עבודה זו נתמכה על ידי NIH מענקים 068,625, מענקי NSF 1,063,188 ומרכז של הפיזיקה של תאי חיים 0822613. תודה מיוחדת לד&quot;ר מרינה Marjanovic בקמן מכון ללימודי מדע וטכנולוגיה למתנה של עיני ארנב.

<ol>
	<li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope.">The Relation of Aperture and Power in the Microscope.</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (3), 300-309 (1882).</li><li>Abbe, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Relation+of+Aperture+and+Power+in+the+Microscope+(continued).">The Relation of Aperture and Power in the Microscope (continued).</a> Journal of the Royal Microscopical Society. 2 (4), 460-473 (1882).</li><li>Thompson, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Precise+Nanometer+Localization+Analysis+for+Individual+Fluorescent+Probes.">Precise Nanometer Localization Analysis for Individual Fluorescent Probes.</a> Biophysical Journal. 82 (5), 2775-2783 (2002).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+V+Walks+Hand-Over-Hand:+Single+Fluorophore+Imaging+with+1.5-nm+Localization.">Myosin V Walks Hand-Over-Hand: Single Fluorophore Imaging with 1.5-nm Localization.</a> Science. 300 (5628), 2061-2065 (2003).</li><li>Yildiz, A., Tomishige, M., Vale, R. D., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Kinesin+Walks+Hand-Over-Hand.">Kinesin Walks Hand-Over-Hand.</a> Science. 303 (5658), 676-678 (2004).</li><li>Yildiz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myosin+VI+Steps+via+a+Hand-over-Hand+Mechanism+with+Its+Lever+Arm+Undergoing+Fluctuations+when+Attached+to+Actin.">Myosin VI Steps via a Hand-over-Hand Mechanism with Its Lever Arm Undergoing Fluctuations when Attached to Actin.</a> Journal of Biological Chemistry. 279 (36), 37223-37226 (2004).</li><li>Yildiz, A., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+Imaging+with+One+Nanometer+Accuracy:+Application+to+Molecular+Motors.">Fluorescence Imaging with One Nanometer Accuracy: Application to Molecular Motors.</a> Accounts of Chemical Research. 38 (7), 574-582 (2005).</li><li>Toprak, E., Yildiz, A., Hoffman, M. T., Rosenfeld, S. S., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Why+kinesin+is+so+processive.">Why kinesin is so processive.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 106 (31), (2009).</li><li>Kural, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tracking+melanosomes+inside+a+cell+to+study+molecular+motors+and+their+interaction.">Tracking melanosomes inside a cell to study molecular motors and their interaction.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 104 (13), 5378-5382 (2007).</li><li>Gordon, M. P., Ha, T., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single-molecule+high-resolution+imaging+with+photobleaching.">Single-molecule high-resolution imaging with photobleaching.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (17), 6462-6465 (2004).</li><li>Qu, X., Wu, D., Mets, L., Scherer, N. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanometer-localized+multiple+single-molecule+fluorescence+microscopy.">Nanometer-localized multiple single-molecule fluorescence microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11298-11303 (2004).</li><li>Churchman, L. S., &#214;kten, Z., Rock, R. S., Dawson, J. F., Spudich, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Single+molecule+high-resolution+colocalization+of+Cy3+and+Cy5+attached+to+macromolecules+measures+intramolecular+distances+through+time.">Single molecule high-resolution colocalization of Cy3 and Cy5 attached to macromolecules measures intramolecular distances through time.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (5), 1419-1423 (2005).</li><li>Huang, B., Wang, W., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-Dimensional+Super-Resolution+Imaging+by+Stochastic+Optical+Reconstruction+Microscopy.">Three-Dimensional Super-Resolution Imaging by Stochastic Optical Reconstruction Microscopy.</a> Science. 319 (5864), 810-813 (2008).</li><li>Rust, M. J., Bates, M., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Sub-diffraction-limit+imaging+by+stochastic+optical+reconstruction+microscopy+(STORM).">Sub-diffraction-limit imaging by stochastic optical reconstruction microscopy (STORM).</a> Nat Meth. 3 (10), 793-796 (2006).</li><li>Bates, M., Huang, B., Dempsey, G. T., Zhuang, X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multicolor+Super-Resolution+Imaging+with+Photo-Switchable+Fluorescent+Probes.">Multicolor Super-Resolution Imaging with Photo-Switchable Fluorescent Probes.</a> Science. 317 (5845), 1749-1753 (2007).</li><li>Betzig, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Intracellular+Fluorescent+Proteins+at+Nanometer+Resolution.">Imaging Intracellular Fluorescent Proteins at Nanometer Resolution.</a> Science. 313 (5793), 1642-1645 (2006).</li><li>Abramoff, M. D., Magalh&#227;es, P. J., Ram, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+processing+with+ImageJ.">Image processing with ImageJ.</a> Biophotonics international. 11 (7), 36-42 (2004).</li><li>Enderlein, J., Toprak, E., Selvin, P. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+effect+on+position+accuracy+of+fluorophore+localization.">Polarization effect on position accuracy of fluorophore localization.</a> Optics Express. 14 (18), 8111-8120 (2006).</li><li>Cheezum, M. K., Walker, W. F., Guilford, W. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+algorithms+for+tracking+single+fluorescent+particles.">Quantitative comparison of algorithms for tracking single fluorescent particles.</a> Biophysical Journal. 81 (4), 2378-2388 (2001).</li><li>Rasnik, I., McKinney, S. A., Ha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nonblinking+and+long-lasting+single-molecule+fluorescence+imaging.">Nonblinking and long-lasting single-molecule fluorescence imaging.</a> Nature Methods. 3 (11), 891-893 (2006).</li><li>Zhuang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Single-Molecule+Study+of+RNA+Catalysis+and+Folding.">A Single-Molecule Study of RNA Catalysis and Folding.</a> Science. 288 (5473), 2048-2051 (2000).</li><li>Aitken, C. E., Marshall, R. A., Puglisi, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Oxygen+Scavenging+System+for+Improvement+of+Dye+Stability+in+Single-Molecule+Fluorescence+Experiments.">An Oxygen Scavenging System for Improvement of Dye Stability in Single-Molecule Fluorescence Experiments.</a> Biophysical Journal. 94 (5), 1826-1835 (2008).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

