regulator of local blood flow. In isobaric conditions small resistance arteries develop sustained constriction known as myogenic tone (MT), which is a major determinant of systemic vascular resistance (SVR). Hence, ex vivo&#160;pressurized preparations of small resistance arteries are major tools to study microvascular function in near-physiological states. To achieve this, a freshly isolated intact segment of a small resistance artery (diameter ~260 &#956;m) is mounted onto two small glass cannulas and pressurized. These arterial preparations retain most in vivo characteristics and permit assessment of vascular tone in real-time. Here we provide a detailed protocol for assessing vasoactivity in pressurized small resistance mesenteric arteries from rats; these arteries develop sustained vasoconstriction - approximately 25% of maximal diameter - when pressurized at 70 mmHg. These arterial preparations may be used to study the effect of investigational compounds on relationship between intra-arterial pressure and vasoactivity and determine changes in microvascular function in animal models of various diseases.

Pressure myography is used to assess vasoactivity of small arteries that develop sustained constriction when pressurized. This manuscript provides a detailed protocol to assess in isolated segments of small mesenteric arteries from rats, vasoactivity and the effect of intraluminal pressure on vascular diameter.

הערכת myogenic תגובה וVasoactivity בעורקי ההתנגדות mesenteric שימוש Myography לחץ

Small resistance arteries constrict and dilate respectively in response to increased or decreased intraluminal pressure; this phenomenon known as myogenic ...

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying tissue compartments, restricting the transport of smaller molecules across the epithelium and almost completely prohibiting epithelial macromolecular transport. This selectivity is determined by the mucous gel layer, which limits the transport of lipophilic molecules and both the apical receptors and tight junctional protein complexes of the epithelium. In vitro cell culture models of the epithelium are convenient, but as a model, they lack the complexity of interactions between the microbiota, mucous-gel, epithelium and immune system. On the other hand, in vivo assessment of intestinal absorption or permeability may be performed, but these assays measure overall gastrointestinal absorption, with no indication of site specificity. Ex vivo permeability assays using &#34;intestinal sacs&#34; are a rapid and sensitive method of measuring either overall intestinal integrity or comparative transport of a specific molecule, with the added advantage of intestinal site specificity. Here we describe the preparation of intestinal sacs for permeability studies and the calculation of the apparent permeability (Papp) of a molecule across the intestinal barrier. This technique may be used as a method of assessing drug absorption, or to examine regional epithelial barrier dysfunction in animal models of gastrointestinal disease.

Ex Vivo Intestinal Sacs to Assess Mucosal Permeability in Models of Gastrointestinal Disease

This protocol describes the use of excised intestinal tissue preparations or "intestinal sacs" as an ex vivo model of intestinal barrier function. This model may be used to assess integrity of both the epithelial barrier and the mucous gel layer at specific intestinal sites in animal models of digestive disease.

Sacs Ex Vivo המעיים להעריך חדירות ריריות מודלים של מחלות במערכת העיכול

The epithelial barrier is the first innate defense of the gastrointestinal tract and selectively regulates transport from the lumen to the underlying ...

