מתקני PLATIM וDroso כלים של UMS3444 Biosciences, ליון, צרפת. המחקר של BM נתמכה על ידי מענקים מFondation לשפוך la משוכלל ונדיר Médicale מCNRS (ATIP) וANR-12-BSV1-0,019-01. פ&quot;ד נתמכה על ידי רשתית צרפת עמותה ואקול נורמל סופרייר בליון (צרפת). CL נתמכה על ידי La Ligue Nationale contre le סרטן עמותה.

1. חציית קווים עם העגבניות / GFP-FLP / FRT הדור של זבובים שנשאו את המוטציה השיבוט דורש צלב יחיד בין קו המוטציה נושאת FRT והעגבניות / GFP-FLP / FRT המתאימה לטוס קו. עבודה זו מנוצל אוסף BruinFly של מוטציות recombined-FRT <a href="http://www.bruinfly.ucla.edu" target="_blank">(http://www.bruinfly.ucla.edu).</a> ניתן להשתמש בו ארבעה קווי העגבניות / GFP-FLP / FRT, נושאים FRT RH1-tdtomatoninaC על כל זרועותיה של 2 ו -3 בכרומוזומים בשילוב עם מקור flipase (אי-FLP) וביטוי של ה-GFP בכל הפורטוריקנים החיצוניים (כטב&quot;מ RH1-Gal4 -GFP) 20: - זרוע 2L: קו # 43,345, P {ר&quot;י [+ t7.2] RH1-GAL4 =} 1, P {ר&quot;י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {w [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2L P {ר&quot;י [+ t7.2] = neoFRT} 40A, P {ר [+ MC] = כטב&quot;מ-GFP-ninaC} 3 - זרוע 2R: קו # 43,346, P {ר&quot;י [+ t7.2] = RH1-GAL4} 1, P {ר&quot;י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {ר&quot;י [T7.2 +] = neoFRT} 42d P{ר [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 2R, P {ר [+ MC] = כטב&quot;מ-GFP-ninaC} 3 - זרוע 3L: קו # 43347, P {ר&quot;י [+ t7.2] RH1-GAL4 =} 1, P {ר&quot;י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {w [+ MC] = כטב&quot;מ-GFP-ninaC} 2, P {ר [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3L P {ר&quot;י [+ t7.2] = neoFRT} 80B/TM6B, שחפת [1] - זרוע 3R: קו # 43,348, P {ר&quot;י [+ t7.2] RH1-GAL4 =} 1, P {ר&quot;י [+ t7.2] = אי-FLP.N} 2, W [*], P {w P {ר&quot;י [+ t7.2] = neoFRT} 82B P {ר [+ MC] = ninaE-tdTomato-ninaC} 3R/TM6B, שחפת [1]; [+ MC] = כטב&quot;מ-GFP-ninaC} 2 ארבע שורות אלה זמינות במרכז מניית Bloomington דרוזופילה. הם סיפקו מקור של FLP בעיני הפיתוח לייצור שיבוטים המיטוטי 21. כרומוזום פראי מסוג נושאת רצף FRT וninaC RH1-tdTomato לבנות קידוד tdTomato חלבון פלואורסצנטי האדום, כסמן לwild-type ו הפורטוריקנים חיצוניים הטרוזיגוטיים. במבנה זה, 41 חומצות אמינו האחרונות של איזופורם p174 של ninaC (לא איון ולא הפעלת C) גן היה appended במסגרת לC-הסופית של רצף tdTomato. זנב C-מסוף של איזופורם p174 ninaC אחראי על לוקליזציה rhabdomeral של החלבון 22 והיתרים להדמיה חיות טוב יותר של הפורטוריקנים ניאון אדומים שימוש בטכניקת נטרול קרנית. אמרגן RH1 הוא נ&quot;ב המינימלי 234 (-152 +82) אמרגן RH1. GFP סמן פלואורסצנטי הירוק בא לידי ביטוי בכל הפורטוריקנים החיצוניים, בשל נוכחותם של RH1-Gal4 (אמרגן 3KB) וכטב&quot;מ-GFP ninaC בונה. צלבים בין המניה לטוס נושאת x מוטציה על כרומוזום FRT (FRT-x) וקווי העגבניות / GFP-FLP / FRT מניב צאצאים עם גנוטיפ הבא (דוגמא למוטציה ב2L): RH1-Gal4, אי-FLP ; FRT40A, RH1-tdTomato ninaC / FRT40A-x; כטב&quot;מ-GFP ninaC. בזבובים אלה, תאים שעברו מוטציה הומוזיגוטים מופקים על ידי רקומבינציה mitotic בדיסק העין מתפתח ומתחלקים על מנת לייצר שיבוט של הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים (איור 2 א). הומוניתן לזהות תאים שעברו מוטציה zygous משום שהם מבטאים את החלבון פלואורסצנטי הירוק בלבד (GFP), ואילו wild-type ו תאים הטרוזיגוטיים סביב לבטא גם tdTomato וGFP (2B דמויות ו-B &quot;). 2. הכנת דרוזופילה להדמיה קולטי אור להדמיה יחסי ציבור על ידי טכניקת נטרול קרנית, לשתק את הזבובים על צלחות agarose. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן בקבוק שטיפה מלא במים 4 ° C מזוקקים ולמקם אותו על קרח. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להמס agarose הרגיל במים (agarose 1.2-1.5% במי 100 מיליליטר) על ידי חימום במיקרוגל. מניחים את הבקבוק באמבט מים ב55 ° C ולאפשר פתרון agarose להתקרר לטמפרטורה זו. שמור את agarose על 55 מעלות צלזיוס עד לשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרדימי זבובים עם CO 2 לדקות לפחות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים את פתרון agarose החם (ב55 ° C) לתוך צלחת פטרי (35 x 10 מ&quot;מ, 1.37 x 0.39 ב) ומקום היא מידately הרדים דרוזופילה על agarose. למתחילים, מתחיל עם 10 זבובים לכל צלחת פטרי הוא סביר. גם מנה גדולה יותר פטרי (60 x 15 מ&quot;מ, 2.362 x 0.59 ב) יכולה לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תחת מיקרוסקופ לנתח, כוון את דרוזופילה על צידו עם מלקחיים, דוחף כנף אחת לתוך agarose, כך שהכנף וחצי של הגוף מוטבעים בagarose (איורים 3A-3A &quot;&quot;). היצמד האגף האחר על פני השטח של agarose. הערה: אם הזבובים אינם מוטבעים עמוק מספיק בagarose, הזבוב יהיה חופשי לנוע בראשה במהלך ההדמיה של יחסי הציבור, וזה יגרום לתמונות מטושטשות. הנטייה של העין תהיה גם יפריע לו. זה עלול להיות קשה לצלול לתוך דרוזופילה agarose, עקב או הריכוז של agarose או הטמפרטורה שלו. זה יותר קל להטביע זבובים בagarose מרוכז יותר, אבל אם את agarose מרוכז מדי, הזבוב עלול לשקוע. אם agarose הוא מגניב מדי, זה יכול להיות דיfficult להטביע את הזבוב, אבל גבוהה מדי טמפרטורה עלולה לגרום נזק לקרנית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שים את צלחת פטרי על קרח ולאפשר agarose כדי לחזק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עם מלקחיים, כוון את הראש כך שעין אחת חשופה למטרת הטבילה (איור 3 א &#39;ו 3 א &quot;&quot;). באופן כללי, עיניים יכולות להיחשב להיות מכוונות היטב תחת מיקרוסקופ לנתח כאשר pseudopupil (דמיינו ככתם שחור) הוא באמצע של העין. כיוון אופטימלי של העין מגדיל את הרוחב של שדה ommatidial בי הפורטוריקנים מתמקדים. מטרת צעד הנטייה היא למצוא את האזור של העין עם השדה הרחב של הפורטוריקנים ממוקדים, בדרך כלל במרכז העין. שלב זה הוא גם שימושי עבור הסרת כל רגליים או aristae מכסה את העין ומניעת ההדמיה שלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כסה את הזבוב עם מים קרים כקרח ולהשאיר את צלחת פטרי על קרח עד להדמיה. מים קרים כקרח שומר על הזבובים מורדמים. </li></ol> 3. חזותיקולטני אור מתחת למיקרוסקופ להדמיה של הפורטוריקנים דרך הקרנית, פרוטוקול זה משתמש במיקרוסקופ זקוף מצויד מטרת מים עם מרחק עבודה ארוך (W N-Achroplan 40X/0.75). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צלחת פטרי מכוסה במים קרים כקרח בשקופית זכוכית על הבמה של מיקרוסקופ (איורים 3 לפני הספירה). צלחת פטרי יכולה להיות דבוקה לשקופית הזכוכית, כך שניתן להעביר אותו בצורה חלקה על עם ברגי מיקרומטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצלול אובייקטיבי הטבילה לתוך המים של צלחת פטרי (איורים 3B&#39;-3C &#39;). מקם את הראש של הזבוב תחת קורה העירור (להתחיל עם מסנן ה-GFP, למשל). להזיז את הבמה למעלה ולמטה עד הקרן מתכנסת על העין. כאשר העין היא ברמה הנכונה, הוא נוטה לשקף את אור העירור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להסתכל דרך העינית לקרינה. כאשר העין ממוקמת במרכז שדה הראייה, להתמקד בהמשךקרנית כדי להמחיש את קולטני אור הניאון. </li></ol> הערה 1: כאשר מסתכלים דרך העינית, זה עשוי להיות לא נוח להבחין חלקי הגוף של הזבוב, ובעיקר החלק האחורי של הבטן והראש, למשל. במקרים כאלה, אתה צריך להסתכל ישירות בשלב כדי לשנות את מיקום דרוזופילה. הערה 2: הקרינה קלאסית או confocal עשויה לשמש. מיקרוסקופיה confocal נותנת תמונות עם פחות רקע ושדה רחב יותר של הפורטוריקנים ממוקדים ממיקרוסקופיה קלאסית. הגדרת דוגמה לכך היא מיקרוסקופ confocal LSM510 (Zeiss) עם מטרת מים 40X. ניתן לקבל תוצאות טובות יותר על ידי פתיחת חריר של מיקרוסקופ confocal הרחב יותר מאשר בדרך כלל מומלץ לאובייקטיבי. לדוגמא, השתמש בשווי של 204, ולא ברירת המחדל 98 לצמצם של חריר. הערה 3: רמות גבוהות יותר של פיגמנטציה + w של העין להפחית את הקרינה הרקע. </p&gt; 4. ויזואליזציה בזמן קורס של תאי קולטי אור טיפול נדרש כאשר בעקבות גורלם של יחסי ציבור אינדיבידואליות באותה עין על פני תקופה של זמן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנמיך את הטמפרטורה של agarose ל45 ° C, על מנת למקסם את הישרדות דרוזופילה. Agarose מתמצק במהירות בטמפרטורה זו. יש להשתמש רק אחד דרוזופילה לכל צלחת פטרי, על מנת להבטיח כי זבובים אינם מעורבים במהלך תצפיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן שיטתי למקם את הזבובים באותו הצד, לצפייה של אותו עין. זו יכולה להיות מושגת על ידי נטילת הזבוב הרדים מהבקבוקון שלה על ידי כנף אחת והצבת דרוזופילה על agarose. תמיד לכוון את העין באותה הדרך, אם אפשר, מה שהופך את זה קל למצוא שיבוטים יחסי ציבור שכבר נצפו בעבר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זהה את השיבוטים על בסיס הצורה שלהם מתחת למיקרוסקופ confocal. שדה הראייה ממוקם בסמוך לשיבוט של עניין לעתים קרובות. בsuch המקרים, העין צריכה להיות ההתמצאות מתחת למים, למרכז שדה הראייה על השיבוט של עניין, המבוסס על הקוטביות של העין (איור 4). </li></ol> 5. שחזור זבובים לאחר יזואליזציה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המים מצלחת פטרי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משוך בעדינות את דרוזופילה מתוך agarose עם מלקחיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ייבש את דרוזופילה ברקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להחזיר את דרוזופילה לבקבוקון, על מנת להבטיח שזה לא להיתקע במזון. מחמד לטוס לבוא עגול ב25 ° C. </li></ol>