FIONA הוא טכניקה למקם את עמדתו של פולט ניאון (fluorophore אורגני או נקודה קוונטית) עם דיוק ננומטר ופתרון זמני עד ל1 msec 4 8. כאשר מספיק פוטונים נאספים, טכניקה זו מאפשרת לקבוע את המיקום של פולט ניאון הרבה יותר מדויק מגבול ההשתברות (~ 200 ננומטר) ולכן טכניקה זו פותחת את דרך לקיים את מה שלא כבר ראה במיקרוסקופ אופטי רגיל / מסורתי 4 - 8. מאז המצאתה, פיונה יושמה בהצלחה להתבוננות הליכה רבים מנועים מולקולריים, כגון myosins וkinesins. לאחרונה, זה, יחד עם עבודה אחרת 3,19, תרם לתהליך הלוקליזציה של טכניקות ברזולוציה סופר מתעוררים מסוימות, כגון STORM וPALM 13- 16. השלב הקריטי כדי להשיג FIONA טמון במספר הפוטונים שנאספו, המושפע מf השונותשחקנים. לדוגמא, התקנת TIRFM המשמשת לניסויי FIONA צריכה להיות מתואמת כך שכוחות ביטחון פלסטיני טוב (כלומר, לא מתוח, לא-סטיגמות, וכו &#39;) מושגת ורעש יחס אות לסביר מתקבל היטב. בנוסף, מטרה עם ערך NA גבוה יש להשתמש כדי לאסוף את פוטונים רבים ככל האפשר. כדי לאסוף יותר פוטונים ובכך להגדיל את דיוק לוקליזציה, שיטות נבלות חמצן שונות וריאגנטים נחקרו לדכא photobleaching ומהבהב 20- 22. שתי שיטות הדחה חמצן שונות כבר בשימוש במעבדה שלנו. אחד מהם הוא הפתרון (גלוקוז אוקסידאז וקטלאז) &quot;gloxy&quot; 20. האחרים הוא PCA / PCD שתואר לעיל 22. עבודות לשעבר מייד לאחר ערבוב אבל pH של התמיסה משתנה על פני זמן. האחרון שומר על הפתרון כימי ללא שינוי אך זמן דגירה של 8 עד 10 דקות נדרש. גם מוקרן כאן, אפשר גם להאריך FIONA עבור דגימות עבות באמצעות מטרת טבילה במי 60X עם NA = 1.2. יש מטרה זו מרחק כבר לא עובד (0.27 מ&quot;מ) מאשר אובייקטיבי ששימש בעבר 100X טבילת שמן (0.17 מ&quot;מ). לעבוד על דגימות עבות, מיקרוסקופיה עלית הקרינה צריכה להיות בשימוש. למרות היתרון של רקע הנמוך של TIRFM הוא הקריב, דיוק לוקליזציה ננומטר הוא עדיין בר השגה תוך שימוש בנקודות קוונטיות בהירות. הרחבה זו תהיה שימושית בתחום הדמיה רקמות עבה ויישומים רפואיים. היישום של פיונה הוא מוגבל בכמה היבטים. קודם כל, כפי שלוקליזציה הדיוק תלוי במספר הכולל של פוטונים שנאספו, ההחלטה הזמנית של פיונה היא בדרך כלל בסכנה. שנית, יכול להיות מיושם FIONA לבד רק לדגימות שכותרתו בדלילות. במילים אחרות, פיונה תיכשל אם fluorophores מרובה הם מספיק קרוב כגון PSFs חופף. בנוסף, הפיזור של פליטת אור מגביל את apקפול של פיונה בעובי רקמות הדמיה.

