Name: measuring the effects of bacteria on c. elegans behavior using an egg retention assay
Uploaded: 2013-10-22T15:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay at JoVE.com

המחברים מבקשים להודות ליוני מידלטון לאספקת ה זני faecalis והדרכה עם תרבות חיידקים. ג elegans סופקו על ידי CGC, אשר ממומן על ידי NIH משרד תוכניות תשתית מחקרית (P40 OD010440).

1) הכנה של צמיחת מדיה נמטודות (NGM) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את 50 צלחות, להוסיף 1.5 גרם NaCl, 8.5 אגר ultrapure גרם, וpeptone 1.25 גרם לLflask 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 487.5 מ&quot;ל של DH 2 O לבקבוק. מערבולת בעדינות לתערובת, ולכסות את הפתח של בקבוק עם פיסת נייר אלומיניום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את הפתרון על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 מעלות צלזיוס, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון לקירור ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפתרון, להוסיף את הדברים הבאים לפי סדר: כולסטרול μl 500 ממיליליטר פתרון מניות (מומס באתנול) 5 מ&quot;ג / 1, 500 מ &#39;μl CaCl 2, 500 1 ז μl MgSO 4, וחיץ 4 12.5 מיליליטר KPO (54.15 גרם KH PO 4 ו17.8 גרם K 2 HPO 2 4 ב 500 מ&quot;ל של DH 2 O) כפי שמתואר ב18. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטפטפות סטריליים, להוסיף 10 מ&quot;ל של תמיסה אגר לכל צלחת פטרי קלקר 60 מ&quot;מ. לאפשר לתקשורת כדי לחזק בovern טמפרטורת החדרight. </li></ol> 2) הכנת מרק א &#39;ב&#39; coli מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לעשות חמש 100 מ&quot;ל תרבויות, להוסיף 5.0 גרם של Bacto tryptone, 2.5 תמצית שמרים גרם, 5.0 גרם NaCl לכוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף סטרילי מים, מזוקקים לנפח סופי של 500 מ&quot;ל. מחממים את הפתרון על צלחת חמה, תוך כדי ערבוב, עד שהמומסים שנמסו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים 100 מ&quot;ל של מרק B לחמישה בקבוקי זכוכית (לפחות 200 מ&quot;ל נפח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרשה B מרק להתקרר לטמפרטורת חדר לפני השימוש. </li></ol> 3) מתזמן ג צלחות תחזוקת elegans <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שנתן לייבוש צלחות NGM בטמפרטורת חדר למשך שבוע אחד לפחות, לחסן תרבות מרק 100 מ&quot;ל ב &#39;אחד עם כמה מושבות של א&#39; coli (OP50). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול E. תרבות coli על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אחד או שתיים טיפות פיפטה (כ 10081; L) של OP50 תרבות על מרכז כל צלחת NGM. צלחות נערמים מכסה בצד בדרך כלל למעלה. כאשר pipetting (זריעה), להתחיל על ידי pipetting התרבות לצלחת בתחתית הערימה. דרך עבודה שלך כל ערימה. נסה לא לעבור את הצלחות לאחר זריעה, כי זה חשוב שהתרבות לא להתקרב מדי לשולי הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר צלחות זרע לייבוש בטמפרטורת חדר במשך שבוע אחד לפחות לפני השימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות זורעים מאוחסנות (הפוך) בכלי פלסטיק אטומים בטמפרטורת חדר. </li></ol> 4) שמירה על ג elegans זנים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על מדושן ג מניות elegans, השתמשו תולעת לבחור לעבור שלוש L4s או מבוגרים הרה להולדת לחדשה, זורעי NGM צלחת כל 3-4 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צלחות חנות (הפוך) רצוי בתוך חממה ב 15-22 ° C. תרבויות במבחנים שתוארו היו מאוחסנות בטמפרטורה של 20 ° C. ג elegans פיתוח הוא טמפרטורה תלויה. כmaintenaNCE עולה טמפרטורה, זמן בין שלבי התפתחות יורד. </li></ol> 5) הכנת הסויה אגר (TSA) א &#39;tryptic faecalis תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך את 50 צלחות, למדוד 500 מ&quot;ל של מים סטריליים, מזוקקים לתוך בקבוק ומביא לרתיחה, תוך בחישה, על פלטה חמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 20 גרם של האבקה אגר TSA לבקבוק ולאפשר פתרון לפזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אפשר הפתרון לקירור ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בטפטפות סטריליים, להוסיף 10 מ&quot;ל של תמיסה אגר לכל צלחת פטרי קלקר 60 מ&quot;מ. לאפשר לתקשורת כדי לחזק בטמפרטורת חדר למשך לילה. </li></ol> 6) הכנת מרק סויה א tryptic (TSB) faecalis תרבות מדיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להפוך 250 צינורות תרבות, למדוד 500 מ&quot;ל של מים סטריליים, מזוקקים לתוך בקבוק וחם על פלטה חמה תוך כדי ערבוב. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 15 גרם של אבקה אגר TSB לבקבוק ולאפשר את האבקה להמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר פתרון ללהתקרר לטמפרטורת חדר, ולאחר מכן טפטפת לתוך 2 מ&quot;ל, 5 מבחנות מ&quot;ל סטרילי. </li></ol> 7) הכנה של מוח לב עירוי (BHI) מדיה, עם סטרפטומיצין, לE. תרבות faecalis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד 500 מ&quot;ל של מים סטריליים, מזוקקים לתוך בקבוק ומביא לרתיחה, תוך בחישה, על פלטה חמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 26 גרם של מדיום BHI לבקבוק ולאפשר הפתרון להמסה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעקר את פתרונות על ידי מעוקר ב תנאים סטנדרטיים (121 psi, 120 ° C, 20 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתרון יאפשר לקירור ל -45 מעלות צלזיוס באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה סטרילית, להוסיף 0.5 מ&quot;ל של פתרון מניות סטרפטומיצין 10 מ&quot;ג / מ&quot;ל ​​ומערבולת לערבב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 מ&quot;ל של הפתרון לכל צלחת פטרי קלקר 60 מ&quot;מ. </li><li&gt; תקשורת לביסוס בטמפרטורת חדר למשך לילה אפשר. צלחות חנות (הפוך) בשעת 4 ° C ועד כמה שעות לפני השימוש. </li></ol> 8) שמירה על E. זני faecalis <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור על א מניות faecalis, השתמשו בלולאת סטרילי לפס בודדות על מושבות (TSA) אגר סויה נפרדת צלחות tryptic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגדול תרבויות על 37 מעלות צלזיוס למשך הלילה. צלחות חנות (הפוך) בתיק או בקופסה אטום בטמפרטורת חדר במשך כמה שבועות. </li></ol> 9) הכנת א &#39; צלחות faecalis עבור assay EIW <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן תרבות 2 מיליליטר TSB עם מושבה של א &#39; faecalis ודגירת הלילה בשעה 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 20 של א &#39; תרבות faecalis אל מרכז צלחת BHI, סטרפטומיצין מוכן, ודגירת הלילה בשעה 37 ° C. </li></ol> 10) הכנת א &#39; צלחות coli עבור assay EIW (לוחות בקרה) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחסן B-100 מיליליטר אחתרבות ה עם מושבה של א &#39; coli OP50 ו דגירה הלילה על 37 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיפטה μl 20 של תרבות OP50 אל מרכז צלחת NGM unseeded ולאפשר את צלחות זרע לייבוש בטמפרטורת חדר למשך לילה. </li></ol> 11) ביצה ב assay תולעת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק 15 - 20 מבוים-L4 ג elegans (איור 1) על גבי מרכז מדשאה של חיידקים על BHI סטרפטוקוקוס-E. מוכן faecalis צלחת. היזהר שלא להעביר הרבה OP50 לצלחת BHI. בחר את אותו המספר של L4s לשליטת NGM-OP50 צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות עבור 40 שעות בטמפרטורה של 20 מעלות צלזיוס </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרון אקונומיקה 20%. מערבבים אקונומיקה מסחרית (6.0% נתרן היפוכלוריט) עם הנפח המתאים של מים מזוקקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 10 טיפות של μl פתרון אקונומיקה לעשרה מקומות שונים על מכסה פלסטיק (של תולעת או צלחת חיידקים). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות איסוף תולעת, תולעת להעביר אחד לכל טיפת אקונומיקה. מערבולת בעדינות את קצהלבחור בטיפת אקונומיקה כדי לוודא את התולעת יש לשטוף בסוף בחרו (לאשר על ידי הצגת אגל תחת מיקרוסקופ לנתח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר לציפורן לפזר לכ -10 דקות או עד התולעים נפתחו בסערה, לגרש את הביצים (איור 2). היזהר שלא להעביר את הביצים מהצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות מיקרוסקופ לנתח, לספור את הביצים בכל טיפה של אקונומיקה. </li></ol>