Rat Mesentery Angiogenesis Assay

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in vivo [see review papers], which is the dominating form of angiogenesis in human tumors and non-tumor 
tissues, as discussed in invited review papers1,2. Angiogenesis induced in the membranous mesenteric parts by intraperitoneal (i.p.) injection of a pro-angiogenic factor can be modulated
by subcutaneous (s.c.), intravenous (i.v.) or oral (p.o.) treatment with modifying agents of choice. Each membranous part of the mesentery is 
translucent and framed by fatty tissue, giving it a window-like appearance.
The assay has the following advantageous features: (i) the test tissue is natively vascularized, albeit 
sparsely, and since it is extremely thin, the microvessel network is virtually two-dimensional, which allows the entire network 
to be assessed microscopically in situ; (ii) in adult rats the test tissue lacks significant physiologic angiogenesis, which characterizes
 most normal adult mammalian tissues; the degree of native vascularization is, however, correlated with age, as discussed in1; 
(iii) the negligible level of trauma-induced angiogenesis ensures high sensitivity; (iv) the 
assay replicates the clinical situation, as the angiogenesis-modulating test drugs are administered systemically and the responses 
observed reflect the net effect of all the metabolic, cellular, and molecular alterations induced by the treatment; (v) the assay 
allows assessments of objective, quantitative, unbiased variables of microvascular spatial extension, density, and network pattern 
formation, as well as of capillary sprouting, thereby enabling robust statistical analyses of the dose-effect and molecular 
structure-activity relationships; and (vi) the assay reveals with high sensitivity the toxic or harmful effects of treatments in 
terms of decreased rate of physiologic body-weight gain, as adult rats grow robustly.
Mast-cell-mediated angiogenesis was first demonstrated using this assay3,4. The model demonstrates a high level of 
discrimination regarding dosage-effect relationships and the measured effects of systemically administered chemically or functionally closely related drugs and proteins, 
including: (i) low-dosage, metronomically administered standard chemotherapeutics that yield diverse, drug-specific effects (i.e., 
angiogenesis-suppressive, neutral or angiogenesis-stimulating activities5); (ii) natural iron-unsaturated human lactoferrin, which stimulates 
VEGF-A-mediated angiogenesis6, and natural iron-unsaturated bovine lactoferrin, which inhibits VEGF-A-mediated angiogenesis7; and (iii) 
low-molecular-weight heparin fractions produced by various means8,9. Moreover, the assay is highly suited to studies of the combined 
effects on angiogenesis of agents that are administered systemically in a concurrent or sequential fashion.
The idea of making this video originated from the late Dr. Judah Folkman when he visited our laboratory and witnessed the methodology being demonstrated.
Review papers (invited) discussing and appraising the assay
Norrby, K. In vivo models of angiogenesis. J. Cell. Mol. Med. 10, 588-612 (2006).
Norrby, K. Drug testing with angiogenesis models. Expert Opin. Drug. Discov. 3, 533-549 (2008).

Normal adult vascularized mammalian tissue that lacks physiologic angiogenesis and that has not been exposed to surgical intervention is used to study: (i) the initiation and development of angiogenesis following intraperitoneal administration of test agents; and (ii) modification of angiogenesis following systemic administration of selected test agents.

עכברוש mesentery Assay אנגיוגנזה

The adult rat mesentery window angiogenesis assay is biologically appropriate and is exceptionally well suited to the 
study of sprouting angiogenesis in ...

Biology

Exploring Arterial Smooth Muscle Kv7 Potassium Channel Function using Patch Clamp Electrophysiology and Pressure Myography

Contraction or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries determines the artery diameter and thereby controls flow of blood through the vessel and contributes to systemic blood pressure. The contraction process is regulated primarily by cytosolic calcium concentration ([Ca2+]cyt), which is in turn controlled by a variety of ion transporters and channels. Ion channels are common intermediates in signal transduction pathways activated by vasoactive hormones to effect vasoconstriction or vasodilation. And ion channels are often targeted by therapeutic agents either intentionally (e.g. calcium channel blockers used to induce vasodilation and lower blood pressure) or unintentionally (e.g. to induce unwanted cardiovascular side effects).
Kv7 (KCNQ) voltage-activated potassium channels have recently been implicated as important physiological and therapeutic targets for regulation of smooth muscle contraction. To elucidate the specific roles of Kv7 channels in both physiological signal transduction and in the actions of therapeutic agents, we need to study how their activity is modulated at the cellular level as well as evaluate their contribution in the context of the intact artery.
The rat mesenteric arteries provide a useful model system. The arteries can be easily dissected, cleaned of connective tissue, and used to prepare isolated arterial myocytes for patch clamp electrophysiology, or cannulated and pressurized for measurements of vasoconstrictor/vasodilator responses under relatively physiological conditions. Here we describe the methods used for both types of measurements and provide some examples of how the experimental design can be integrated to provide a clearer understanding of the roles of these ion channels in the regulation of vascular tone.