סביב 1882, ארנסט אבה מצא כי הרזולוציה של מיקרוסקופ אור הנראה היא ~ λ / 2nA, או ~ 200 ננומטר (שבו λ הוא אורך הגל וNA הוא הצמצם המספרי) 1,2. לכן כל חפץ קטן יותר מממד זה יופיע כנקודה עקיפה מוגבלת במיקרוסקופ אופטי. עם זאת, ניתן לקבוע את המרכז של המקום, כלומר, המיקום של האובייקט, עם דיוק גבוה בהרבה 3. דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחד ננומטר (FIONA) היא טכניקה פשוטה אך שימושית לאיתור fluorophores היחיד עם דיוק ננומטר במישור XY 4. הדיוק של לוקליזציה, σ μ (כלומר, שגיאת התקן של הממוצע), תלויה במספר הכולל של פוטונים שנאספו, <img alt="משוואת 1" fo:content-width="1in" src="/files/ftp_upload/51774/intro_eqn.jpg" width="100" /> , כאשר N הוא מספר הפוטונים, ים היא סטיית התקן של נקודת הניאון, הואגודל פיקסל של גלאי ההדמיה, וb הוא סטיית התקן של הרקע 3,4. לfluorophore פולט ~ 10,000 פוטונים, פיונה יכולה להשיג דיוק ננומטר ~ 1 4. FIONA יכול לשמש כדי לקבוע את המיקום של פולט נייח, או אחד מרגש (בהנחה שתמונות ניתן לקחת מספיק מהר) באופן מדויק. יכול להיות מיושם FIONA ברצף למסגרות של הסרט ובכך לעקוב אחר התנועה של המולקולה בודדת 4 8. ריאגנטים תמונה מגן עשויים להיות נחוצים כדי להבטיח כי המדגם אינו מתפרק באור. יתר על כן, עצם הניאון עצמו עשוי להיות בכל גודל, קטן יותר או גדול יותר מעקיפת limit- למשל, זה יכול להיות מורכב מאברון (~ 1 מיקרומטר) עם חלבוני ניאון רבים התפזרו על הממברנה שלו. באמצעות FIONA עדיין יכול להניב ממוצע מדויק מאוד (ננומטר) של המרכז של מסה הממוצע שלה. השיפור הגדול בדיוק לוקליזציה על ידי FIONA מאפשר פתרון nanomeתנועות ter בקנה מידה לאורך זמן. זה דחף את מיקרוסקופיה לתוך קנה המידה האורך המולקולרי 4 8. מאז המצאתה, וריאנטים של פיונה פותחו. לדוגמא, הדמיה בהירה שדה עם דיוק אחד ננומטר (bFIONA) 9, גרסה קלה של פיונה, תמונות וlocalizes אובייקטים צפופים כגון melanosomes in vivo (אובייקטים כהים המכילים את פיגמנט המלנין) עם אור מועבר. בנוסף, פיונה כבר מועסק כדי לפתור צבעים מרובים. לדוגמא, הדמיה מולקולה בודדת ברזולוציה גבוהה עם photobleaching (שרימפס) 10,11 או colocalization ברזולוציה גבוהה מולקולה בודדת (SHREC) 12 פותחו כדי לפתור שני צבעים בתוך כ10 ננומטר. (שים לב שזה הוא ברזולוציה, כלומר כמה במדויק אחד לא יכול להגיד צבעים זהים זה מזה.) לאחרונה, ניתוח FIONA תרם לתהליך הלוקליזציה של מיקרוסקופיה ברזולוציה סופר מסוימת, כגון RECO האופטי סטוכסטייםמיקרוסקופיה nstruction (STORM) 13- 15 ומיקרוסקופיה לוקליזציה המופעלת תמונה (PALM) 16, שבי fluorophores הכהה הזמני שמחים, ולאחר מכן הקרינה היא מקומית. על ידי שוב ושוב מרגשת צפיפות נמוכה למדי של צבעים (מקום מוגבל עקיפה לפחות מאחד), ולאחר מכן לאסוף את הקרינה, ניתוח כל אחד מהם על ידי פיונה, אחד יכול לבנות את המפה ברזולוציה גבוהה. הרזולוציה אז מוגבלת רק במספר הפוטונים כל צבע מעביר החוצה, כמו גם דברים כמו שמירה נייחת המדגם (כולל, למשל, את הבמה מיקרוסקופ) במהלך הרכישה. במאמר זה, סיכום של טכניקת פיונה ויתארו בקצרה דוגמאות של מחקר שבוצע באמצעות FIONA מדווח. ראשית, כיצד להגדיר את הציוד דרוש לשם ניסויי פיונה, כלומר, בסך הכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההשתקפות הפנימי (TIRFM), עם פרטים על יישור אופטיקה, מתואר. אז איךלבצע ניסוי FIONA פשוט על הלוקליזציה של מולקולות בודדות Cy3-DNA המשותק באמצעות פרוטוקולים מתאימים, בא לידי ביטוי. אחרי זה, את השימוש בFIONA כדי למדוד את גודל צעד 36 ננומטר של מנוע Va יחיד שרירן הקטוע שכותרתו עם נקודה קוונטית מוצג. שרירן Va הוא חלבון מנוע התהליכית חיוני אשר נושא מטען סלולארי בזמן translocating לאורך סיביים אקטין. כאן שרירן Va לבנות קטום משמש כדי להסיר תחומים רלוונטיים לגודל הצעד, ועם תג דגל נוספו לC-הסופי כדי לאפשר הקלות של תיוג עם נקודות קוונטיות פונקציונליות עם נוגדני Anti-FLAG. ניסוי זה נעשה תחת ATP הנמוך להאט את שרירן ולאפשר את השימוש בזמני חשיפה ארוכים מספיק כדי לקבל ספירת פוטון טובה בכל מסגרת. כל תווית ניאון מספיק בהירה יכולה להיות תחליף בפרוטוקול הבא. לבסוף, המאמץ האחרון של הארכת היישום של פיונה לדגימות עבות מדווח. כעיקרון הוכחה של, נקודות קוונטיות היו ספוגותבסול ג&#39;ל וקרניות עיני ארנב ולאחר מכן צילם ומקומי באמצעות פיונה. להדמיה, מטרת טבילת 60X מים עם NA = 1.2 שימשו כי יעד זה יש מרחק כבר לא עובד יותר אובייקטיבי טבילת שמן ששימש בעבר 100X. כדי לפצות על האובדן בהגדלה במטרה, עדשה נוספת להגדלה החזקה (3.3X או 4.0x) הוכנסה בנתיב הפליטה. בנוסף, עלית הקרינה (לא TIR) מיקרוסקופיה צריכה לשמש כדי לגשת אזורים עמוקים בדגימות העבות. הוא הראה כי נקודות קוונטיות ספוגות עמוק בסול ג&#39;ל ובקרניות עיני ארנב (Z&gt; 200 מיקרומטר) יכול להיות מקומיות עם 2-3 דיוק ננומטר.