<ol>
	<li>Hardie, R. C., Ottoson, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Sensory physiology 5. 5, 1-79 (1985).</li><li>Wolff, T., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death+in+normal+and+rough+eye+mutants+of+Drosophila.">Cell death in normal and rough eye mutants of Drosophila.</a> Development. 113, 825-839 (1991).</li><li>Rister, J., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+retinal+mosaics+of+opsin+expression+in+invertebrates+and+vertebrates.">The retinal mosaics of opsin expression in invertebrates and vertebrates.</a> Dev Neurobiol. 71, 1212-1226 (2011).</li><li>Halder, G., Callaerts, P., Gehring, W. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+ectopic+eyes+by+targeted+expression+of+the+eyeless+gene+in+Drosophila.">Induction of ectopic eyes by targeted expression of the eyeless gene in Drosophila.</a> Science. 267, 1788-1792 (1995).</li><li>Mollereau, B., Domingos, P. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Photoreceptor+differentiation+in+Drosophila:+from+immature+neurons+to+functional+photoreceptors.">Photoreceptor differentiation in Drosophila: from immature neurons to functional photoreceptors.</a> Dev Dyn. 232, 585-592 (2005).</li><li>Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell+death:+what+can+we+learn+from+flies?+Editorial+for+the+special+review+issue+on+Drosophila+apoptosis.">Cell death: what can we learn from flies? Editorial for the special review issue on Drosophila apoptosis.</a> Apoptosis. 14, 929-934 (2009).</li><li>Charlton-Perkins, M., Brown, N. L., Cook, T. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+lens+in+focus:+a+comparison+of+lens+development+in+Drosophila+and+vertebrates.">The lens in focus: a comparison of lens development in Drosophila and vertebrates.</a> Mol Genet Genomics. 286, 189-213 (2011).</li><li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Planar+cell+polarity+signaling+in+the+Drosophila+eye.">Planar cell polarity signaling in the Drosophila eye.</a> Curr Top Dev Biol. 93, 189-227 (2010).</li><li>Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+visual+transduction.">Drosophila visual transduction.</a> Trends Neurosci. 35, 356-363 (2012).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery-based+science+education:+functional+genomic+dissection+in+Drosophila+by+undergraduate+researchers.">Discovery-based science education: functional genomic dissection in Drosophila by undergraduate researchers.</a> PLoS Biol. 3, e59 (2005).</li><li>Tomlinson, A., Ready, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+differentiation+in+the+Drosophila+ommatidium.">Neuronal differentiation in the Drosophila ommatidium.</a> Dev Biol. 120, 366-376 (1987).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ER+stress+protects+from+retinal+degeneration.">ER stress protects from retinal degeneration.</a> Embo J. 28, 1296-1307 (2009).</li><li>Jenny, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+adult+Drosophila+eyes+for+thin+sectioning+and+microscopic+analysis.">Preparation of adult Drosophila eyes for thin sectioning and microscopic analysis.</a> J Vis Exp. , (2011).</li><li>Mollereau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-step+process+for+photoreceptor+formation+in+Drosophila.">Two-step process for photoreceptor formation in Drosophila.</a> Nature. 412, 911-913 (2001).</li><li>Domingos, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spalt+transcription+factors+are+required+for+R3/R4+specification+and+establishment+of+planar+cell+polarity+in+the+Drosophila+eye.">Spalt transcription factors are required for R3/R4 specification and establishment of planar cell polarity in the Drosophila eye.</a> Development. 131, 5695-5702 (2004).</li><li>Mendes, C. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytochrome+c-d+regulates+developmental+apoptosis+in+the+Drosophila+retina.">Cytochrome c-d regulates developmental apoptosis in the Drosophila retina.</a> EMBO Rep. 7, 933-939 (2006).</li><li>Domingos, P. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+R7+and+R8+differentiation+by+the+spalt+genes.">Regulation of R7 and R8 differentiation by the spalt genes.</a> Dev Biol. 273, 121-133 (2004).</li><li>Mollereau, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+green+fluorescent+protein+enhancer+trap+screen+in+Drosophila+photoreceptor+cells.">A green fluorescent protein enhancer trap screen in Drosophila photoreceptor cells.</a> Mech Dev. 93, 151-160 (2000).</li><li>Pichaud, F., Desplan, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+visualization+approach+for+identifying+mutations+that+affect+differentiation+and+organization+of+the+Drosophila+ommatidia.">A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia.</a> Development. 128, 815-826 (2001).</li><li>Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two-color+in+vivo+imaging+of+photoreceptor+apoptosis+and+development+in+Drosophila.">Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila.</a> Dev Biol. 351, 128-134 (2011).</li><li>Golic, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Site-specific+recombination+between+homologous+chromosomes+in+Drosophila.">Site-specific recombination between homologous chromosomes in Drosophila.</a> Science. 252, 958-961 (1991).</li><li>Porter, J. A., Hicks, J. L., Williams, D. S., Montell, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+localizations+of+and+requirements+for+the+two+Drosophila+ninaC+kinase/myosins+in+photoreceptor+cells.">Differential localizations of and requirements for the two Drosophila ninaC kinase/myosins in photoreceptor cells.</a> J Cell Biol. 116, 683-693 (1992).</li><li>Johnson, K., Grawe, F., Grzeschik, N., Knust, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+crumbs+is+required+to+inhibit+light-induced+photoreceptor+degeneration.">Drosophila crumbs is required to inhibit light-induced photoreceptor degeneration.</a> Curr Biol. 12, 1675-1680 (2002).</li><li>Dourlen, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+fatty+acid+transport+protein+regulates+rhodopsin-1+metabolism+and+is+required+for+photoreceptor+neuron+survival.">Drosophila fatty acid transport protein regulates rhodopsin-1 metabolism and is required for photoreceptor neuron survival.</a> PLoS Genet. 8, e1002833 (2012).</li><li>Mlodzik, M., Hiromi, Y., Weber, U., Goodman, C. S., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+seven-up+gene,+a+member+of+the+steroid+receptor+gene+superfamily,+controls+photoreceptor+cell+fates.">The Drosophila seven-up gene, a member of the steroid receptor gene superfamily, controls photoreceptor cell fates.</a> Cell. 60, 211-224 (1990).</li><li>Gaul, U., Chang, H., Choi, T., Karim, F., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+ras+targets+using+a+genetic+approach.">Identification of ras targets using a genetic approach.</a> Ciba Found Symp. 176, 85-92 (1993).</li><li>Wassarman, D. A., Therrien, M., Rubin, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Ras+signaling+pathway+in+Drosophila.">The Ras signaling pathway in Drosophila.</a> Curr Opin Genet Dev. 5, 44-50 (1995).</li><li>Janody, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+mosaic+genetic+screen+reveals+distinct+roles+for+trithorax+and+polycomb+group+genes+in+Drosophila+eye+development.">A mosaic genetic screen reveals distinct roles for trithorax and polycomb group genes in Drosophila eye development.</a> Genetics. 166, 187-200 (2004).</li><li>Legent, K., Steinhauer, J., Richard, M., Treisman, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+screen+for+X-linked+mutations+affecting+Drosophila+photoreceptor+differentiation+identifies+Casein+kinase+1alpha+as+an+essential+negative+regulator+of+wingless+signaling.">A screen for X-linked mutations affecting Drosophila photoreceptor differentiation identifies Casein kinase 1alpha as an essential negative regulator of wingless signaling.</a> Genetics. 190, 601-616 (2012).</li><li>Newsome, T. P., Asling, B., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+Drosophila+photoreceptor+axon+guidance+in+eye-specific+mosaics.">Analysis of Drosophila photoreceptor axon guidance in eye-specific mosaics.</a> Development. 127, 851-860 (2000).</li><li>Berger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Systematic+identification+of+genes+that+regulate+neuronal+wiring+in+the+Drosophila+visual+system.">Systematic identification of genes that regulate neuronal wiring in the Drosophila visual system.</a> PLoS Genet. 4, e1000085 (2008).</li><li>Bayat, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mutations+in+the+mitochondrial+methionyl-tRNA+synthetase+cause+a+neurodegenerative+phenotype+in+flies+and+a+recessive+ataxia+(ARSAL)+in+humans.">Mutations in the mitochondrial methionyl-tRNA synthetase cause a neurodegenerative phenotype in flies and a recessive ataxia (ARSAL) in humans.</a> PLoS Biol. 10, e1001288 (2012).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