<ol>
	<li>Horvitz, H. R., Chalfie, M., Trent, C., Sulston, J. E., Evans, P. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+and+octopamine+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Serotonin and octopamine in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Science. 216, 1012-1014 (1982).</li><li>Sawin, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and cellular analysis of modulated behaviors in Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1996).</li><li>Trent, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Genetic and behavioral studies of the egg-laying system of Caenorhabditis elegans [dissertation]. , (1982).</li><li>Chase, D. L., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+analysis+of+RGS+protein+function+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic analysis of RGS protein function in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Enzymol. 389, 305-320 (2004).</li><li>Trent, C., Tsuing, N., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Egg-laying+defective+mutants+of+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">Egg-laying defective mutants of the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 104, 619-647 (1983).</li><li>Weinshenker, D., Garriga, G., Thomas, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+pharmacological+analysis+of+neurotransmitters+controlling+egg+laying+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic and pharmacological analysis of neurotransmitters controlling egg laying in Caenorhabditis elegans.</a> J. Neurosci. 15, 6975-6985 (1995).</li><li>Waggoner, L. E., Zhou, G. T., Schafer, R. W., Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Control+of+alternative+behavioral+states+by+serotonin+in+Caenorhabditis+elegans.">Control of alternative behavioral states by serotonin in Caenorhabditis elegans.</a> Neuron. 21, 203-214 (1998).</li><li>Bany, A., Dong, M., Koelle, M. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+and+cellular+basis+for+acetylcholine+inhibition+of+Caenorhabditis+elegans+egg-laying+behavior.">Genetic and cellular basis for acetylcholine inhibition of Caenorhabditis elegans egg-laying behavior.</a> J. Neurosci. 23, 8060-8069 (2003).</li><li>Dempsey, C. M., Mackenzie, S. M., Gargus, A., Blanco, G., Sze, J. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+(5HT),+fluoxetine,+imipramine+and+dopamine+target+distinct+5HT+receptor+signaling+to+modulate+Caenorhabditis+elegans+egg-laying+behavior.">Serotonin (5HT), fluoxetine, imipramine and dopamine target distinct 5HT receptor signaling to modulate Caenorhabditis elegans egg-laying behavior.</a> Genetics. 169, 1425-1436 (2005).</li><li>Leung, M. C., Williams, P. L., Bennedetto, A., Au, C., Helmcke, K. J., Aschner, M., Meyer, J. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Caenorhabditis+elegans:+an+emerging+model+in+biomedical+and+environmental+toxicology.">Caenorhabditis elegans: an emerging model in biomedical and environmental toxicology.</a> Toxicol. Sci. 106, 5-28 (2008).</li><li>Mylonakis, E., Aballay, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Worms+and+flies+as+genetically+tractable+animal+models+to+study+host-pathogen+interactions.">Worms and flies as genetically tractable animal models to study host-pathogen interactions.</a> Infect. Immun. 73, 3833-3841 (2005).</li><li>Schafer, W. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> WormBook. , (2005).</li><li>White, J., Southgate, E., Thomson, N., Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+structure+of+the+Caenorhabditis+elegans+nervous+system.">The structure of the Caenorhabditis elegans nervous system.</a> Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 314, 1-340 (1986).</li><li>Desai, C., Garriga, G., McIntire, S. L., Horvitz, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genetic+pathway+for+the+development+of+the+Caenorhabditis+elegans+HSN+motor+neurons.">A genetic pathway for the development of the Caenorhabditis elegans HSN motor neurons.</a> Nature. 336, 638-646 (1988).</li><li>Garsin, D. A., Sifri, C. D., Mylonakis, E., Qin, X., Singh, K. V., Murray, B. E., Calderwood, S. B., Ausubel, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+model+host+for+identifying+Gram-positive+virulence+factors.">A simple model host for identifying Gram-positive virulence factors.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98, 10892-10897 (2001).</li><li>Aballay, A., Yorgey, P., Ausubel, F. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salmonella+typhmurium+proliferates+and+establishes+a+persistent+infection+in+the+intestine+of+Caenorhabditis+elegans.">Salmonella typhmurium proliferates and establishes a persistent infection in the intestine of Caenorhabditis elegans.</a> Curr. Biol. 10, 1539-1542 (2000).</li><li>O'Quinn, A. L., Wiegand, E. M., Jeddeloh, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Burkholderia+pseudomallei+kills+the+nematode+Caenorhabditis+elegans+using+an+endotoxin-mediated+paralysis.">Burkholderia pseudomallei kills the nematode Caenorhabditis elegans using an endotoxin-mediated paralysis.</a> Cell. Microbiol. 3, 381-393 (2001).</li><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetics+of+Caenorhabditis+elegans.">Genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77, 71-94 (1974).</li><li>Harvey, S. C., Shorto, A., Orbidans, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+genetic+analysis+of+life-+history+traits+of+Caenorhabditis+elegans+in+stressful+environments.">Quantitative genetic analysis of life- history traits of Caenorhabditis elegans in stressful environments.</a> BMC Evol. Biol. 8, 15 (2008).</li><li>Harvey, S. C., Orbidans, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=All+eggs+are+not+equal:+the+maternal+environment+affects+progeny+reproduction+and+developmental+fate+in+Caenorhabditis+elegans.">All eggs are not equal: the maternal environment affects progeny reproduction and developmental fate in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS One. 6, e25840 (2011).</li><li>Klass MR, . <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aging+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans:+major+biological+and+environmental+factors+influencing+life+span.">Aging in the nematode Caenorhabditis elegans: major biological and environmental factors influencing life span.</a> Mech. Ageing. Dev. 6, 413-429 (1977).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

