בתוך אורגניזמים רב תאיים, רקמות מציגות מעלות גבוהות עוד יותר בכיוון המרחבי שלהן. תאים ליישר ולהציג טווח של עדיפות על פני מרחקים גדולים במהלך morphogenesis. כדי להבין כיצד הסידורים הפלינאריים של האפיתליה מושגים במהלך הפיתוח, חיוני לעקוב אחר כיווני התא ודינמיקת הצמיחה עם נאמנות זמנית ספיאלית גבוהה ב- vivo.
הפרוטוקול המתואר נועד לדמיין ולנתח התנהגויות תאים ברמות גלובליות ומקומיות באפידרמיס הפופאלי drosophila. מתודולוגיה זו יכולה לספק תובנות על תיאוריה שונה של מחקר, ביולוגיה של התא, מורפוגנזה וקוטביות תכנן, ו ניתן ליישם אותה על ניתוח של רקמות, מבנים ומודלים אחרים. כל השלבים יכולים להתבצע בקלות לאחר תרגול כלשהו.
הם דורשים דיוק. הדמיה של פרוטוקול זה מסייעת בהשגת תוצאות מיטביות בזמן קצר יותר. ניתוח הגוונים מורכב.
כדי להתחיל, להשתמש במברשת צבע לחה להעביר מבוים לבן pre-pupae לבקבוקון פלסטיק טרי, ולשמור אותם שם כל עוד יש צורך ב 25 מעלות צלזיוס. לאחר מכן, להסיר כל גלם מקיר הבקבוקון בעזרת מטלות. הדבק את הצד הגחוני של כל גולם על מגלשת זכוכית מכוסה בקלטת דביקה דו צדדית.
הקש בעדינות על צריחי הראש ועל פני השטח הגביים של הגור עם קצות המדפים כדי להבטיח את הדבקה של מארז הגווע לקלטת. התחל לנתח תחת מיקרוסקופ סטריאו על ידי הסרת בעדינות את אופרקולום מן puparium עם המדפים. הכנס קצה אחד של המלקחים במארז רדוד בין המארז הגורי לבין משטח הגופה דרך פתח הניתוח.
לקרוע את המקרה מכף אל זנב באופן משני בנדנדה אחת או יותר, הימנעות צביטת הגופה. מקפלים בחזרה את המקרה pupal סדוק לצדדים הצדדיים כפי שאתה ממשיך להמשיך עד הקצה האחורי. הסר את הגופה מן המקרה הגלוי נפתח על ידי החדרת בזהירות את המדפים מתחת לחיה בעדינות מושך למעלה.
הגופה נדבקת לקצה המדפים. מחזיקים את הגלימה בעדינות בצד הגחוני, ומעבירים את הגופה לצלחת עם תחתית זכוכית על גבי טיפה קטנה של שמן הלוקרבון חדיר לגז. מגלגלים חתיכת נייר טישו רטוב בשולי המנה ומכסים את המנה כדי לשמור על לחות.
לכוון את הגומד מעל טיפת השמן על המנות בתחתית הזכוכית על פי התחום ואת התהליך שיש להעריך. במשך זמן רב לחיות הדמיה של ההתפשטות המוקדמת של הקינים הגביים, הגבי לכוון את הגלם. כדי לדמיין את ההתפשטות המאוחרת שלהם ואת שיפוץ הרקמות, כוון את הגלמים.
מעבירים את המנה עם תחתית הזכוכית המכילה את הגלמים הרכובים לשלב המיקרוסקופ ומתמקדים על פני השטח של אזור הבטן באמצעות אור משודר. כדי להשתמש recombination mitotic כדי לגרום פסיפסים גנטיים באפיתל הבטן, להכין נקבות בתולה נושאת flipase הלם חום בלתי ניתן לעיכול, אתר FRT במיקום גנומי מסוים, ו דיסטל סמן הסלולר לזיהוי לאתר FRT. הכינו זכרים מוטנטים הנושאים אתר FRT במיקום הגנומי המקביל.