עין דרוזופילה כבר בשימוש נרחב כדי לפענח את מסלולי איתות ויסות פיתוח, שגשוג והישרדות. בתחילת 1990, מספר גדול של מסכים גנטי בוצע על מנת לזהות את המסלולים הנדרשים במהלך השלבים הראשונים של פיתוח יחסי ציבור 25-27. היעילות של מסכי גנטיים גדלה במידה רבה על ידי טכניקת רקומבינציה mitotic, מה שהופך את זה אפשר לבדוק מוטציות אובדן של פונקציה בשיבוטי פסיפס 21. לפיכך, תפקידה של מוטציות קטלניות עובריים יכול להיבדק באופן שיטתי בשיבוטי מוטציה הומוזיגוטים בעיניים של זבובים שהיו אחרת הטרוזיגוטיים. רוב הקרנות הפסיפס התמקדו בגיוס יחסי הציבור המוקדם, הבידול, הקרנת אקסון או המורפוגנזה מתרחשת בזחלים או גלמי 10,25-31 המתפתחים. עד כה, רק אחד מסך פסיפס חקר את מנגנוני ויסות תפקוד יחסי ציבור מבוגרים, על ידי ניטור התגובה החזותית באמצעות electroretinogram הקלטות 32. עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT והאפשרות של ביצוע ניתוח כמובן זמן חי חיות שעברו מוטציה, יש לנו תוכננו שיטה חדשה לזיהוי הגורמים המסדירים את יכולת קיום יחסי ציבור מבוגר ולתפקד 20,24. יש שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כמה יתרונות גדולים על פני חתך היסטולוגית הקלאסי של עיניים משובצות שרף. ראשית, שיטה זו היא הרבה יותר מהר, זול יותר וקל יותר לביצוע מאשר השיטה היסטולוגית, ובלבד שמיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במטרת טבילת מים מתאימה הוא זמין (ראה טבלה של חומרים כימיים וציוד). שנית, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT יכולה לשמש בשילוב עם ביטוי transgene, כגון הביטוי של P (כטב&quot;מ, W +), שנשאה transgene מיני לבן. בניגוד לסעיפים היסטולוגית, שבי + w משמש לזיהוי משובט, במערכת העגבניות / GFP-FLP / FRT, P (כטב&quot;מ, W +) לא מפריע ד המשובטetection מבוסס על חלבון פלואורסצנטי עגבניות. באמצעות P (כטב&quot;מ-fatp, W +) זבובים מהונדסים, היינו יכול לדמיין את ההצלה של הפורטוריקנים מוטציה fatp (איור 7). שלישית, מכשול עיקרי של כל סוגי ניתוח משובט, ובכלל זה המבוסס על העגבניות / GFP-FLP / FRT, היא העמימות של גנוטיפ של הפורטוריקנים לאיבוד. ואכן, זה עשוי להיות לא ברור אם יחסי ציבור נעדר בגלל חוסר תפקוד גן מסוים או בגלל השפעה בלתי אוטונומית תא, במיוחד בגבול של השיבוט שעבר מוטציה. שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT מקבלת לעקוף בעיה זו לניוון על ידי כך שניתן לעקוב wild-type ו הפורטוריקנים מוטציה באותו בעל חיים על פני תקופות של מספר שבועות. היינו מסוגל לעקוב אחר גורלם של הפורטוריקנים פרט על ידי הקינטית ניתוחים על זבובים שעברו מוטציה fatp שונים (איור 6). אותו השיבוט יכול להיות מוכר בבעלי חיים ניתנו בזמנים שונים, בגלל צורתו המדויקת של השיבוטים פראי מהסוג שמסביב. אנחנו הצלחנו להראות חד משמעיly שכל הפורטוריקנים החסרים היו מוטציה לfatp, מצביעים על כך שתפקידם של מוטציות fatp בהפורטוריקנים הוא תאים אוטונומיים. לכן, על ידי ניטור אובדן הפורטוריקנים בניתוח קינטי, ניתן לקבוע את הגנוטיפ של הפורטוריקנים במודלים של ניוון ממבוגרים. לבסוף, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT הוכיחה חזקה מאוד לזיהוי של גורמים המסדירים את הקמתה של PCP 20. האפשרות של הבקיע מספר רב של האומטידיה פסיפס לפנוטיפ קוטביות ללא הצורך בחלקים, מאפשרת קביעה מהירה של דרישת יחסי הציבור להקמתה של PCP. עם זאת, ניתוח של יושרת יחסי הציבור עדין ידרוש חתך מסורתי ואחריו שלב בניגוד או microscopies האלקטרוני. לסיכום, שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT פותחת אפשרויות חדשות לסינון פסיפס יעיל כדי לזהות גורמים המסדירים את תהליכי התפתחות יחסי ציבור ופונקציות יחסי ציבור בוגרים, כגון מולתגובת רע&quot;מ ויכולת קיום.