Measurements of Kv7 (KCNQ) potassium channel activity in isolated arterial myocytes (using patch clamp electrophysiological techniques) in parallel with measurements of constrictor/dilator responses (using pressure myography) can reveal important information about the roles of Kv7 channels in vascular smooth muscle physiology and pharmacology.

היכרות עם פונקצית עורקי שריר חלק Kv7 אשלגן ערוץ באמצעות אלקטרופיזיולוגיה קלאמפ תיקון וMyography לחץ

Contraction  or relaxation of smooth muscle cells within the walls of resistance arteries  determines the artery diameter and thereby controls flow of ...

Assessing Murine Resistance Artery Function Using Pressure Myography

Pressure myograph systems are exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized to a suitable transmural pressure. The near physiological condition achieved in pressure myography permits in-depth characterization of intrinsic responses to pharmacological and physiological stimuli, which can be extrapolated to the in vivo behavior of the vascular bed. Pressure myograph has several advantages over conventional wire myographs. For example, smaller resistance vessels can be studied at tightly controlled and physiologically relevant intraluminal pressures. Here, we study the ability of 3rd order mesenteric arteries (3-4 mm long), preconstricted with phenylephrine, to vaso-relax in response to acetylcholine. Mesenteric arteries are mounted on two cannulas connected to a pressurized and sealed system that is maintained at constant pressure of 60 mmHg. The lumen and outer diameter of the vessel are continuously recorded using a video camera, allowing real time quantification of the vasoconstriction and vasorelaxation in response to phenylephrine and acetylcholine, respectively.
	To demonstrate the applicability of pressure myography to study the etiology of cardiovascular disease, we assessed endothelium-dependent vascular function in a murine model of systemic hypertension. Mice deficient in the &alpha;1 subunit of soluble guanylate cyclase (sGC&alpha;1-/-) are hypertensive when on a 129S6 (S6) background (sGC&alpha;1-/-S6) but not when on a C57BL/6 (B6) background (sGC&alpha;1-/-B6). Using pressure myography, we demonstrate that sGC&alpha;1-deficiency results in impaired endothelium-dependent vasorelaxation. The vascular dysfunction is more pronounced in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice, likely contributing to the higher blood pressure in sGC&alpha;1-/-S6 than in sGC&alpha;1-/-B6 mice. 
	Pressure myography is a relatively simple, but sensitive and mechanistically useful technique that can be used to assess the effect of various stimuli on vascular contraction and relaxation, thereby augmenting our insight into the mechanisms underlying cardiovascular disease.

In pressure myography, an intact small segment of a vessel is mounted onto two small cannulas and pressurized to a suitable luminal pressure. Here, we describe the method to measure vasorelaxation response of the mouse 3rd order mesenteric arteries in c57 and sGC&alpha;1-/- mice using pressure myography.

הערכת תפקוד עורקי התנגדות Murine באמצעות לחץ Myography

Pressure myograph systems are  exquisitely useful in the functional assessment of small arteries, pressurized  to a suitable transmural pressure. The  ...

Isometric Contractility Measurement of the Mouse Mesenteric Artery Using Wire Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and drugs. It is widely used in many studies on the physiological functions of vascular smooth muscle, the pathogenesis of vascular diseases such as hypertension, and the development of smooth muscle relaxant drugs. The mouse is a widely used model animal with a large pool of disease models and genetically modified strains. We introduced this method to measure the isometric contraction of mouse mesenteric artery in detail. A 1.4-mm segment of mouse mesenteric resistance artery was isolated and mounted on a myograph chamber by passing two steel wires through its lumen. After equilibration and normalization steps, the vessel segment was potentiated by a high-K+ solution twice prior to the contraction assay. As an example of the application of this method in drug development, we measured the relaxant effect of a novel natural substance, neoliensinine, isolated from a Chinese herb, embryos of the lotus seed (Nelumbo nucifera Gaertn.) on mouse mesenteric arteries. The vessel segments mounted on the myograph chamber were stimulated with a high-K+ solution. When the force tension reached a stable sustained phase, cumulative doses of neoliensinine were added to the chamber. We found that neoliensinine had a dose-dependent relaxant effect on smooth muscle contraction, thus suggesting that it bears potential activity against hypertension. In addition, as the vessel segment can survive at least 4 hours after mounting and maintain contractility induced by the high-K+ solution for many times, we suggest that the wire myograph system may be used for the time-consuming process of drug screening.