השלבים הקריטיים ביותר בביצוע assay זה בהצלחה הם: 1) באמצעות מניות מדושנות של ג elegans, 2) culturing סוגים בודדים של חיידקים בצלחת assay, 3) זיהוי מדויק מבוים L4 תולעים לחשיפה לE. faecalis, 4) שמירה על זמן החשיפה לE. faecalis עקבי בכל הניסויים ו 5) הלבנת זמן שלא יעלה על עשר דקות כדי למנוע התפוררות ביצה. עבור assay זה חשוב להרים תולעים בריאים, מדושנים. הרעבה מצד האם יכולה להשפיע על פוריות וצמיחה של צאצאים 19,20, ולכן חשוב שתולעים כבר ניזונים היטב במשך כמה דורות לפני ביצוע assay זה. מניית מדושנת של תולעים נשמר בקלות פשוט על ידי העברה כמה תולעים בוגרות לצלחת NGM seeded חדשה כל 2-3 ימים. יומיים לפני assay, תולעים בוגרות צריכים להיות ממוקמים על דשא טרי של OP50 כדי שיהיו צאצאי L4 מספיקים זמינים עבור assay. &lt;כיתת p = &quot;jove_content&quot;&gt; כמו כן, חשוב שצלחות assay EIW לקדם את הצמיחה של רק סוג אחד של חיידקים. א זני faecalis גדלו על צלחות BHI. סטרפטומיצין התווסף לצלחות כדי לבחור נגד א &#39; coli OP50, אשר הועבר עם L4 תולעים כפי שהם מועברים מצלחות NGM תחזוקה לצלחות assay. OP50 גם גדל על צלחות BHI. אם לא נבחר נגד, ג elegans היה מאכיל בשני סוגים של חיידקים (E. coli וא &#39;faecalis) ואילו על צלחות BHI. הזנים של E. faecalis משמש assay זה עמידים בפני סטרפטומיצין. אם סוגים שונים של חיידקים ששימשו לassay זה, אנטיביוטיקה שונה, ותקשורת בתרבות שונה אולי, יש להשתמש כדי לבחור עבור החיידקים של בחירה ונגד א &#39; coli OP50. בחירה מדויקת מבוימת תולעים לassay זה היא קריטי מכמה סיבות. ראשית, חשוב לספור שימור ביצה במהלך t<html> הזמן הוא של ייצור ביצים / הנחת בג דישון עצמי elegans. ייצור ביצים מתרחש רק במהלך חמישה הימים הראשונים של ג הבגרות elegans (שהגיע לשיא סביב 40 שעות לאחר L4) ולאחר מכן במהירות יורדת 4,21. תולעים בוגרות גרות בממוצע של שבועות עד שלושה שבועות, תולעים בוגרות רבות כל כך לחיות במשך שבוע לפחות ואילו אינו מייצרות ביציות מופרות. לכן, חשוב לוודא כי assay EIW אינו מבוצע על תולעים בוגרות unstaged גיל לא ידוע. הסיבה השנייה חשוב להשתמש בבעלי חיים במבוימים assay EIW הוא כל כך שהזמן בפיתוח שבה היו חשופים לתולעים את החיידקים, רעל או תרופה לפיקוח הדוק. תרבויות של ג elegans מסונכרן בדרך כלל בביצה, L1 או L4 שלבים. שלב L4 שימש לassay זה בגלל החשש שחשיפה ארוכה יותר לE. faecalis יביא קטלני לפני תולעים הפכו מבוגרים הרה להולדת. האוהל &quot;&gt; משך זמן תולעים נשארים בתמיסת כלור הוא גם חשוב כדי לפקח. תולעים בדרך כלל צריך לפזר בפחות מעשר דקות, אם כי פעם זה משתנה מתולעת לתולעת. ביצים מופרות סופו של דבר התפרקו על ידי אקונומיקה, אבל התהליך הוא איטי יותר מאשר לציפורן בשל הנוכחות של קליפת ביצה מגן. קליפת הביצה תתחיל להיות מומסת על ידי אקונומיקה, אם נשאר בפתרון ליותר מ 10-15 דקות. שימור ביצה משקף את האיזון בין ייצור ביצים ונחת ביצה. Assay EIW לבד אינו מבחין בין מספר ביצי עודפים ברחם הוא עקב שינויים בייצור ביצים, או הנחת ביצה. הדבר נכון במיוחד אם חשש תולעים שטופלו בזן חיידקים או רעלן לשמר פחות ביצים מאלו בקבוצת הביקורת. במקרים אלה במיוחד, צריך להיעשות assay גודל להרהר מעקב. מבחני גודל Brood לכמת את מספר הביצים שהונחו מעל 4 החיים הרבייה של התולעת </sup&gt;. אם גודל הגוזלים של תולעים בקבוצות הניסוי ובקרה זהה, ולאחר מכן ניתן לייחס הבדלים בשייר ביצה להבדלים בנחת ביצת התנהגות. מאחר שלא סביר כי זני חיידקים פתוגניים מעטה כמו א &#39; faecalis יפעל להגדלת ייצור ביצים, סביר להניח שגידול בשייר ביצה לאחר החשיפה לE. faecalis (כפי שניתן לראות באיור 3) הוא תוצאה של ירידה בהתנהגות הטלת ביצים. Assay EIW גם אינו קובע את המנגנון שבאמצעותו חיידקים עשויים לשנות שימור ביצה. יתכן כי ג elegans עשוי לשמור ביצים משום שהחיידקים פתוגניים משפיעים האכלה על ידי מיישב ובחוסם את פתח הפה או משום שהוא מקור מזון ירוד. ייתכן גם כי החיידקים עשויים ליישב ולחסום את הפתח הפות, או להשפיע על התפקוד של תאים במערכת הטלת ביצים. ניתוח נוסף נדרש על מנת לקבוע את המנגנון שבאמצעות WHIשימור ביצת CH משתנה. ניתן לשנות זאת בקלות EIW assay כדי לקבוע את ההשפעות של סוגים רבים של תרכובות בשייר ביצה. בנוסף, assay זה הוא די פשוט כי זה יכול להיות משולב בתוך מסך לזיהוי גנים, בכל שורה (סי אלגנס) או הפתוגן (E. faecalis), הנדרשת להשפעה של הפתוגן. Assay EIW יכול לשמש גם למסך לגנים הנדרשים להסדרת הטלה עצמו. ג התנהגות הטלת ביצי elegans היא מווסת על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון סרוטונין ואצטילכולין 5-9, ודורשת פעולה מתואמת של מספר תאי עצב וקבוצות שרירים 12. מבחני EIW היו וימשיכו להיות בשימוש כדי לזהות גנים חשובים לאיתות העצבית ו / או פעילות שרירים. מבחני EIW לספק כמותית, ולא איכותי, ניתוח של ג חשוב elegans התנהגות.