רשתית דרוזופילה מורכבת מכ -800 יחידות ommatidial (איור 1 א), אשר מאורגנות בדיוק, עם ציר מוגדר וברור של קוטביות (איור 1). כל יחידה מכילה 20 תאים: שמונה תאי קולטי אור (PRS) ו12 תאי אבזר, כוללים תאים חרוטים, תאי פיגמנט וזיפי תאים 1,2. שני סוגים של יחסי הציבור נבדלים על בסיס הסוג של רודופסין (Rh) שהם מבטאים. שישה הפורטוריקנים החיצוניים (R1-6) להביע RH1 ומסודרים בתבנית בצורת טרפז (איור 1 ג). במרכז הטרפז, שני הפורטוריקנים הפנימיים (R7/R8) להביע את ארבעה סוגים אפשריים של רודופסין (Rh3, Rh4, Rh5 או Rh6) ומאורגנים כך שR7 שקרים על גבי R8 3. יותר מ 2,500 גנים מעורבים בהמורפוגנזה של העין דרוזופילה 4, אשר הוכיחה את מודל חזק מאוד ללימודים של פנל רחב של תהליכים, כוללים deve העיןlopment, גיוס יחסי ציבור, בידול, קוטביות תא מישוריים, המורפוגנזה, הישרדות, אפופטוזיס ותמרה חזותית 5-9. חוקרים עובדים על העין דרוזופילה יש, במשך שנים רבות, פיתחו טכניקות הדמיה הרשתית וביצוע מסכי גנטיים שיטתיים. הדרך הקלה ביותר לתמונת הרשתית המבוגר היא להסתכל על הקרנית בבעלי חיים משותקים (איור 1 א). המבנה של הקרנית יכול להיות דמיינו דווקא על ידי מיקרוסקופית אלקטרונים סורק והיה בשימוש במסך גנטי בקנה מידה גדולה על ידי קונסורציום URCFG <a href="http://www.bruinfly.ucla.edu" target="_blank">(http://www.bruinfly.ucla.edu)</a> 10. זוהי גישה יעילה מאוד להמחשת שינויים הגלובליים מורפולוגיים במבנה קרני, כגון חספוס עין או ברק, לעתים קרובות נגרמים על ידי מוטציות בגנים השולטים בשלבים מוקדמים בהתפתחות או כדאיות תא. עם זאת, להדמיה הגלובלית של הקרנית היא לא sufficient לזהות את הגורמים המסדירים את כדאיות המורפוגנזה או יחסי ציבור יחסי הציבור מבוגרים rhabdomere ותפקוד. ניתוח מסוג זה דורש חקירה יסודית יותר של יושרת יחסי הציבור, המבוססת על מיקרוסקופ שלב בניגוד סעיפים שרף חצי דקים המשיקים של 11-13 הרשתית. טכניקה זו מתאימה לניתוחי פסיפס, שבה ניתן לזהות הפורטוריקנים מוטציה על ידי חוסר 14,15 הפיגמנט האדום שלהם. יכולים גם להיות דמיינו שיבוטים מוטציה פסיפס ובניתוחים כל ההר של רשתית גלמים או מבוגר, על הבסיס של חוסר החלבון פלואורסצנטי ירוק אות (GFP) במיקרוסקופ פלואורסצנטי 16,17. שתי טכניקות אלה שימושיות מאוד, אבל שניהם עבודה וזמן רב ולכן אינו מתאימים להקרנה בקנה מידה גדולה. אנו ואחרים פיתחו את השימוש בטכניקות נטרול קרנית להדמיה של הפורטוריקנים ייצור חלבוני ניאון 18,19, כדי להקל על יחסי ציבור מהירים מנתח. בעזרת טכניקה, זה מוטציהניתן לזהות שיבוטים על בסיס autofluorescence של הפיגמנט האדום (w +) בשיבוטי דרוזופילה מבוגרים פסיפס. עם זאת, שיטה זו אינה מספקת את הרזולוציה התא הבודד הדרושה לטיפול באוטונומית תא מנפיקה 19. התגברנו על בעיה זו על ידי פיתוח שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, המשלבת את ההדמיה של חלבוני ניאון על ידי נטרול קרנית עם רקומבינציה mitotic 20. שיטה זו מאפשרת תפוקה גבוהה, זיהוי מהיר ומדויק של הפורטוריקנים מוטציה בשיבוטי פסיפס, ברזולוציה של תא בודד <a href="http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/" target="_blank">(http://www.ens-lyon.fr/LBMC/ApoDrosoDatabase/).</a> הוא מתאים לשימוש בניתוחים הקינטית, לבא הפורטוריקנים בודדים על פני תקופה של שבועות בחיים דרוזופילה. אנו מתארים כאן שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT וטיפים לשימוש בו בניתוחים פשוטים, הקינטית של עיני פסיפס.