<table><tbody><tr><td>Double-sided tape</td><td>3M</td><td></td><td>~75 &amp;#181;m thick</td></tr><tr><td>EMCCD camera</td><td>Andor Technology</td><td>DU-897E-CS0-#BV</td><td></td></tr><tr><td>Ultrasonic cleaner</td><td>Branson</td><td>2510</td><td></td></tr><tr><td>Fluorescence filter set</td><td>Chroma</td><td>49016</td><td></td></tr><tr><td>Actin polymerization buffer&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>BSA02</td><td></td></tr><tr><td>Biotin G-actin</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>AB07</td><td></td></tr><tr><td>G-actin&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>AKL95</td><td></td></tr><tr><td>General actin buffer&amp;nbsp;</td><td>Cytoskeleton&amp;nbsp;</td><td>BSA01</td><td></td></tr><tr><td>Laser shutter (with driver)</td><td>Electro-Optical Products Corp.&amp;nbsp;</td><td>SH-10-MP</td><td></td></tr><tr><td>IDL</td><td>Exelis Visual Information Solutions</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Neutravidin&amp;nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>PI-31000</td><td></td></tr><tr><td>Coverslip</td><td>Fisherbrand&amp;nbsp;</td><td>22X30-1.5</td><td>0.16-0.19 mm thick</td></tr><tr><td>Microscope slide</td><td>Gold Seal Microslides&amp;nbsp;</td><td>30103X1</td><td>0.93-1.05 mm thick</td></tr><tr><td>Plasma cleaner</td><td>Harrick Plasma</td><td>PDC-001</td><td></td></tr><tr><td>Glass bottom dish&amp;nbsp;</td><td>In Vitro Scientific</td><td>D35-20-1.5-N</td><td></td></tr><tr><td>Cy3-DNA oligos</td><td>Integrated DNA Technologies</td><td></td><td>5&#039;-Cy3/GCCTCGCTGCCGTCGCCA-3&#039;Bio</td></tr><tr><td>Fluorescent beads&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>T-7280</td><td></td></tr><tr><td>Qdot 605-streptavidin&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q10101MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot605&amp;nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Q21301MP</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705</td><td>Invitrogen</td><td>Q22021MP&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Qdot705 Antibody Conjugation Kit</td><td>Invitrogen</td><td>Q22061MP</td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>MathWorks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Optical table</td><td>Newport Corp</td><td></td><td>RS4000 Series</td></tr><tr><td>60X Objective</td><td>Nikon</td><td>Plan Apo VC 60x WI</td><td></td></tr><tr><td>100X Objective</td><td>Olympus</td><td>PlanApo 100X/1.45 Oil &amp;infin;/0.17</td><td></td></tr><tr><td>60X Objective</td><td>Olympus</td><td>UPlanApo 60X/1.20W</td><td></td></tr><tr><td>Inverted microscope</td><td>Olympus</td><td>IX71/IX70/IX81</td><td></td></tr><tr><td>Origin</td><td>OriginLab</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Anti-FLAG antibody</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F7425-.2MG</td><td></td></tr><tr><td>ATP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7699</td><td></td></tr><tr><td>BME&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>63689-25ML-F</td><td></td></tr><tr><td>BSA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A7906</td><td></td></tr><tr><td>BSA-biotin</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A8549-10MG</td><td></td></tr><tr><td>CK</td><td>Sigma Aldrich</td><td>C3755</td><td>Creatine Phosphokinase from rabbit muscle</td></tr><tr><td>CP</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P1937</td><td>Phosphocreatine di(tris) salt</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma Aldrich</td><td>43815</td><td>DL-Dithiothreitol</td></tr><tr><td>EGTA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>E3889</td><td>Ethylene glycol-bis(2-aminoethylether)-&lt;em&gt;N,N,N&amp;prime;,N&amp;prime;&lt;/em&gt;-tetraacetic acid</td></tr><tr><td>HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363-500G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>H0887</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9333</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>M1028</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma Aldrich</td><td>S7653</td><td></td></tr><tr><td>PCA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>03930590</td><td>Protocatechuic acid&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>PCD</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8279</td><td>Protocatechuate-3,4-dioxygenase&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>TMOS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341436-25G</td><td>Tetramethyl orthosilicate</td></tr><tr><td>Tris-HCl&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>93363</td><td></td></tr><tr><td>Trolox</td><td>Sigma Aldrich</td><td>238813</td><td>6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchromane-2-carboxylic acid</td></tr><tr><td>1&amp;rdquo; diameter broadband dielectric mirrors with mounts</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BB1-E02, KM100</td><td>Quantity: 2</td></tr><tr><td>&amp;frac12;&amp;rdquo; diameter posts</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>TR4</td><td>Quantity &amp;ge; 6</td></tr><tr><td>10X beam expander</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BE10M-A</td><td></td></tr><tr><td>2&amp;rdquo; diameter f = 300 mm lens with mount</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>LA1256-A, LMR2</td><td>TIR lens</td></tr><tr><td>Fluorescent alignment target&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>VRC2SM1</td><td></td></tr><tr><td>Laser safety goggles</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>LG3</td><td></td></tr><tr><td>ND filter(s)</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>FW1AND</td><td></td></tr><tr><td>Optical beam profiler</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>BP209-VIS</td><td></td></tr><tr><td>Post-mounted iris diaphragm</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>ID25</td><td>Quantity: 2</td></tr><tr><td>Shearing interferometer</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>SI100</td><td></td></tr><tr><td>XYZ translation stage, &amp;frac12;&amp;rdquo; travel&amp;nbsp;</td><td>Thorlabs&amp;nbsp;</td><td>T12XYZ</td><td></td></tr><tr><td>Laser</td><td>World Star Technologies&amp;nbsp;</td><td>TECGL-30</td><td>532 nm, 30 mW</td></tr></tbody></table>

fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (fiona)

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחד ננומטר (FIONA) היא טכניקה פשוטה אך שימושית לאיתור fluorophores היחיד עם דיוק ננומטר במישור XY. הנה סיכום של טכניקת פיונה דיווח ודוגמאות של מחקר שבוצעו באמצעות FIONA יתוארו בקצרה. ראשית, כיצד להגדיר את הציוד דרוש לשם ניסויי פיונה, כלומר, בסך הכל מיקרוסקופ פלואורסצנטי ההשתקפות הפנימי (TIRFM), עם פרטים על יישור אופטיקה, מתואר. אז איך לבצע את ניסוי FIONA פשוט על הלוקליזציה של מולקולות בודדות Cy3-DNA המשותק באמצעות פרוטוקולים מתאימים, ואחריו את השימוש בFIONA כדי למדוד את גודל צעד 36 ננומטר של מנוע Va יחיד שרירן הקטוע שכותרתו עם נקודה קוונטית, בא לידי ביטוי. לבסוף, המאמץ האחרון כדי להרחיב את היישום של פיונה לדגימות עבות מדווח. הוא הראה כי, באמצעות מטרת טבילה במים ונקודות קוונטיות ספוגות עמוקות בסול ג&#39;ל וקרניות עיני ארנב (&gt;200 מיקרומטר), דיוק לוקליזציה של 2-3 ננומטר יכול להיות מושגת.