Caenorhabditis elegans, תולעת עגולה מיקרוסקופית, נטול חיים, היא אורגניזם מודל משמש באופן מסורתי כדי ללמוד תהליכים התפתחותיים ואיתות תא בגלל האנטומיה שלו שקופה, הפיתוח מאופיין היטב, מלא ברצף הגנום, דור בזמן הקצר, וההומולוגיה גנטית לבני אדם . לאחרונה, ג elegans הפך אורגניזם מודל בתחום הרעלים סביבתיים ומולדת חסינות 10, 11. תולעי hermaphroditic דישון עצמי האלה הפכו לבגרות מינית בתוך שנים עד שלושה ימים מיום הבקיעה מן הביצה. במהלך מחזור החיים שלו, ג elegans עובר דרך ארבעה שלבי זחל (L1-L4), לפני שהגיע לבגרות. אחד המבודד אנדרוגינוס יכול לייצר, בממוצע, 300 צאצאים בתוך שלושה ימים של פוריות שיא. בreproductively הבוגר ג elegans הרמפרודיטים, ביצים מופרות נשמרות בתוך הרחם במשך כמה שעות לפני שהניחו.מספר הרגיל של ביצים מאוחסנות ברחם בכל זמן נתון (בשיא פוריות) הוא 12 בין עשרה לחמש עשר. מספר הביצים ברחם הוא פונקציה של שניהם בקצב ייצור של ביצה והשיעור של הנחת ביצה. ביצים מופרות הם גורשו מן הרחם על ידי התכווצות שרירי פות של שישה עשר מסודרים סביב הפתיחה של הפות 13. motorneurons הרמפרודיט הספציפי (HSN של) וסינפסה VC motorneurons על שרירי פות המשפיעים התכווצות שרירים ובכך הטלה התנהגות 5,7,13,14. גירוש של ביצים מהרחם מתרחש עקב פעילות מתואמת של נוירונים ושרירים. תרבויות מעבדה של ג elegans גדלים בדרך כלל בדיאטה של nonpathogenic חיידקי Escherichia OP50. בסביבה הטבעית, ג elegans בא במגע עם מגוון רחב של מקורות מזון, כגון חיידקים פתוגניים, שיכול להיות מזיק. בעת חשיפה לחומרים מזיקים בהסביבה, ג elegans לשמור על ביצים עד שהסביבה הופכת להיות חיובית יותר. יש להניח שימור ביצה זו הוא מאמץ כדי להגן על הצאצאים שלהם. בביצה זה בתולעת (EIW) assay, ג elegans חשוף לחיידקים פתוגניים פוטנציאל, אנטרוקוקוס faecalis, שנמצא בסביבה. חשיפה לצורות פתוגניים של א &#39; faecalis יכול לגרום לדלקת מעיים מתמשכת ואף למוות בג elegans 15. חשיפה לצורות אחרות של חיידקים פתוגניים הוכח להשפיע שימור ביצת 16,17, עם זאת ההשפעה לא לכמת. בנוסף, ההשפעה של מתינות פתוגניים זנים של E. faecalis, זנים שאינם קטלניים באופן מיידי, על התנהגות הטלת ביצים לא נחקרו. מבחני EIW כרוכים לספור את מספר הביצים נשמרים ברחם של ג elegans 4. למרות שג elegansהם שקופים, ביצים מצטברות ברחם יכולות להיות קשים לכמת בבעלי חיים בשלמותה. Assay EIW כרוך הלבנת ההרה המבוגר ג elegans שנחשפו לחיידקים לתקופה קצובה של זמן. פתרון אקונומיקה ממסים את הציפורן החיצונית עוזב את הביצים מאחור. את הביצים הן שבירה להשפעות של אקונומיקה בשל הנוכחות של קליפת ביצה מגן. אחרי הלבנה, אחד היא בקלות רבה תוכל לספור את מספר הביצים ששוחררו מהרחם של התולעים על הלבנת. Assay תאר הוא שיטה פשוטה וזולה, ומהירה לכמת את מספר הביצים ברחם בזמן אחד, ובכך לכמת את ההשפעות של א &#39; faecalis בשייר ביצה. assay זה יכול לשמש כדי לכמת את ההשפעה של סוגים אחרים של חיידקים, רעלים סביבתיים או תרופות בשייר ביצה. assay זה גם יש לו הפוטנציאל לשמש כמסך לpathogenicity חיידקים.