<table><tbody><tr><td> &amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td> &lt;strong&gt;Reagent&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td> Agarose</td><td>Euromedex</td><td>D5-E</td><td> Regular agarose is used to immobilize the flies</td></tr><tr><td> Petri dish</td><td>BD Falcon</td><td>353001</td><td> 35 x 10 mm, 1.37 x 0.39 inch</td></tr><tr><td> Cold-ice water</td><td></td><td></td><td> To maintain the flies anesthetized</td></tr><tr><td> &amp;nbsp;</td><td></td><td></td><td> &lt;strong&gt;Equipment&lt;/strong&gt;</td></tr><tr><td> Dissecting microscope</td><td>Dutcher</td><td>SMZ645</td><td> &amp;nbsp;</td></tr><tr><td> Water Bath</td><td>Julabo</td><td>9550102</td><td> To keep the agarose solution at warm temperature</td></tr><tr><td> 40X Water objective</td><td>Zeiss</td><td>420967-9900-000</td><td> Water dipping objective for the confocal microscope</td></tr></tbody></table>

the tomato/gfp-flp/frt method for live imaging of mosaic adult drosophila photoreceptor cells

עין דרוזופילה נעשתה שימוש נרחב כמודל למחקרים של התפתחות וניוון עצבי. עם טכניקת רקומבינציה mitotic רבת עוצמה, מסכי גנטיים אלגנטיים המבוססים על ניתוח משובט הובילו לזיהוי של מסלולי איתות מעורבים בפיתוח העין וקולטי אור בידול (PR) בשלבי זחל. אנו מתארים כאן שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, אשר יכול לשמש לניתוח משובט מהיר בעין של חיים הבוגרים דרוזופילה. תאי קולטי אור פלורסנט הם צילמו עם טכניקת נטרול קרנית, ברשתית עם שיבוטים פסיפס שנוצרו על ידי רקומבינציה בתיווך flipase. לשיטה זו מספר יתרונות גדולים על פני חתך היסטולוגית קלאסי של הרשתית: ניתן להשתמש בו להקרנת תפוקה גבוהה והוכיח את השיטה יעילה לזיהוי הגורמים המסדירים הישרדות יחסי ציבור ותפקוד. זה יכול לשמש גם לניתוחים הקינטית של ניוון יחסי ציבור באותו ענים חייםאל פני כמה שבועות, כדי להדגים את הדרישה לגנים ספציפיים להישרדות יחסי ציבור או פונקציה בזבוב הבוגר. שיטה זו היא גם שימושית לטיפול בבעיות אוטונומיה תא במוטנטים התפתחותית, כגון אלה שבהקמתה של קוטביות תא מישוריים מושפעת.

שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT יכולה לשמש כדי לחקור את ההשפעה של מוטציה או ביטוי מחוץ לרחם על ההתפתחות וההישרדות של הפורטוריקנים ברשתית דרוזופילה. זה מהיר, מה שהופך אותו אידיאלי למטרות הקרנה, כפי שמודגם 20 לאחרונה. הנוכחות של הפורטוריקנים מוטציה ליד הפורטוריקנים wild-type באותה העין עושה את זה קל לזהות פגמים הקשורים הפורטוריקנים מוטציה ולהתייחס לנושא האוטונומיה תא. הליקויים התפתחותיים נצפו בניתוח שלנו מושפעים תהליכים שונים, ובכלל זה גיוס יחסי ציבור, המורפוגנזה וקוטביות תא מישוריים ההקמה (PCP) (איור 5). שבעה שלא בפניו הוא נדרש לגיוס יחסי ציבור, במיוחד עבור R7 אחד יחסי הציבור הפנימיים. האובדן של שבע בתוצאות שלא בפניו באובדן של יחסי הציבור הפנימיים וכמה פורטוריקנים חיצוניים (איור 5 א). הראש מגורען (grh) מעורב בהקמת PCP וכמה האומטידיה הן inverted בgrh שיבוטים מוטציה (איור 5). שיטה זו מאפשרת לזהות את הפורטוריקנים המוטציה בהאומטידיה פסיפס, להקל זיהוי של הפורטוריקנים בהם נדרש הגן לרכישה הנכונה של PCP. הראנו grh שנדרש לרכישה הנכונה של PCP במבשרי R3 20. ואכן, אנו ציינו כי, בהאומטידיה ההפוכה, R4, שמקורו באופן חריג ממבשר R3, תמיד היה מוטציה. פירורים (Crbs) הוא חלבון קרום הפסגה נדרש להמורפוגנזה rhabdomere 23. אובדן Crbs בתוצאות המוטציה Crbs 11A22 בהפורטוריקנים לא סדירים, גדולים יותר או קטנים יותר (איור 5 ג). גם בשיטה זו ניתן להשתמש כדי לעקוב אחר גורלם של הפורטוריקנים אחת במהלך הבגרות (איור 6). הוא אידיאלי עבור מחקרי ניוון מוחיים, כי קבוצה של הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים ניתן לראות וניתן למצוא אותה הקבוצה באותה עיןאותו לעוף על פני תקופה של ימים או שבועות. ניתן, אפוא, לקבוע איזה הפורטוריקנים לשרוד ואשר נידונו למות, כי כל שיבוט יש צורה ייחודית שניתן להכיר כאשר העין ממוקמת תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. כרשתית מקוטבת, ניתן לכוון את הרשתית כדי למצוא את אותו השיבוט שוב, על בסיס צורתו. אנחנו השתמשנו בשיטה זו כדי להראות שfatp k10307 מוטציה גורמת להתנוונות יחסי ציבור מתקדמת בבגרות (איור 6, 24). גם שיטת הדמיה זו יכולה לשמש גם כדי לנתח את האוטונומיה תא. בfatp k10307 רשתית פסיפס, אובדן יחסי הציבור הוגבל לfatp הפורטוריקנים מוטציה, הפורטוריקנים פראי מהסוג להיות מושפעים. הדרישה של fatp לכדאיות יחסי ציבור ולכן תא אוטונומי. היינו גם יכול להציל את יחסי ציבור המוטציה fatp ידי reexpressing fatp wild-type עם נהג RH1-Gal4 ולבנות כטב&quot;מ-fatp (איור 7).אפשרות של ביצוע ניסויי הצלה כזו היא אחד היתרונות של שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT על ניתוח משובט המבוסס על סעיפים היסטולוגית של רשתית-מוטבע שרף. אכן, זיהוי משובט עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT אינו מושפע מהשימוש בP (כטב&quot;מ, W +) מבנים מהונדסים, ואילו פיגמנטציה האדומה הקשורים לגן המיני לבן (w +) מכסה את העין עם הפיגמנט האדום , מיסוך שיבוטים פסיפס בסעיפים היסטולוגית. <img alt="איור 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig1.jpg" /> איור 1. ארגון של העין דרוזופילה. (א) תצלום של העין דרוזופילה נלקחה עם סטראו. עין דרוזופילה מורכבת מכ 800 אומטידיה. (ב) תרשים סכמטי של תחום 64 האומטידיה באמצע של העין. שישה תאי עצב קולטי האור חיצוניים (PRS) של כל אומטידיום,מוצג בירוק, מאורגנים בטרפז סטריאוטיפי המצביע על הקטבים הקרובים ביותר של העין. הם כתוצאה מכך מצביעים בכיוונים מנוגדים בגחון והחלק הגבי של העין והם תמונת ראי לדברי את הגבול בין שני חלקים, הנקרא קו המשווה. תרשים סכמטי (C) של אומטידיום. כל אומטידיום מכיל שמונה הפורטוריקנים. הפורטוריקנים R1 לR6, המוצג בירוק, נמצא הפורטוריקנים החיצוניים. הם מבטאים את rhodopsin1 המולקולה רגיש (RH1) והם המקביל של תאי מוט יונקים. הפורטוריקנים הפנימיים, R7 ו R8, מוצגים באפור (R7 יושב על גבי R8). הפורטוריקנים הפנימיים להביע rhodopsin 3, 4, 5 או 6 והם המקביל של תאי חרוט יונקים. לשם פשטות, רק rhabdomere, החלק רגיש לאור של יחסי הציבור, מוצג עבור כל יחסי ציבור. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/50610/50610fig1large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <imgalt = &quot;איור 2&quot; עבור: תוכן ברוחב = src &quot;4.25in&quot; = &quot;/ files/ftp_upload/50610/50610fig2.jpg&quot; /&gt; איור 2. יצירה באופן חזותי שיבוטים יחסי ציבור פסיפס בעיני דרוזופילה עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT. (א) תרשים סכמטי של הדור של שיבוטים פסיפס בשיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT. שיבוטים פסיפס נוצרים על ידי רקומבינציה mitotic, בשל הביטוי של flipase (תחת שליטה של ​​האמרגן חסר עיניים) במהלך התפתחות העין ורצפי FRT. לאחר רקומבינציה של רצף FRT וחלוקת תא, מוטציה הומוזיגוטים, פראי מסוג הומוזיגוטים ותאים הטרוזיגוטיים יכולה להיות שנוצרה מתאים הטרוזיגוטיים. תאים אלה מתחלקים שוב ליצירת שיבוטים פסיפס של הפורטוריקנים בעיניים המבוגרים. זיהוי של תאים שעברו מוטציה הוא הקל על ידי הוספת מבנה המבטא את tdTomato חלבון פלואורסצנטי האדום לכרומוזום wild-type, לתייג wild-type ו תאים הטרוזיגוטיים. ויזואליזציה (B-B&#39;&#39;) של שיבוטים יחסי ציבור פסיפס עם tשיטה שהוא העגבניות / GFP-FLP / FRT. שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT משלבת רקומבינציה mitotic, ניטרול הקרנית ומיקרוסקופיה confocal. כל הפורטוריקנים להביע GFP ירוק ניאון החלבון, המאפשר ההדמיה של הפורטוריקנים באמצעות נטרול קרנית ומיקרוסקופיה confocal (ב &#39;). ניתן דמיינו הפורטוריקנים ברמת תא בודד. שיבוטים פסיפס מוטציה מופקים על ידי רקומבינציה mitotic ויכולים להיות מזוהה על ידי היעדר tdTomato האדום ניאון החלבון (ב &#39;). כתוצאה מכך, בתמונות הממוזגות, הפורטוריקנים הומוזיגוטים מופיעים בירוק, בעוד הפורטוריקנים wild-type ו הטרוזיגוטיים הם צהובים (ב&#39;&#39;). <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/50610/50610fig2large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 3" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig3.jpg" /> איור 3. הגדרת דרוזופילה לvisualizatיון על ידי נטרול קרנית. (-&#39;&#39;&#39;&#39;) תצלומים של דרוזופילה משותקים על צלחת מלאה בagarose. בפנל&#39;&#39;&#39;&#39;, חתיכת agarose המכילה הזבוב נחתכה כדי לצלם פרופיל. דרוזופילה היא חצי משובצת בagarose, עם אגף ימין בתוך agarose והשמאל תקוע על פני השטח agarose (,&#39;&#39;,&#39;&#39;&#39;&#39;). כאשר דרוזופילה מוטבעת בagarose, הראש שלה ממוקם לעתים קרובות בצורה גרועה להדמיה של העין (, &#39;). הראש לכן יש reorientated עם מלקחיים כך שהאמצע של העין כלפי מעלה (&#39;&#39;,&#39;&#39; &#39;). (B-B&#39;) תרשים סכמטי המציג דרוזופילה משותק על צלחת agarose והמיצוב של דרוזופילה תחת המטרה של המיקרוסקופ תצלומים. (C-C &#39;) של ההגדרה של דרוזופילה על במתמיקרוסקופ תחת המטרה שלה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/50610/50610fig3large.jpg" target="_blank">לחץ כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 4" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig4.jpg" /> איור 4. נטייה של העין לניתוח בזמן כמובן. איור מציג תצלומים של ראש דרוזופילה בשתי אוריינטציות שונות והשדות המתאימים של האומטידיה שנצפו על ידי נטרול קרנית, מיוצגים כדיאגרמות סכמטי. (א) במהלך התצפית הראשונה, העין ממוקמת כך ששיבוט של הפורטוריקנים הטרוזיגוטיים או wild-type (בצהוב) נתפס באמצע השדה, ברמה של קו המשווה (קו אדום). (ב &#39;) במהלך התצפית השנייה, העין היא לעתים קרובות לא בדיוק באותו הכיוון. לכן, ניתן למצוא אותה הקבוצה של הפורטוריקנים שוב, אבל זה לא אפשרי כדי להציגאותו מדויק שדה (משמאל). העין חייבת להיות ההתמצאות לאותו שדה כדי לראות שוב. עמדתו של קו המשווה יכולה לשמש כמדריך. בדוגמא זו, אנו יודעים כי השדה שנצפה הוא הגחון מדי, וכי העין ולכן צריכה להיות מופעלת ventrally למקם את קו המשווה באמצע השדה שנצפה שוב, כמו בתצפית הראשונה. <img alt="איור 5" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig5.jpg" /> איור 5. דוגמאות לליקויי התפתחות יחסי הציבור זוהו על ידי שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT. (א) ויזואליזציה של הפורטוריקנים סינא פסיפס [BG02648] מוטציה, מראה את האובדן של הפורטוריקנים פנימיים. בהאומטידיה המוטציה, הפורטוריקנים חיצוניים מקובצים יחד בשל היעדר יחסי הציבור R7 הפנימי. ואכן, סינא ידוע להידרש לגיוס יחסי ציבור פנימי. ויזואליזציה (ב) לgrh פסיפס [s2140] הפורטוריקנים מוטציה מראים פגמים קוטביות. האומטידיה, surr המוטציה הפסיפסounded על ידי מעגל, מצביעים בכיוון ההפוך מהאומטידיה הסוג פראי, מה שמעיד על היפוך dorso-הגחון. מחקר מפורט בשיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT הראה כי grh נדרש במבשרת R3 לרכישה הנכונה של קוטביות אומטידיום 20. ויזואליזציה (C) של הפורטוריקנים CRB פסיפס [j1B5] מוטציה, מראה הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים מעוות. CRB ידוע להידרש להמורפוגנזה rhabdomere. <img alt="איור 6" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig6.jpg" /> איור 6. הניתוח בזמן במהלך fatp פסיפס [k10307] הפורטוריקנים מוטציה עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT, מעל 14 ימים. fatp פסיפס [k10307] רשתית מוטציה הוא ציין ביום 1 (, &#39;), יום 4 ( ב &#39;, ב&#39;), יום 8 (C, C &#39;) והיום 14 (ד&#39;, ד &#39;) לאחר הבקיעה. אותה הקבוצה של הפורטוריקנים פסיפס יכולה להיות founד בכל נקודת זמן, בתחום הנצפה (מלבן לבן, A, B, C, D). בתחום זה של הפורטוריקנים (א &#39;, ב&#39;, ג&#39;, ד &#39;), הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים מסומנים בירוק, ואילו הפורטוריקנים הטרוזיגוטיים והומוזיגוטים פראי מסוג מסומנים בצהוב. מיום 4 (ב &#39;) ואילך, הפורטוריקנים מוטציה הומוזיגוטים מתחילים להיעלם, המציין כי fatp [k10307] מוטציה גורמת לניוון הדרגתי של הפורטוריקנים אלה. <a href="https://www-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/files/ftp_upload/50610/50610fig6large.jpg" target="_blank">לחצו כאן כדי להציג דמות גדולה.</a> <img alt="איור 7" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/50610/50610fig7.jpg" /> איור 7. הצלה של fatp [k10307] הפורטוריקנים מוטציה עם ויזואליזציה ביצוע מיני לבן לבנות להביע fatp. הפורטוריקנים הפסיפס הם דמיינו עם שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT בזבובים 15 ימים בת. (א) לשליטת פסיפס הפורטוריקנים. (ב) Visualization של הפורטוריקנים פסיפס fatp מוטציה, מראים את האובדן של הפורטוריקנים מוטציה ויזואליזציה. (C) של פסיפס fatp הפורטוריקנים מוטציה בfatp זבוב reexpressing ביחסי הציבור חיצוני (RH1&gt; fatp). הפורטוריקנים המוטציה הם חולצו. הנוכחות של גן מיני לבן ופיגמנטציה העיניים האדומה הקשורים בRH1&gt; תנאי fatp אינו משנים עגבניות או GFP הקרינה או זיהוי משובט.