התקנת TIRFM אובייקטיבי מסוג טיפוסית מוצגת באיור 3. ראשון, מדגם Cy3-DNA-משותק משטח היה צילם. תמונה טיפוסית מוצגת באיור 4 א. התמונה צולמה עם זמן חשיפה 0.5 שניות, עם רווח EM = 50 ורגישות CCD = 12.13 למצלמה. נקודת התפשטות הפונקציה (כוחות הביטחון הפלסטיניים) של מולקולת Cy3-DNA בודד מוצגת באיור 4 ב (מהמקום המסומן בחץ באיור 4 א), שבו הצבע בר מציג את הסולם של עוצמות פיקסל. ספירת הפוטון בפועל יכולה להיות מחושבת על ידי הכפלה בעוצמות פיקסל על ידי גורם המרה, רגישות α = CCD / רווח EM. מקום זה מכיל כ 14,000 פוטונים (לאחר תיקון לרקע). כוחות הביטחון הפלסטיניים מכן מצויד בפונקציה דו ממדי גאוס, f (x, y) = z 0 + · exp (- x (x-μ) 2 / (2s x 2) - (y - &amp; #181; y) 2 / (2s y 2)), כפי שמוצג באיור 4C (עם שאריות ראויים שמוצגים באיור 4d). הדיוק של לוקליזציה מחושב לאחר מכן על ידי <img alt="משוואה 2" fo:content-width="2in" src="/files/ftp_upload/51774/results_eqn.jpg" width="200" /> , שבו אני = x או y, s i הוא סטיית התקן של הולם, N הוא המספר הכולל הפוטון, הוא בגודל פיקסל, וb הוא סטיית התקן של רקע. בדוגמא ספציפית זו, N = 14528, = 106.67 ננומטר, זה x = 115.5 ננומטר, של y = 109.4 ננומטר, b = 18.9, וכתוצאה מכך precisions לוקליזציה של σ x = 1.3 ננומטר וy σ = 1.2 ננומטר. דיוק הלוקליזציה של fluorophore הוא כ פרופורציונאלי ל1 / √N, כלומר, יותר פוטונים, הלוקליזציה מדויקת יותר היא. עם זאת, ביישומים בפועל של פיונה, משך זמן של תצפית ניסיונית הוא שיקול נוסף. לכן אחתבאופן כללי צריכים להבין התחלופה בין דיוק לוקליזציה ומשך תצפית ולתכנן קדימה. במצבים כאלה, זה בדרך כלל מועיל כדי לקבוע כמה פוטונים בסך הכל fluorophore הוא מסוגל לפלוט לפני photobleaching. עקבות טיפוסיות של ספירת פוטון לעומת מסגרת מוצגת באיור 4e. מתאים מעריכי נותן כי מספר הפוטונים הממוצע ~ 1.4 x 10 6 (איור 4F). תהליך ניתוח נתוני מדידת צעד בגודל שרירן מוצג באיור 5. ראשון, קובץ וידאו עם אות לרעש טובה של שרירן אחד כפי שהוא הולך לאורך נימה אקטין הוא נתפסה. 5a איור מראה שלוש מסגרות מוידאו צולם ב100 חשיפה אלפיות שנייה עם מטרת טבילת שמן 100X. כוחות הביטחון הפלסטיניים נעו לאחר מכן מעקב באמצעות קובץ וידאו הקצוץ באמצעות קוד מותאם אישית נכתב בIDL כדי לחלץ מידע מרחק לעומת זמן, אשר הניח באמצעות T-testלצעדים. איור 5 הופעות עם המרחק לעומת זמן (אדום) ואת שלב מאתר פלט (לבן). טעויות לוקליזציה בכל מסגרת מטשטשת את צורת המדרגות של העקבות, אז זה הוא קריטי כדי להשיג ספירת פוטון בכל מסגרת שמתאימה לשגיאת לוקליזציה פחות ממחצית מגודל הצעד התיאורטי אחד רוצה לראות. איור 5c תערוכות צעדים מכמה עקבות לשלב היסטוגרמה אחד כי הוא גאוס-מופצת על גודל צעד שרירן האמיתי. כושר גאוס לפחי היסטוגרמה מניב מדידת גודל צעד סופית של 35.8 ± 0.4 ננומטר. משום דגימות סול ג&#39;ל והקרנית שקופות, לייזרי עירור יכולים לחדור עמוק לתוך הדגימות מבלי שפזורים יותר מדי. בנוסף, אוטומטי הקרינה מהמדגם ממוזערת. כאשר כותרתו עם ריכוז נמוך של נקודות קוונטיות, ניתן לאסוף הקרינה מQdots העמוקה במדגם גבוה יחס אות לרעש.שימוש במטרת מים נותן לנו את מרחק העבודה של 270 או 280 מיקרומטר, מה שאומר שאפשר להתמקד ככל 280 מיקרומטר מן coverslip. זה מאפשר לנו לבצע ניתוח FIONA על נקודות קוונטיות בדגימות עבות. לנקודות קוונטיות במדגם סול ג&#39;ל, דיוק לוקליזציה של 1-2 ננומטר ליד coverslip ו2-3 ננומטר ב280 מיקרומטר עמוק לתוך המדגם (6 א-6b דמויות) מושגת. לנקודות קוונטיות במדגם ביולוגי (חלק מקרנית מעין ארנב, 6e איור), דיוק לוקליזציה של 1-2 ננומטר ליד coverslip ו2-3 ננומטר ב ~ 223 מיקרומטר עמוקים לתוך המדגם (איורים 6 ג-6 ד) מושגת. יצוין, כי דיוק הלוקליזציה הוא השתפר על ידי שימוש בעדשת הגדלה נוספת, שבלעדיו דיוק לוקליזציה של 6-7 ננומטר הושג. זה עולה בקנה אחד עם מחקרים קודמים שהראו כי מספריים דיוק הלוקליזציה ניתן לשפר על ידי שינוי גודל פיקסל האפקטיבי מ~ 200ננומטר ל~ 50 ננומטר גם אם המספר הכולל של פוטונים שנאספו עשוי להיות נמוך יותר בשל השתקפויות נוספות / refractions 18. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3 תצורה אופטית. התצורה האופטית של מיקרוסקופיה הכוללת הקרינה השתקפות פנימית (TIRF).) היא תמונה כאשר לייזר הוא במצב TIRF ו ב) הוא צורת קרן הלייזר על התקרה כאשר לייזר הוא בעלית תאורה. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig4highres.jpg" width="500" /> לוקליזציה איור 4 של Cy3-DNA המשותק.) תמונת CCD (256 x 256 פיקסלים) של Cy3-DNA. תמונת CCD של מולקולת Cy3-DNA בודד ב), שצוינו על ידי ילחץ נמוך ב). ג) התאמת פונקצית נקודת התפשטות של מולקולת Cy3-DNA היחיד עם פונקצית גאוס דו ממדים.. ה) ד) שאריות התאמה מג) פוטון לספור לעומת מספר מסגרת. הפצה ו) מספר הפוטונים הנפלטים על ידי מולקולת Cy3 לפני photobleaching. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51774/51774fig4highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5 שרירן הליכה שנצפה על ידי פיונה. ) פריימים מתוך קובץ דוגמא הנתונים המתאימים לט = 0 שניות, 30 שניות, ו60 שניות. מבנה שרירן-qdot נע בלאורך דרך ישרה, וספירה טובה פוטון (&gt; 5,000) בכל מסגרת. ב) יישום של פיונה לכל yie מסגרתLDS עקבות מרחק לעומת זמן שזממה באדום. אלגוריתם צעד מציאת מבוסס על T-הבדיקה משמש לאחר מכן כדי לחלץ צעדים בודדים, והפלט הוא מעולף בלבן. גדלי שלב מסומנים בלבן ביחידות של ננומטר. ג) מדרגות מעקבות מרובות משולבים בהיסטוגרמה. גדלי הצעד הנמדדים הם על 35.8 ± 0.4 ננומטר-הופץ גאוס. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51774/51774fig5highres.jpg" target="_blank">אנא לחצו כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51774/51774fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6 ניתוח FIONA על נקודות קוונטיות עמוקות בדגימות עבות.) תמונה של פלורסנט QD 605 בסול ג&#39;ל בZ = 280 מיקרומטר עם 90X הגדלה. ב) פונקצית התפשטות נקודת QD מסומן ב). σ x = 2.6 ננומטר, σ y = 2.3 ננומטר. כל יחידה בX וציר Y מייצגת תמונה 266.7 ננומטר. ג) פלורסנט של QD 655 ברקמת קרנית ארנב בZ = 223 מיקרומטר עם 360x הגדלה. ד) כוחות הביטחון הפלסטיניים של QD מסומן בג). σ x = 2.2 ננומטר, σ y = 3.6 ננומטר. כל יחידה בציר X ו Y מייצגת 44.4 ננומטר. ה) תמונות של רקמת הקרנית רכובה על coverslip. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51774/51774fig6highres.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA at JoVE.com