The wire myograph technique is used to investigate vascular smooth muscle functions and screen new drugs. We report a detailed protocol for measuring the isometric contractility of the mouse mesenteric artery and for screening new relaxants of vascular smooth muscle.

Contractility איזומטרי מדידה של עורק מצע המעי העליון העכבר באמצעות חוט Myography

The wire myograph technique is used to assess the contractility of vascular smooth muscles in response to depolarization, GPCR agonists/inhibitors and ...

Microperfusion Technique to Investigate Regulation of Microvessel Permeability in Rat Mesentery

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular mechanisms regulating vascular permeability in cultured endothelial cell monolayers and the functional exchange properties of whole microvascular beds. A method to cannulate and perfuse venular microvessels of rat mesentery and measure the hydraulic conductivity of the microvessel wall is described. The main equipment needed includes an intravital microscope with a large modified stage that supports micromanipulators to position three different microtools: (1) a beveled glass micropipette to cannulate and perfuse the microvessel; (2) a glass micro-occluder to transiently block perfusion and enable measurement of transvascular water flow movement at a measured hydrostatic pressure, and (3) a blunt glass rod to stabilize the mesenteric tissue at the site of cannulation. The modified Landis micro-occlusion technique uses red cells suspended in the artificial perfusate as markers of transvascular fluid movement, and also enables repeated measurements of these flows as experimental conditions are changed and hydrostatic and colloid osmotic pressure difference across the microvessels are carefully controlled. Measurements of hydraulic conductivity first using a control perfusate, then after re-cannulation of the same microvessel with the test perfusates enable paired comparisons of the microvessel response under these well-controlled conditions. Attempts to extend the method to microvessels in the mesentery of mice with genetic modifications expected to modify vascular permeability were severely limited because of the absence of long straight and unbranched microvessels in the mouse mesentery, but the recent availability of the rats with similar genetic modifications using the CRISPR/Cas9 technology is expected to open new areas of investigation where the methods described herein can be applied.

The modified Landis technique enables paired measurement of the hydraulic conductivity of individual microvessels in the mesentery of normal and genetically modified rats under control and test conditions using microperfusion techniques. It provides a convenient method to evaluate mechanisms that regulate microvessel permeability and transvascular exchange under physiological conditions.

Microperfusion טכניקה לחקירת הסדרת כלי דם קטן חדירות בחולדה לפדר

Experiments to measure the permeability properties of individually perfused microvessels provide a bridge between investigation of molecular and cellular ...

Assessment of Vascular Tone Responsiveness using Isolated Mesenteric Arteries with a Focus on Modulation by Perivascular Adipose Tissues

Altered vascular tone responsiveness to pathophysiological stimuli contributes to the development of a wide range of cardiovascular and metabolic diseases. Endothelial dysfunction represents a major culprit for the reduced vasodilatation and enhanced vasoconstriction of arteries. Adipose (fat) tissues surrounding the arteries play important roles in the regulation of endothelium-dependent relaxation and/or contraction of the vascular smooth muscle cells. The cross-talks between the endothelium and perivascular adipose tissues can be assessed ex vivo using mounted blood vessels by a wire myography system. However, optimal settings should be established for arteries derived from animals of different species, ages, genetic backgrounds and/or pathophysiological conditions.

The protocol describes the use of wire myography to evaluate the transmural isometric tension of mesenteric arteries isolated from mice, with special consideration of the modulation by factors released from endothelial cells and perivascular adipose tissues.

בידוד ושימוש בסעיפים של עורקי שור mesenteric ווריד כמבדק לבדיקת Vasoactivity במעי הדק

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video