Watch this Scientific Journal Video about The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells at JoVE.com

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כרוכה לדמיין תאי קולטי אור פסיפס בחיים דרוזופילה. ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר גורלם של תאי קולטי אור ברשתית בודד במשך ימים או שבועות. שיטה זו היא אידיאלית ללימודים של ניוון רשתית ומחלות ניווניות או התפתחות תאי קולטי אור.

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד<em&gt; דרוזופילה</em&gt; תאי קולטי אור

The Drosophila eye is widely used as a model  for studies of development and neuronal degeneration. With the powerful mitotic  recombination technique, ...

the-tomatogfp-flpfrt-method-for-live-imaging-mosaic-adult-drosophila

Research

JoVE Journal

Biology

The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

18.0K Views.  Ecole Normale Supérieure de Lyon.  שיטת העגבניות / GFP-FLP / FRT כרוכה לדמיין תאי קולטי אור פסיפס בחיים דרוזופילה. ניתן להשתמש בו כדי לעקוב אחר גורלם של תאי קולטי אור ברשתית בודד במשך ימים או שבועות. שיטה זו היא אידיאלית ללימודים של ניוון רשתית ומחלות ניווניות או התפתחות תאי ק...

Video: The Tomato/GFP-FLP/FRT Method for Live Imaging of Mosaic Adult Drosophila Photoreceptor Cells

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Developmental Biology

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding fundamental biological mechanisms. Striking progress has been particularly evident in Drosophila, whose extensive toolkit of mutants and transgenic lines provides a convenient model to study evolutionarily-conserved developmental and cell biological mechanisms. We are interested in understanding the mechanisms that control cell fate specification in the adult peripheral nervous system (PNS) in Drosophila. Bristles that cover the head, thorax, abdomen, legs and wings of the adult fly are individual mechanosensory organs, and have been studied as a model system for understanding mechanisms of Notch-dependent cell fate decisions. Sensory organ precursor (SOP) cells of the microchaetes (or small bristles), are distributed throughout the epithelium of the pupal thorax, and are specified during the first 12 hours after the onset of pupariation. After specification, the SOP cells begin to divide, segregating the cell fate determinant Numb to one daughter cell during mitosis. Numb functions as a cell-autonomous inhibitor of the Notch signaling pathway.
Here, we show a method to follow protein dynamics in SOP cell and its progeny within the intact pupal thorax using a combination of tissue-specific Gal4 drivers and GFP-tagged fusion proteins 1,2.This technique has the advantage over fixed tissue or cultured explants because it allows us to follow the entire development of an organ from specification of the neural precursor to growth and terminal differentiation of the organ. We can therefore directly correlate changes in cell behavior to changes in terminal differentiation. Moreover, we can combine the live imaging technique with mosaic analysis with a repressible cell marker (MARCM) system to assess the dynamics of tagged proteins in mitotic SOPs under mutant or wildtype conditions. Using this technique, we and others have revealed novel insights into regulation of asymmetric cell division and the control of Notch signaling activation in SOP cells (examples include references 1-6,7 ,8).

Live-cell Imaging of Sensory Organ Precursor Cells in Intact Drosophila Pupae

In this video, we describe a method for live cell imaging of asymmetrically dividing sensory organ progenitor cells and epidermal cells in intact Drosophila pupae

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

Since the discovery of Green Fluorescent Protein (GFP), there has been a revolutionary change in the use of live-cell imaging as a tool for understanding ...

Neuroscience

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Visualizing developing organ formation as well as progession and treatment of disease often heavily relies on the ability to optically interrogate molecular and functional changes in intact living organisms. Most existing optical imaging methods are inadequate for imaging at dimensions that lie between the penetration limits of modern optical microscopy (0.5-1mm) and the diffusion-imposed limits of optical macroscopy (&gt;1cm) [1]. Thus, many important model organisms, e.g. insects, animal embryos or small animal extremities, remain inaccessible for in-vivo optical imaging. 
Although there is increasing interest towards the development of nanometer-resolution optical imaging methods, there have not been many successful efforts in improving the imaging penetration depth. The ability to perform in-vivo imaging beyond microscopy limits is in fact met with the difficulties associated with photon scattering present in tissues. Recent efforts to image entire embryos for example [2,3] require special chemical treatment of the specimen, to clear them from scattering, a procedure that makes them suitable only for post-mortem imaging. These methods however evidence the need for imaging larger specimens than the ones usually allowed by two-photon or confocal microscopy, especially in developmental biology and in drug discovery.
We have developed a new optical imaging technique named Mesoscopic Fluorescence Tomography [4], which appropriate for non-invasive in-vivo imaging at dimensions of 1mm-5mm. The method exchanges resolution for penetration depth, but offers unprecedented tomographic imaging performance and it has been developed to add time as a new dimension in developmental biology observations (and possibly other areas of biological research) by imparting the ability to image the evolution of fluorescence-tagged responses over time. As such it can accelerate studies of morphological or functional dependencies on gene mutations or external stimuli, and can importantly, capture the complete picture of development or tissue function by allowing longitudinal time-lapse visualization of the same, developing organism.
The technique utilizes a modified laboratory microscope and multi-projection illumination to collect data at 360-degree projections. It applies the Fermi simplification to Fokker-Plank solution of the photon transport equation, combined with geometrical optics principles in order to build a realistic inversion scheme suitable for mesoscopic range. This allows in-vivo whole-body visualization of non-transparent three-dimensional structures in samples up to several millimeters in size.
We have demonstrated the in-vivo performance of the technique by imaging three-dimensional structures of developing Drosophila tissues in-vivo and by following the morphogenesis of the wings in the opaque Drosophila pupae in real time over six consecutive hours.