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

יכול להיות מקומי fluorophores יחיד עם דיוק ננומטר באמצעות פיונה. הנה סיכום של טכניקת FIONA מדווח, וכיצד לבצע את ניסויי FIONA מתואר.

דימות פלואורסצנטי עם דיוק אחת ננומטר (FIONA)

Fluorescence imaging with one-nanometer accuracy (FIONA) is a simple but useful technique for localizing single fluorophores with nanometer precision in ...

fluorescence-imaging-with-one-nanometer-accuracy-fiona

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy (FIONA)

17.6K Views.  University of Illinois at Urbana-Champaign.  יכול להיות מקומי fluorophores יחיד עם דיוק ננומטר באמצעות פיונה. הנה סיכום של טכניקת FIONA מדווח, וכיצד לבצע את ניסויי FIONA מתואר. 

Video: Fluorescence Imaging with One-nanometer Accuracy FIONA

Compact Quantum Dots for Single-molecule Imaging

Single-molecule imaging is an important tool for understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the spatial and temporal heterogeneity of molecular behaviors that underlie cellular biology 1-4. To image an individual molecule of interest, it is typically conjugated to a fluorescent tag (dye, protein, bead, or quantum dot) and observed with epifluorescence or total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy. While dyes and fluorescent proteins have been the mainstay of fluorescence imaging for decades, their fluorescence is unstable under high photon fluxes necessary to observe individual molecules, yielding only a few seconds of observation before complete loss of signal. Latex beads and dye-labeled beads provide improved signal stability but at the expense of drastically larger hydrodynamic size, which can deleteriously alter the diffusion and behavior of the molecule under study.
Quantum dots (QDs) offer a balance between these two problematic regimes. These nanoparticles are composed of semiconductor materials and can be engineered with a hydrodynamically compact size with exceptional resistance to photodegradation 5. Thus in recent years QDs have been instrumental in enabling long-term observation of complex macromolecular behavior on the single molecule level. However these particles have still been found to exhibit impaired diffusion in crowded molecular environments such as the cellular cytoplasm and the neuronal synaptic cleft, where their sizes are still too large 4,6,7.
Recently we have engineered the cores and surface coatings of QDs for minimized hydrodynamic size, while balancing offsets to colloidal stability, photostability, brightness, and nonspecific binding that have hindered the utility of compact QDs in the past 8,9. The goal of this article is to demonstrate the synthesis, modification, and characterization of these optimized nanocrystals, composed of an alloyed HgxCd1-xSe core coated with an insulating CdyZn1-yS shell, further coated with a multidentate polymer ligand modified with short polyethylene glycol (PEG) chains (Figure 1). Compared with conventional CdSe nanocrystals, HgxCd1-xSe alloys offer greater quantum yields of fluorescence, fluorescence at red and near-infrared wavelengths for enhanced signal-to-noise in cells, and excitation at non-cytotoxic visible wavelengths. Multidentate polymer coatings bind to the nanocrystal surface in a closed and flat conformation to minimize hydrodynamic size, and PEG neutralizes the surface charge to minimize nonspecific binding to cells and biomolecules. The end result is a brightly fluorescent nanocrystal with emission between 550-800 nm and a total hydrodynamic size near 12 nm. This is in the same size range as many soluble globular proteins in cells, and substantially smaller than conventional PEGylated QDs (25-35 nm).