<table><tbody><tr><td>Agar, ultrapure</td><td>Affymetrix</td><td>10906</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Peptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211677</td><td></td></tr><tr><td>Bacto Tryptone</td><td>Becton Dickinson</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>Brain Heart Infusion dehydrated medium</td><td>Carolina Biological Supply</td><td>781781</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;, N2 strain</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Alfa Aesar</td><td>A11470</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates for &lt;em&gt;C. elegans&lt;/em&gt;</td><td>Tritech Research Inc.</td><td>T3308</td><td></td></tr><tr><td>Culture plates for &lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt;</td><td>Fisher Scientific-Fisherbrand</td><td>875713</td><td></td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. coli &lt;/em&gt;(OP50)</td><td>Caenorhabditis Genetics Center</td><td></td><td>http://www.cbs.umn.edu/cgc</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;E. faecalis&lt;/em&gt; strains</td><td></td><td></td><td>provided by J. Middleton. All isolates were confirmed as enterococci</td></tr><tr><td colspan="4">by observing growth on enterococcosel agar (BBL) and in 6% NaCl broth;</td></tr><tr><td colspan="4"> &lt;p&gt;all strains grew at 44.5 &amp;ordm;C and were catalase negative and hydrolyzed esculin. A simplified&amp;nbsp;&lt;span style=&quot;line-height: 1.6em;&quot;&gt;dichotomous key based on pigmentation and fermentation reactions for six sugars&amp;nbsp;&lt;/span&gt;&lt;span style=&quot;line-height: 1.6em;&quot;&gt;(arabinose, mannitol, methyl-&amp;alpha;-D-glucopyranoside (MGP), ribose, sorbose and sorbitol) allowed&amp;nbsp;&lt;/span&gt;&lt;span style=&quot;line-height: 1.6em;&quot;&gt;presumptive identification of all &lt;em&gt;E&lt;/em&gt;. &lt;em&gt;faecalis&lt;/em&gt; strains (Efs lacks pigmentation and is arabinose, MGP&amp;nbsp;&lt;/span&gt;&lt;span style=&quot;line-height: 1.6em;&quot;&gt;and sorbose negative and sorbitol, mannitol and ribose positive). All presumptive Efs strains&amp;nbsp;&lt;/span&gt;&lt;span style=&quot;line-height: 1.6em;&quot;&gt;were confirmed using the API 20 STREP system (Biomerieux).&lt;/span&gt;&lt;/p&gt; </td></tr><tr><td>Microscope</td><td>Motic</td><td>SMZ 168B</td><td>any microscope with transmitted illumination and 50X magnification should be sufficient</td></tr><tr><td>Streptomycin sulfate</td><td>Fisher BioReagents</td><td>BP910-50</td><td></td></tr><tr><td>Tryptic Soy Agar (Soybean-Casein Digest Agar Medium), Difco</td><td>Becton Dickinson</td><td>236950</td><td></td></tr><tr><td>Trypticase Soy Broth (Soybean-Casein Digest Medium), BBL</td><td>Becton Dickinson</td><td>211768</td><td></td></tr><tr><td>Yeast extract</td><td>Acros</td><td>61180-1000</td><td></td></tr></tbody></table>

measuring the effects of bacteria on c. elegans behavior using an egg retention assay

התנהגות הטלת ביצי סי אלגנס מושפעת רמזים סביבתיים כגון osmolarity 1 ורטט 2. בהיעדר המוחלט של מזון ג elegans גם יחדל הטלת ביצים ולשמר את ביציות מופרות ברחם 3 שלהם. עם זאת, ההשפעה של מקורות שונים של מזון, בעיקר חיידקים פתוגניים ובעיקר אנטרוקוקוס faecalis, על התנהגות הטלת ביצים לא מאופיינת היטב. ביצה בתולעת assay (EIW) הוא כלי שימושי כדי לכמת את ההשפעות של סוגים שונים של חיידקים, במקרה זה א faecalis, על התנהגות הטלת ביצים. מבחני EIW כרוכים לספור את מספר הביצים נשמרים ברחם של ג elegans 4. Assay EIW כרוך הלבנת מבוימת, הרה המבוגר ג elegans כדי להסיר את העור המת ולהפריד את ביצי עודפים מבעלי החיים. לפני הלבנת, תולעים חשופים לחיידקים (או כל סוג של אות סביבתית) לתקופה קצובה של זמן. אחרי הלבנה, אחד היא בקלות רבה תוכל לספור את מספר ביצי עודפים בתוך הרחם של התולעים. ב assay זה, גידול בשייר כימות ביצה לאחר E. ניתן למדוד את חשיפת faecalis בקלות. Assay assay EIW הוא התנהגות שעשויה לשמש מסך לפוטנציאל חיידקים פתוגניים או הנוכחות של רעלים סביבתיים. בנוסף, assay EIW עשוי להיות כלי למסך לתרופות המשפיעות על נוירוטרנסמיטר איתות מאז התנהגות הטלת ביצים היא מווסתת על ידי נוירוטרנסמיטרים כגון סרוטונין ואצטילכולין 5-9.