חוצים כמה נקבות וזכרים בפרופורציה אחת עד שלוש בבקבוקון פלסטיק ב 25 מעלות צלזיוס במשך ארבעה עד חמישה ימים. כדי ליצור שיבוטים סומטיים בהיסטובלסטים, בצע טיפול בהלם חום בשלב הזחל השלישי של צאצאי הצלב על ידי טביעה של בקבוקוני הפלסטיק המכילים את בעלי החיים באמבט מים ב 37 מעלות צלזיוס במשך 45 דקות עד שעה. בתוכנת התמונה J, השתמש בפונקציית ההקרנה בעוצמה המרבית כדי להגן על פרוסות מחסנית Z שנרכשו על-ידי מיקרוסקופ קונפוקל ב- 2D.
לקנים צורה אופיינית שמכווןת אותם במערכת קואורדינטות פלנארית לפנים שמאלה ודורסל למעלה. כדי להשיג תוצאות מיטביות עם ניתוח זה, יש לרכוש את תמונת הקלט ברזולוציה גבוהה. כדי להשיג ערכי כיוון איכותיים בקצוות תאים מקומיים, לחץ על תפריט התוסף ובחר באפשרות התפלגות J בכיוון.
הגדר את סיגמא החלון הגאוסיאני לפיקסל אחד, spline מעוקב למילוי הדרגתי, קוהרנטיות מינימלית ל- 20 אחוזים ואנרגיה מינימלית לאחוז אחד. השתמש באפשרות סקר הצבעים של התוסף. הגדר את הגוון לכיוון, לרוויה לקוהרנטיות ולבהירות כדי להזין תמונה.
צבע זה מקודדים כיוון קצה תא יחסית למערכת הקואורדינטות התבלתי-תכולה. לאחר מכן, תחת תפריט התוסף, השתמש באפשרות מדידת J בכיוון כדי לכמת כיוונים סלולריים ותא כיווני ליישור תאים. צור אזורים קטנים, סמוכים שאינם חופפים של עניין במשקל אחיד סביב 20 מיקרומטר פעמים 20 מיקרומטר בתוך האזור שנכבש על ידי ההיסטובלסטים.
מדידה לוחצת מחשבת את הכיוון המקומי הדומיננטי ואת הקוהרנטיות של ה- ROIs. במחקר זה, המתודולוגיה המשמשת מסוגלת ליצור סרטים ברזולוציה גבוהה של הגלמים המתפתחים לתקופות של עד 48 שעות ללא הלבנת תמונות משמעותית או רעילות תמונה. דוגמאות של שיבוטים מסוג פראי המסומנים על ידי היעדר RFP NLS ואת כתמים התאומים שלהם ב 26 שעות לאחר היווצרות puparium מוצגים כאן.
השיבוטים התארכמו לאורך גבולות המקטעים. שיבוטים תאומים מסודרים במקביל או במקביל. מורפולוגיה של שיבוט מסוג פראי ב 26 שעות ו 47 שעות לאחר היווצרות פופאריום מראה מורפולוגיה גבול מורכבת בשני השלבים.
חלקות קופסה ושפם עבור פרמטרים גיאומטריים ב 26 שעות ו 47 שעות לאחר היווצרות puparium להראות את השטח הממוצע ואת ההיקף גדל באופן משמעותי בחלון זמן זה. כיוון השיבוט נמשך במהלך התרחבות ושיפוץ. פרמטרי צורה ב 26 שעות ו 47 שעות לאחר היווצרות puparium מצביעים על חספוס, מעוגל ועגול בקושי השתנה שיבוטים סוג פראי.
הקפד לא לפגוע בגלם, אחרת הוא ימות תוך כמה שעות, וישפיע על ההדמיה החיה. פרוטוקול זה אינו דורש להשתמש בריג'נט או בכלי סרקטוס. הימנע צובט את עצמך בעת לנתח.
על ידי יישום מתודולוגיות אלה ניתן ליצור סרטים ברזולוציה גבוהה לתקופות ארוכות באמצעות טכניקות לדמיין שונים. מוקד לדיסקים פוטון או ספינינג. ניתוח כלורל יכול להיות מועסק כדי לחקור תגובות לא אוטונומיות מאז תאים אקראיים להקל בזיהוי של שיחות צולבת או מנגנוני תקשורת סלולרית.
ניתן להתאים שיטות אלה בקלות לחקר מגוון רחב של תופעות מורפגנטיות, כולל תיאום של התפתחות אפידרמיס, שרירים ונוירו במהלך מטמורפוזה.