We describe the preparation of colloidal quantum dots with minimized hydrodynamic size for single-molecule fluorescence imaging. Compared to conventional quantum dots, these nanoparticles are similar in size to globular proteins and are optimized for single-molecule brightness, stability against photodegradation, and resistance to nonspecific binding to proteins and cells.

נקודות קוונטיות קומפקטיות להדמית מולקולה בודדה

Single-molecule imaging is an important tool for  understanding the mechanisms of biomolecular function and for visualizing the  spatial and temporal ...

Engineering

Imaging Subcellular Structures in the Living Zebrafish Embryo

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such imaging experiments in higher vertebrates such as mammals generally requires surgical access to the system under study. The optical accessibility of embryonic and larval zebrafish allows such invasive procedures to be circumvented and permits imaging in the intact organism. Indeed the zebrafish is now a well-established model to visualize dynamic cellular behaviors using in vivo microscopy in a wide range of developmental contexts from proliferation to migration and differentiation. A more recent development is the increasing use of zebrafish to study subcellular events including mitochondrial trafficking and centrosome dynamics. The relative ease with which these subcellular structures can be genetically labeled by fluorescent proteins and the use of light microscopy techniques to image them is transforming the zebrafish into an in vivo model of cell biology. Here we describe methods to generate genetic constructs that fluorescently label organelles, highlighting mitochondria and centrosomes as specific examples. We use the bipartite Gal4-UAS system in multiple configurations to restrict expression to specific cell-types and provide protocols to generate transiently expressing and stable transgenic fish. Finally, we provide guidelines for choosing light microscopy methods that are most suitable for imaging subcellular dynamics.

Imaging the dynamic behavior of organelles and other subcellular structures in vivo can shed light on their function in physiological and disease conditions. Here, we present methods for genetically tagging two organelles, centrosomes and mitochondria, and imaging their dynamics in living zebrafish embryos using wide-field and confocal microscopy.

הדמית מבני subcellular בעובר דג הזברה החייה

In vivo imaging provides unprecedented access to the dynamic behavior of cellular and subcellular structures in their natural context. Performing such ...

Developmental Biology

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

Bioengineering

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular level. To date the shear complexity of biological systems has caused precise single-molecule experimentation to be far too demanding, instead focusing on studies of single systems using relatively crude bulk ensemble-average measurements. However, many important processes occur in the living cell at the level of just one or a few molecules; ensemble measurements generally mask the stochastic and heterogeneous nature of these events. Here, using advanced optical microscopy and analytical image analysis tools we demonstrate how to monitor proteins within a single living bacterial cell to a precision of single molecules and how we can observe dynamics within molecular complexes in functioning biological machines. The techniques are directly relevant physiologically. They are minimally-perturbative and non-invasive to the biological sample under study and are fully attuned for investigations in living material, features not readily available to other single-molecule approaches of biophysics. In addition, the biological specimens studied all produce fluorescently-tagged protein at levels which are almost identical to the unmodified cell strains ("genomic encoding"), as opposed to the more common but less ideal approach for generating significantly more protein than would occur naturally ('plasmid expression'). Thus, the actual biological samples which will be investigated are significantly closer to the natural organisms, and therefore the observations more relevant to real physiological processes.

Visualizing Single Molecular Complexes In Vivo Using Advanced Fluorescence Microscopy

Here we demonstrate the protocols for performing single-molecule fluorescence microscopy on living bacterial cells to enable functional molecular complexes to be detected, tracked and quantified.

הדמיה מולקולרית מכלולים יחיד In vivo באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מתקדם

Full insight into the mechanisms of living cells can be achieved only by investigating the key processes that elicit and direct events at a cellular ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Three-dimensional Imaging of Bacterial Cells for Accurate Cellular Representations and Precise Protein Localization

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be affected by cell shape. Bacterial cells are three-dimensional (3D) objects, although they are rarely treated as such. Most microscopy techniques result in two-dimensional (2D) images leading to the loss of data pertaining to the actual 3D cell shape and localization of proteins. Certain shape parameters, such as Gaussian curvature (the product of the two principal curvatures), can only be measured in 3D because 2D images do not measure both principal curvatures. Additionally, not all cells lie flat when mounting and 2D imaging of curved cells may not accurately represent the shapes of these cells. Accurately measuring protein localization in 3D can help determine the spatial regulation and function of proteins. A forward convolution technique has been developed that uses the blurring function of the microscope to reconstruct 3D cell shapes and to accurately localize proteins. Here, a protocol for preparing and mounting samples for live cell imaging of bacteria in 3D both to reconstruct an accurate cell shape and to localize proteins is described. The method is based on simple sample preparation, fluorescent image acquisition, and MATLAB-based image processing. Many high-quality fluorescent microscopes can be simply modified to take these measurements. These cell reconstructions are computationally intensive and access to high-throughput computational resources is recommended, although not necessary. This method has been successfully applied to multiple bacterial species and mutants, fluorescent imaging modalities, and microscope manufacturers.