assay זה מאפשר לכמת את מספר הביצים נשמרות בתוך ג elegans לאחר החשיפה לE. faecalis. L4 מבוים תולעים (מאופיין בחלל פתוח שקוף מעל הפות שלהם, איור 1) נחשפו לE. faecalis דרך הבגרות. לאחר ארבעים שעות של חשיפה לE. faecalis, הלבנת בוצעה. כציפורן התפוררה בטיפת אקונומיקה, את הביצים התבררו יותר (איור 2). מספר ביצי עודפים היה לכמת בקלות על ידי ספירה בעת הצגה תחת מיקרוסקופ לנתח. עוד ביצים נשמרות בנוכחותו של א &#39; זני faecalis נבדקו, בהשוואה ל E. coli OP50 בקרות (איור 3). יש איזו וריאציה בהשפעה של כל זן אחד של א &#39; faecalis על תולעים בודדים, כפי שניתן לראות מסרגל השגיאות. עם זאת, ההשפעה של זנים של E. faecalis בשייר ביצה בתוךאוכלוסייה של תולעים אינה משתנה באופן משמעותי מקבוצת הביקורת. מידת שמירת ביצה שהושרו על ידי זנים של א &#39;שונים faecalis הנבדק עשויים גם להשתנות. השפעה מגוונת זה עשויה להיות בשל לביטוי של גורמים ארסיות שונים בכל זן. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51203/51203fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51203/51203fig1.jpg" /> איור 1. זיהוי L4 מבוים ג elegans. א. L4 השלב ג זחלי elegans הם הווה הזחלים הגדול ביותר על צלחות בלבד קצרה יותר במקצת באורך יותר מתולעים בוגרות. L4s הם דקים יותר מאשר במבוגרים, כמו גם, בשל היעדר ביצי עודפים (ההופך את התולעים בוגרות מעט רחבה יותר). לינה. לאחר זיהוי זחלים אלה שהם מעט קצרים יותר מאשר מבוגרים, L4-מבוים ג elegans מזוהה יותר על ידי נקודת חצי הירח בהירה ממוקמת באמצע הגוף שלהם (ראשי חץ שחורים). נקודה זו היא גלויה בזחלים קטנים (L2 L3 ושלבים), אבל הוא נעדר במבוגר. כל התמונות נלקחו מתולעים על צלחות NGM, עם מצלמה מותקנת על מיקרוסקופ לנתח (הגדלה 40X 50X ועבור A ו-B, בהתאמה). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51203/51203fig1highres.jpg">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51203/51203fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51203/51203fig2.jpg" /> איור 2. פתרון אקונומיקה מתמוסס ג elegans ציפורן לאורך זמן. תולעת בוגרת מבוימת ממוקמת בטיפה של תמיסת כלור (). במשך חמש עד עשר דקות, לציפורן של התולעת מתחילה להתמוסס (BF). כפי שרוב הציפורן נמס, את הביצים להיות גלויות (F חיצים שחורים). מאגרי שומן בתוך als התולעת<html> o לפזר לאט באקונומיקה, ותישאר גלוי (F, חיצים אפורים). כל התמונות נלקחו מתולעים על צלחות NGM, עם מצלמה מותקנת על מיקרוסקופ לנתח (40X). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/51203/51203fig2highres.jpg">לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/51203/51203fig3.jpg" src="/files/ftp_upload/51203/51203fig3.jpg" /> איור 3. א חלק זני faecalis לגרום לשמירת ביצית גדלה לאחר 40 שעות של חשיפה. תולעים שנחשפו לשניים מהשש א &#39; faecalis זנים (ברים כתומים) הראו רמה מוגברת של שימור ביצה בהשוואה לתולעים האכילו E. coli (OP50) מתח ביקורת (סורגים כחולים). עשרה תולעים הואכלו כל זן חיידקים בכל ניסוי. ניסויים נעשו בשלושה עותקים בימים שונים. * מציין p &lt;0.05 (מבחן t של סטודנט).&quot;&gt; לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

Watch this Scientific Journal Video about Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay at JoVE.com

מדידת ההשפעות של חיידקים על התנהגות C. Elegans באמצעות בדיקת שימור ביציות | ביולוגיה | וִידֵאוֹ

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

ביצה בתולעת assay (EIW) הוא שיטה יעילה לכמת-הטלת התנהגות. שינויים בנחת ביצה יכולים להיות תגובה התנהגותית של האורגניזם המודל<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em&gt; לחומרים מזיקים סביבתיים כגון אלה המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים.

מדידת ההשפעות של חיידקים על<em&gt; ג Elegans</em&gt; התנהגות באמצעות Assay שימור ביצה

C. elegans egg-laying behavior is  affected by environmental cues such as osmolarity1 and  vibration2. In the total absence of food C. elegans also cease ...

measuring-effects-bacteria-on-c-elegans-behavior-using-an-egg

Universidad San Sebastian

Research

Education

JoVE Journal

JoVE Core

Biology

Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

Ecology

Behavior

SCIENTISTS IN ACTION

17.0K Views.  Fairleigh Dickinson University. ביצה בתולעת assay (EIW) הוא שיטה יעילה לכמת-הטלת התנהגות. שינויים בנחת ביצה יכולים להיות תגובה התנהגותית של האורגניזם המודל Elegans Caenorhabditis לחומרים מזיקים סביבתיים כגון אלה המיוצרים על ידי חיידקים פתוגניים.

Video: Measuring the Effects of Bacteria on C. Elegans Behavior Using an Egg Retention Assay

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the intestine the primary location for disease. The nematode intestine structurally and functionally mimics mammalian intestines and is transparent making it amenable to microscopic study of colonization. Here we show that pathogens can cause disease and death. We are able to identify microbial mutants that show altered virulence. Its conserved innate response to biotic stresses makes C. elegans an excellent system to probe facets of host innate immune interactions. We show that hosts with mutations in the dual oxidase gene cannot produce reactive oxygen species and are unable to resist microbial insult. We further demonstrate the versatility of the presented survival assay by showing that it can be used to study the effects of inhibitors of microbial growth. This assay may also be used to discover fungal virulence factors as targets for the development of novel antifungal agents, as well as provide an opportunity to further uncover host-microbe interactions. The design of this assay lends itself well to high throughput whole-genome screens, while the ability to cryo-preserve worms for future use makes it a cost-effective and attractive whole animal model to study.