Mesoscopic Fluorescence Tomography for In-vivo Imaging of Developing Drosophila

Mesoscopic fluorescence tomography operates beyond the penetration limits of tissue-sectioning fluorescence microscopy. The technique is based on multi-projection illumination and a photon transport description. We demonstrate in-vivo whole-body 3D visualization of the morphogenesis of GFP-expressing wing imaginal discs in Drosophila melanogaster.

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית</em

Visualizing  developing organ formation as well as progession and treatment of disease often  heavily relies on the ability to optically interrogate ...

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A remarkable example is given by sensory epithelia, where cells of the same or distinct identities are brought together via cell-cell adhesion showing highly organized planar patterns. Cells align to one another in the same direction and display equivalent polarity over large distances. This organization of the mature epithelia is established over the course of morphogenesis. To understand how the planar arrangement of the mature epithelia is achieved, it is crucial to track cell orientation and growth dynamics with high spatiotemporal fidelity during development in vivo. Robust analytical tools are also essential to identify and characterize local-to-global transitions. The Drosophila pupa is an ideal system to evaluate oriented cell shape changes underlying epithelial morphogenesis. The pupal developing epithelium constitutes the external surface of the immobile body, allowing long-term imaging of intact animals. The protocol described here is designed to image and analyze cell behaviors at both global and local levels in the pupal abdominal epidermis as it grows. The methodology described can be easily adapted to the imaging of cell behaviors at other developmental stages, tissues, subcellular structures, or model organisms.

Imaging and Analysis of Tissue Orientation and Growth Dynamics in the Developing Drosophila Epithelia During Pupal Stages

This protocol is designed for the imaging and analysis of the dynamics of cell orientation and tissue growth in the Drosophila abdominal epithelia as the fruit fly undergoes metamorphosis. The methodology described here can be applied to the study of different developmental stages, tissues, and subcellular structures in Drosophila or other model organisms.

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

Within multicellular organisms, mature tissues and organs display high degrees of order in the spatial arrangements of their constituent cells. A ...

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three preparations of the brain and visual system that cover the range from the developing eye disc-brain complex in the developing pupae to individual eye and brain dissection from adult flies. All protocols are optimized for the live culture of the preparations. However, we also present the conditions for fixed tissue immunohistochemistry where applicable. Finally, we show live imaging conditions for these preparations using conventional and resonant 4D confocal live imaging in a perfusion chamber. Together, these protocols provide a basis for live imaging on different time scales ranging from functional intracellular assays on the scale of minutes to developmental or degenerative processes on the scale of many hours.

Preparation of Developing and Adult Drosophila Brains and Retinae for Live Imaging

This protocol describes three Drosophila preparations: 1) adult brain dissection, 2) adult retina dissection and 3) developing eye disc- brain complexes dissection. Emphasis is laid on special preparation techniques and conditions for live imaging, although all preparations can be used for fixed tissue immunohistochemistry.

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

The Drosophila brain and visual system are widely utilized model systems to study neuronal development, function and degeneration. Here we show three ...

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

The Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating fundamental questions such as cytoskeletal function, cell organization, and organelle structure and function. The availability of various GFP-tagged proteins means that many cellular processes can be monitored in living cells over the course of minutes or hours, and using this technique, processes such as RNP transport, epithelial morphogenesis, and tissue remodeling have been described in great detail in Drosophila oocytes1,2.
The ability to perform video imaging combined with a rich repertoire of mutants allows an enormous variety of genes and processes to be examined in incredible detail. One such example is the process of ooplasmic streaming, which initiates at mid-oogenesis3,4. This vigorous movement of cytoplasmic vesicles is microtubule and kinesin-dependent5 and provides a useful system for investigating cytoskeleton function at these stages.
Here I present a protocol for time lapse imaging of living oocytes using virtually any confocal microscopy setup.

Live Imaging of GFP-labeled Proteins in Drosophila Oocytes

A protocol for live imaging of GFP-tagged proteins or autofluorescent structures in individual Drosophila oocytes is described.

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-<em&gt; דרוזופילה</em&gt; ביציות

The  Drosophila oocyte has been established as a versatile system for investigating  fundamental questions such as cytoskeletal function, cell ...

Live Imaging of the Drosophila Pupal Eye Using Fluorescence Microscopy

Source:&#160;<a href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/52120/live-imaging-of-the-drosophila-pupal-eye'>Hellerman, M. B.,&#160;et al.&#160;Live-imaging of the&#160;Drosophila Pupal Eye.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)</a>The video demonstrates a live-imaging technique to study eye patterning in a&#160;Drosophila melanogaster pupa. Green fluorescent protein (GFP)-tagged markers enable visualization of cellular organization and differentiation during the formation of the developing eye structure.

Source:&#160;Hellerman, M. B.,&#160;et al.&#160;Live-imaging of the&#160;Drosophila Pupal Eye.&#160;J. Vis. Exp.&#160;(2015)The video demonstrates a ...

JoVE Encyclopedia of Experiments

Neuroimaging

Live Imaging & In Vivo Tracking

Imaging of Fluorescently-Labeled Motor Neurons in an Adult Drosophila Leg

Source:&#160;<a style='text-decoration:none;' href='https://app-jove-com.bdigitaluss.remotexs.co/v/58365/visualize-drosophila-leg-motor-neuron-axons-through-the-adult-cuticle'><span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Guan, W.,&#160;et. al<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>. Visualize&#160;Drosophila&#160;<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle.&#160;J. Vis. Exp<span style='-webkit-text-decoration-skip:none;font-family:Arial,sans-serif;font-size:12pt;font-style:normal;font-variant:normal;font-weight:400;text-decoration-skip-ink:none;vertical-align:baseline;white-space:pre-wrap;'>. (2018)</a> &#160;<meta charset='utf-8'>This video demonstrates imaging of&#160;Drosophila legs with green fluorescent protein-expressing motor neurons using confocal microscopy. A laser and two detectors capture GFP and cuticle autofluorescence. Images are processed by splitting channels, subtracting autofluorescence, and merging into a colored composite image to visualize axons within the leg segment.

Source:&#160;Guan, W.,&#160;et. al. Visualize&#160;Drosophila&#160;Leg Motor Neuron Axons Through the Adult Cuticle.&#160;J. Vis. Exp. (2018)&#160;This ...

העגבניות / GFP-FLP / FRT שיטת ההדמיה חיה של פסיפס למבוגרים בלבד

Summary

Explore More Videos

Live-הדמיה של

Live-תא הדמיה של תאים מבשר חושי האיברים אינטקט תסיסנית גלמים

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Mesoscopic Fluorescence טומוגרפיה עבור In-vivo הדמיה של פיתוח תסיסנית

הדמיה וניתוח של כיוון רקמות ודינמיקה בפיתוח הדרוזולה אפיתליה במהלך שלבי pupal

הכנת פיתוח למבוגרים תסיסנית מוח רשתיות עבור הדמיה חיה

חי הדמיה של חלבוני ה-GFP שהכותרת ב-

Live Imaging of the Drosophila Pupal Eye Using Fluorescence Microscopy

Imaging of Fluorescently-Labeled Motor Neurons in an Adult Drosophila Leg