This protocol explains how to prepare and mount bacterial samples for live three-dimensional imaging and how to reconstruct the three-dimensional shape of E. coli from those images.

הדמיה תלת ממדית של תאים חיידקיים לייצוגים סלולריים מדויקים ולוקליזציה של חלבון מדויק

The shape of a bacterium is important for its physiology. Many aspects of cell physiology such as cell motility, predation, and biofilm production can be ...

Immunology and Infection

Super-resolution Imaging of the Bacterial Division Machinery

Bacterial cell division requires the coordinated assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central to this process is the formation of a ring-like suprastructure (Z-ring) by the FtsZ protein at the division plan3,4. The Z-ring consists of multiple single-stranded FtsZ protofilaments, and understanding the arrangement of the protofilaments inside the Z-ring will provide insight into the mechanism of Z-ring assembly and its function as a force generator5,6. This information has remained elusive due to current limitations in conventional fluorescence microscopy and electron microscopy. Conventional fluorescence microscopy is unable to provide a high-resolution image of the Z-ring due to the diffraction limit of light (~200 nm). Electron cryotomographic imaging has detected scattered FtsZ protofilaments in small C. crescentus cells7, but is difficult to apply to larger cells such as E. coli or B. subtilis. Here we describe the application of a super-resolution fluorescence microscopy method, Photoactivated Localization Microscopy (PALM), to quantitatively characterize the structural organization of the E. coli Z-ring8.
	PALM imaging offers both high spatial resolution (~35 nm) and specific labeling to enable unambiguous identification of target proteins. We labeled FtsZ with the photoactivatable fluorescent protein mEos2, which switches from green fluorescence (excitation = 488 nm) to red fluorescence (excitation = 561 nm) upon activation at 405 nm9. During a PALM experiment, single FtsZ-mEos2 molecules are stochastically activated and the corresponding centroid positions of the single molecules are determined with &lt;20 nm precision. A super-resolution image of the Z-ring is then reconstructed by superimposing the centroid positions of all detected FtsZ-mEos2 molecules.
	Using this method, we found that the Z-ring has a fixed width of ~100 nm and is composed of a loose bundle of FtsZ protofilaments that overlap with each other in three dimensions. These data provide a springboard for further investigations of the cell cycle dependent changes of the Z-ring10 and can be applied to other proteins of interest.

We describe a super-resolution imaging method to probe the structural organization of the bacterial FtsZ-ring, an essential apparatus for cell division. This method is based on quantitative analyses of photoactivated localization microscopy (PALM) images and can be applied to other bacterial cytoskeletal proteins.

הדמית סופר רזולוציה של מכונות אגף קטריאלי

Bacterial cell division requires the coordinated  assembly of more than ten essential proteins at midcell1,2. Central  to this process is the formation of ...

Simultaneous Multicolor Imaging of Biological Structures with Fluorescence Photoactivation Localization Microscopy

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled single molecules within a sample with a spatial resolution of tens of nanometers. Using either photoactivatable (PAFP) or&#160;photoswitchable (PSFP) fluorescent proteins fused to proteins of interest, or organic dyes conjugated to antibodies or other molecules of interest, fluorescence photoactivation localization microscopy (FPALM) can simultaneously image multiple species of molecules within single cells. By using the following approach, populations of large numbers (thousands to hundreds of thousands) of individual molecules are imaged in single cells and localized with a precision of ~10-30 nm. Data obtained can be applied to understanding the nanoscale spatial distributions of multiple protein types within a cell. One primary advantage of this technique is the dramatic increase in spatial resolution: while diffraction limits resolution to ~200-250 nm in conventional light microscopy, FPALM can image length scales more than an order of magnitude smaller. As many biological hypotheses concern the spatial relationships among different biomolecules, the improved resolution of FPALM can provide insight into questions of cellular organization which have previously been inaccessible to conventional fluorescence microscopy. In addition to detailing the methods for sample preparation and data acquisition, we here describe the optical setup for FPALM. One additional consideration for researchers wishing to do super-resolution microscopy is cost: in-house setups are significantly cheaper than most commercially available imaging machines. Limitations of this technique include the need for optimizing the labeling of molecules of interest within cell samples, and the need for post-processing software to visualize results. We here describe the use of PAFP and PSFP expression to image two protein species in fixed cells. Extension of the technique to living cells is also described.

We demonstrate the use of fluorescence photo activation localization microscopy (FPALM) to simultaneously image multiple types of fluorescently labeled molecules&#160;within cells. The techniques described yield the localization of thousands to hundreds of thousands of individual fluorescent labeled proteins, with a precision of tens of nanometers&#160;within single cells.

Localization-based super resolution microscopy can be applied to obtain a spatial map (image) of the distribution of individual fluorescently labeled ...

Combining Single-molecule Manipulation and Imaging for the Study of Protein-DNA Interactions

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method offers the opportunity of investigating interactions occurring in solution (thus avoiding problems due to closeby surfaces as in other single molecule methods), controlling the DNA extension and tracking interaction dynamics as a function of both mechanical parameters and DNA sequence. The methods for establishing successful optical trapping and nanometer localization of single molecules are illustrated. We illustrate the experimental conditions allowing the study of interaction of lactose repressor (lacI), labeled with Atto532, with a DNA molecule containing specific target sequences (operators) for LacI binding. The method allows the observation of specific interactions at the operators, as well as one-dimensional diffusion of the protein during the process of target search. The method is broadly applicable to the study of protein-DNA interactions but also to molecular motors, where control of the tension applied to the partner track polymer (for example actin or microtubules) is desirable.

Here we describe the instrumentation and methods for detecting single fluorescently-labeled protein molecules interacting with a single DNA molecule suspended between two optically trapped microspheres.

שילוב מניפולציה מולקולה בודדת והדמיה לחקר אינטראקציות החלבון-DNA

The paper describes the combination of optical tweezers and single molecule fluorescence detection for the study of protein-DNA interaction. The method ...