The Nematode Caenorhabditis Elegans - A Versatile In Vivo Model to Study Host-microbe Interactions

Here, we present the nematode Caenorhabditis elegans as a versatile host model to study microbial interaction.

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

We demonstrate a method using Caenorhabditis elegans as a model host to study microbial interaction. Microbes are introduced via the diet making the ...

Genetics

Automated Analysis of a Nematode Population-based Chemosensory Preference Assay

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection of the neural circuits underlying these behaviors, the development of robust and reproducible behavioral assays is necessary. Previous C. elegans behavioral studies have used variations of a "drop test", a "chemotaxis assay", and a "retention assay" to investigate the response of C. elegans to soluble compounds. The method described in this article seeks to combine the complementary strengths of the three aforementioned assays. Briefly, a small circle in the middle of each assay plate is divided into four quadrants with the control and experimental solutions alternately placed. After the addition of the worms, the assay plates are loaded into a behavior chamber where microscope cameras record the worms' encounters with the treated regions. Automated video analysis is then performed and a preference index (PI) value for each video is generated. The video acquisition and automated analysis features of this method minimizes the experimenter's involvement and any associated errors. Furthermore, minute amounts of the experimental compound are used per assay and the behavior chamber's multi-camera setup increases experimental throughput. This method is particularly useful for conducting behavioral screens of genetic mutants and novel chemical compounds. However, this method is not appropriate for studying stimulus gradient navigation due to the close proximity of the control and experimental solution regions. It should also not be used when only a small population of worms is available. While suitable for assaying responses only to soluble compounds in its current form, this method can be easily modified to accommodate multimodal sensory interaction and optogenetic studies. This method can also be adapted to assay the chemosensory responses of other nematode species.

We present a behavior recording setup and protocol that enables automated analysis of the nematode, Caenorhabditis elegans' preference for soluble compounds in a population-based assay. This article describes the construction of a behavior chamber, the behavioral assay protocol, and video analysis software usage.

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

The nematode, Caenorhabditis elegans' compact nervous system of only 302 neurons underlies a diverse repertoire of behaviors. To facilitate the dissection ...

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the development of more effective treatments is the relative lack of understanding of the molecular underpinnings of the effects of ethanol on behavior. The nematode, Caenorhabditis elegans (C.&#160;elegans), provides a useful model in which to generate and test hypotheses about the molecular effects of ethanol. Here, we describe an assay that has been developed and used to examine the roles of particular genes and environmental factors in behavioral responses to ethanol, in which locomotion is the behavioral output. Ethanol dose-dependently causes an acute depression of crawling on an agar surface. The effects are dynamic; animals exposed to a high concentration demonstrate an initial strong depression of crawling, referred to here as initial sensitivity, and then partially recover locomotion speed despite the continued presence of the drug. This ethanol-induced behavioral plasticity is referred to here as the development of acute functional tolerance. This assay has been used to demonstrate that these two phenotypes are distinct and genetically separable. The straightforward locomotion assay described here is suitable for examining the effects of both genetic and environmental manipulations on these acute behavioral responses to ethanol in C.&#160;elegans.

An Assay for Measuring the Effects of Ethanol on the Locomotion Speed of Caenorhabditis elegans

C. elegans is a useful model for studying the effects of ethanol on behavior. We present a behavioral assay that quantifies the effects of ethanol on the locomotion speed of crawling worms; both initial sensitivity and the development of acute functional tolerance to ethanol can be measured with this assay.

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Alcohol use disorders are a significant public health concern, for which there are few effective treatment strategies. One difficulty that has delayed the ...

Neuroscience

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A non-mammalian soil round worm, Caenorhabditis elegans, is a valuable model organism for toxicology studies due to its convenience and lack of animal ethics issues compared with mammalian animal systems. In this protocol, a detailed procedure of toxicological evaluation of chemicals in C. elegans is described. A clinical anticancer drug, etoposide, which targets human topoisomerase II and inhibits DNA replication of human cancer cells, was selected as a model testing chemical. Age-synchronized C. elegans eggs were exposed to either dimethyl sulfoxide (DMSO) or etoposide, and then the growth of C. elegans was monitored every day for 4 days by the stereo microscope observation. The total number of eggs laid from C. elegans treated with DMSO or etoposide was also counted by using the stereo microscope. Etoposide treatment significantly affected the growth and reproduction of C. elegans. By comparison of the total number of eggs laid from worms with different treatment periods of chemicals, it can be decided that the reproductive toxicity of chemicals on C. elegans reproduction is reversible or irreversible. These protocols may be helpful for both the development of various drugs and risk assessment of environmental toxicants.

Measuring the Effect of Chemicals on the Growth and Reproduction of Caenorhabditis elegans

A basic protocol to evaluate the toxicity of chemicals in a model animal, Caenorhabditis elegans, is described. The method is convenient and useful for the development of pharmaceuticals as well as for the risk assessment of various environmental pollutants.

מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

Toxicological evaluation is crucial for understanding the effects of chemicals on living organisms in basic and applied biological science fields. A ...

Medicine

C. elegans Chemotaxis Assay

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates. Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis behavior.
 The premise behind testing the response of the worms to an odorant is to place them in an area and observe the movement evoked in response to an odorant. Even with the many available assays, optimizing worm starting location relative to both the control and test areas, while minimizing the interaction of worms with each other, while maintaining a significant sample size remains a work in progress 1-10. The method described here aims to address these issues by modifying the assay developed by Bargmann et al.1. A Petri dish is divided into four quadrants, two opposite quadrants marked "Test" and two are designated "Control". Anesthetic is placed in all test and control sites. The worms are placed in the center of the plate with a circle marked around the origin to ensure that non-motile worms will be ignored. Utilizing a four-quadrant system rather than one 2 or two 1 eliminates bias in the movement of the worms, as they are equidistant from test and control samples, regardless of which side of the origin they began. This circumvents the problem of worms being forced to travel through a cluster of other worms to respond to an odorant, which can delay worms or force them to take a more circuitous route, yielding an incorrect interpretation of their intended path. This method also shows practical advantages by having a larger sample size and allowing the researcher to run the assay unattended and score the worms once the allotted time has expired.

C. elegans Chemotaxis Assay

A method of quantitatively evaluating the chemotactic response of Caenorhabditis elegans is described. A chemotactic index (CI) was employed as a way to precisely evaluate the response of worms to certain targets, and serve as a platform of comparison between strains and compounds of interest.

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Many organisms use chemotaxis to seek out food sources, avoid noxious substances, and find mates.  Caenorhabditis elegans has impressive chemotaxis ...

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the function and regulation of protein folding was studied in vitro, in isolated tissue culture cells and in unicellular organisms. Recent studies have uncovered links between protein homeostasis (proteostasis), metabolism, development, aging, and temperature-sensing. These findings have led to the development of new tools for monitoring protein folding in the model metazoan organism Caenorhabditis elegans. In our laboratory, we combine behavioral assays, imaging and biochemical approaches using temperature-sensitive or naturally occurring metastable proteins as sensors of the folding environment to monitor protein misfolding. Behavioral assays that are associated with the misfolding of a specific protein provide a simple and powerful readout for protein folding, allowing for the fast screening of genes and conditions that modulate folding. Likewise, such misfolding can be associated with protein mislocalization in the cell. Monitoring protein localization can, therefore, highlight changes in cellular folding capacity occurring in different tissues, at various stages of development and in the face of changing conditions. Finally, using biochemical tools ex vivo, we can directly monitor protein stability and conformation. Thus, by combining behavioral assays, imaging and biochemical techniques, we are able to monitor protein misfolding at the resolution of the organism, the cell, and the protein, respectively.

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

To study the relationship between protein homeostasis, stress and aging, we monitored changes in protein folding by following protein dysfunction, protein localization in the cell and protein stability at the organismal, cellular and protein levels, using the genetically tractable metazoan Caenorhabditis elegans as a model system.

The folding and assembly of proteins is essential for protein function, the long-term health of the cell, and longevity of the organism. Historically, the ...

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, sequester or eliminate damaged proteins to maintain a healthy proteome, thus ensuring cellular proteostasis and preventing further protein damage. Because of redundant functions within the proteostasis network, screening for detectable phenotypes using knockdown or mutations in chaperone-encoding genes in the multicellular organism Caenorhabditis elegans results in the detection of minor or no phenotypes in most cases. We have developed a targeted screening strategy to identify chaperones required for a specific function and thus bridge the gap between phenotype and function. Specifically, we monitor novel chaperone interactions using RNAi synthetic interaction screens, knocking-down chaperone expression, one chaperone at a time, in animals carrying a mutation in a chaperone-encoding gene or over-expressing a chaperone of interest. By disrupting two chaperones that individually present no gross phenotype, we can identify chaperones that aggravate or expose a specific phenotype when both perturbed. We demonstrate that this approach can identify specific sets of chaperones that function together to modulate the folding of a protein or protein complexes associated with a given phenotype.

Using Caenorhabditis elegans to Screen for Tissue-Specific Chaperone Interactions

To study chaperone-chaperone and chaperone-substrate interactions, we perform synthetic interaction screens in Caenorhabditis elegans using RNA interference in combination with mild mutations or over-expression of chaperones and monitor tissue-specific protein dysfunction at the organismal level.

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

Correct folding and assembly of proteins and protein complexes are essential for cellular function. Cells employ quality control pathways that correct, ...

השבתה מטבולית חיידקית ב Caenorhabditis elegans באמצעות Paraformaldehyde

Methodology to Metabolically Inactivate Bacteria for Caenorhabditis elegans Research

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a diet of live bacteria, the metabolic activity of their food source can confound experiments looking for the direct effects of various interventions on the worm. To avoid the confounding effects of bacterial metabolism, C. elegans researchers have used multiple methods to metabolically inactivate bacteria, including ultraviolet (UV)-irradiation, heat-killing, and antibiotics. UV treatment is relatively low-throughput and cannot be used in liquid culture because each plate must be examined for successful bacterial killing. A second treatment method, heat-killing, negatively affects the texture and nutritional quality of the bacteria, leading to the developmental arrest of C. elegans. Finally, antibiotic treatment can directly alter C. elegans physiology in addition to preventing bacterial growth. This manuscript describes an alternative method to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde (PFA). PFA treatment cross-links proteins within bacterial cells to prevent metabolic activity while preserving cellular structure and nutritional content. This method is high-throughput and can be used in liquid culture or solid plates, as testing one plate of PFA-treated bacteria for growth validates the whole batch. Metabolic inactivation through PFA treatment can be used to eliminate the confounding effects of bacterial metabolism on studies of drug or metabolite supplementation, stress resistance, metabolomics, and behavior in C. elegans.

מחבר זרקור: קידום מחקר Caenorhabditis elegans באמצעות חיידקים שטופלו בפרפורמאלדהיד 

The food source for Caenorhabditis elegans in the lab is live Escherichia coli. Since bacteria are metabolically active, they present a confounding variable in metabolic and drug studies in C. elegans. A detailed protocol to metabolically inactivate bacteria using paraformaldehyde is described here.

מתודולוגיה להשבתה מטבולית של חיידקים למחקר Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is a common model organism for research in genetics, development, aging, metabolism, and behavior. Because C. elegans consume a ...

מדידת ההשפעות של חיידקים על

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

נמטודות. Caenorhabditis Elegans - מודל רב תכליתי In Vivo ללמוד אינטראקציות מארח-חיידק

ניתוח אוטומטי של אוכלוסיה מבוססת נמטודות מבוססי Assay העדפה

Assay למדידת ההשפעות של אתנול במהירות התנועה של

א

מדידת אפקט של כימיקלים על גדילה, רבייה של Caenorhabditis elegans

Assay Chemotaxis סי אלגנס

Using Caenorhabditis elegans as a Model System to Study Protein Homeostasis in a Multicellular Organism

שימוש באלגנים של Caenorhabditis למסך עבור אינטראקציות ממלווים ספציפיות לרקמות

מתודולוגיה להשבתה מטבולית של חיידקים למחקר Caenorhabditis elegans

מתודולוגיה להשבתה מטבולית של חיידקים למחקר Caenorhabditis elegans