Name: collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos
Uploaded: 2009-03-27T00:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 36 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos at JoVE.com

עבודה זו נתמכה על ידי Ministerio ספרדית דה Educación y Ciencia (BIO 2006-11792) ואת Generalitat דה קטלוניה (2005-SGR00437). המחברים מבקשים להודות מארק Puigcerver ואת יונתן לוקאס לקבלת סיוע טכני שלהם בהכנת התקשורת. כל הצוות של ד &#39;Servei Estabulari הוא הודה לדיור בעלי חיים, ובעיקר חואן חוסה מרטין חבייר בניטו על תרומה נוספת על הקלטה של ​​וידאו חלק זה. NCB הוא עמית של Fundação פורטוגזית פסקה דואר Ciência Tecnologia ו SG הוא עמית של הספרדי Ministerio de Educación y Ciencia.

טיפול בבעלי חיים ונהלים נערכו על פי הנחיות ותקנות שאושרו על ידי ועדת האתיקה על בעלי חיים ומחקר האדם של אוניברסיטת האוטונומית של ברצלונה, ספרד. אני אוסף הביצית <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בדוק ובחר אוגרים הנקבה (Mesocricetus auratus; 8-12 בשבוע הישן) של זן הסורי הזהב עבור נוכחות של הפרשות הנרתיק עבה (פריקה postovulatory). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לגרום לנקבות שנבחרו superovulate בזריקה intraperitoneal של 40 IU של PMSG (בהריון Mare סרום גונדוטרופין) ואחריו 40 IU של hCG (גונדוטרופין כוריוני אנושי) 60 שעות לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים אוגרים הנקבה 16 שעות לאחר מתן hCG בתא פחמן דו חמצני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בודד oviducts מן הנקבות כפי שמוצג בסרטון ולהעבירם ירידה של המדיום KSOM-H. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> איסוף הביצית-תלולית על ידי מתחמי קריעת ampulla oviduct תחת מיקרוסקופ סטריאוסקופית ירידה של hyaluronidase (156 U / ml) בשעה 37 ° C. ביציות יתפנה מן התאים קומולוס בתוך כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תרימי ביציות מן hyaluronidase ולשטוף אותם פעמיים בינוני KSOM-H. </li></ol> עבור אוסף של עוברי עכברים, נקבות עכברים (Mus שריר: 6-8 בשבוע הישן) הם המושרה על ידי הזרקה superovulate intraperitoneal של 5 IU של PMSG ואחריו 5 IU של hCG 48 שעות מאוחר יותר הזדווגו עם עכברים זכרים. נקבות מוקרבים על ידי נקע בצוואר הרחם ב 24-26, 44-46 או 54-56 שעות לאחר מתן של hCG עבור obtention של pronuclear, 2 תאים או 4 תאים עוברים שלב, בהתאמה. אוסף של עוברים pronuclear מתבצעת בדיוק כפי שתואר עבור ביציות אוגר. עוברים בשלבים 2 תאים ו 4 תאים נאספים על ידי שטיפה עם oviducts בינוני KSOM-H [6]. הערה: בעקבות פרוטוקול זה כ 20-30 ביציות / עוברים ניתן לאסוף מן הנקבה כל אחד. השנייה. הכנת מקפיא הפשרה פתרונות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון אני על ידי דילול 0.57 מ&quot;ל של propilenglycol ב 5 מ&quot;ל של KSOM-H (1.5 מ &#39;של propilenglycol). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הפשרה על ידי הוספת 2 מ&quot;ל של KSOM-H לצינור עם סוכרוז 0.2052 גרם (0.3 מ &#39;של סוכרוז). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן פתרון הקפאת ידי הוספת 2 מ&quot;ל של תמיסת אני לצינור עם סוכרוז 0.0684 גרם (1.5 מ &#39;של propilenglycol ו 0.1 סוכרוז M). </li></ol> הערה: אני פתרון מקפיא הפשרה הפתרונות צריכים להיות מוכנים רק לפני השימוש בהם. עם זאת, הסכומים המפורטים של סוכרוז לשמש להכנת הקפאת פתרונות הפשרה עשוי להיות משוקלל מראש ומאוחסנים 3 מ&quot;ל שפופרות בטמפרטורת החדר במשך כמה חודשים. ג. הקפאת פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביציות / עוברים ממדיום KSOM-H ירידה של פתרון ואני דגירה של 7-15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בינתיים, להכין צלחת פטרי 90 מ&quot;מ כדי לטעון את קשיות ידי הצבת 90 טיפות של μl מקפיא הפשרה פתרונות כמו זה המוצג בסרטון (1 טיפה של כל פתרון / קש). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מעבירים את המספר הרצוי של ביציות / עוברים את טיפות פתרון מקפיא. הערה: אנו בדרך כלל העברה בין 5-30 ביציות או עוברים / ירידה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף קש למערכת שאיפה לשלוט בפה לטעון אותו הבאים בסדר הזה: הפתרון אני, אוויר, ירידה הקפאה עם ביציות, אוויר, ירידה הפשרה, אוויר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קש נטען, לשמור aspirating עד הטיפה הראשונה הציג (פתרון אני) מגיע פולימר בקצה העליון של הקשית וחותמות הזה סוף. Thermo-חותם את הקצה השני של קש או חותם עם פקק פלסטיק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את במקפיא לתכנות ובחר את תוכנית ההקפאה. תוכנית הקפאת בשימוש פרוטוקול זה מבוסס על שיעורי קירור פורסם במקור על ידי לאסאל et al. [7]: <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 2 ° C / min מ בטמפרטורת החדר ל -7 ° C 0 ° C / min 10 דקות, כדי לאפשר איזון הטמפרטורה של זריעת אינדוקציה (ראה להלן) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.3 ° C / min מ -7 ° C ל -30 ° C 0 ° C / min 2 דקות, כדי לאפשר איזון הטמפרטורה </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 35 ° C / min מ -30 ° C ל -130 ° C </li></ul></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את קשיות על החריצים של בעל במקפיא לתכנות, ולוודא כי החלק של קש עם ירידה של פתרון הפשרה פונה כלפי חוץ. הפעל את תוכנית ההקפאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר הטמפרטורה מגיעה ל -7 מדגם ° C וקירור בהמתנה, לבצע זריעה ידנית: לצלול מלקחיים לתוך חנקן נוזלי, למשוך את מחזיקי מעט מהמקפיא כדי לחשוף את החלק של קשיות המכיל את טיפות פתרון הפשרה, ומיד המגע החלק הזה של קשיות עם מלקחיים. חזור לבעל ולכל קש בעל ולאחר מכן אפשר להריץ את תוכנית ההקפאה עד הסוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר התוכנית תושלם, לצלול בעלי בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קשיות מןמחזיקי ולהעבירם gobelet שכותרתו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבסוף, בחנות gobelet בתוך טנק חנקן נוזלי. </li></ol> IV. הפשרה פרוטוקול <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את קש מהטנק חנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על קש בטמפרטורת החדר למשך 40 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את קש באמבט מים ב 30 ° C במשך 40 שניות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את תקע מתוך קש או לחתוך את קצה תרמו אטום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוקן את קש בצלחת פטרי בגודל 35 מ&quot;מ בעדינות מערבבים את שתי טיפות המכילות את המקפיא הפשרת פתרונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השאירו ביציות / עוברים בתערובת במשך 15 דקות בטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת ביציות / עוברים לירידה טרי KSOM-H על 15 דקות נוספות ב 37 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ביציות / עוברים כעת מוכן מניפולציה נוספת. </li></ol> הערה: במהלך שלבים 6 ו -7 אתה צריך לראות כי ביציות מופשר / עוברים לאט להתנפח עקב התייבשות. V. תוצאות נציג השימוש בפרוטוקול cryopreservation דיווחו כאן התוצאה היא שיעור הישרדות של כ 95% עבור ביציות אוגר של 90%&gt;, 85% ו 80% עבור B6CBAF1 עוברי עכברים בבית pronuclear, 2 תאים בשלבים 4 תאים, בהתאמה. כאשר עוברי עכברים הם מתורבתים במבחנה ב KSOM לאחר ההפשרה, לפחות 70 עד 80% צריך להגיע לשלב הבלסטוציסט בתנאים אופטימליים תרבות. מומלץ לכלול קבוצת ביקורת (קש) של ביציות / עוברים כל ניסוי מקפיא שאתה להפשיר את הקבוצה הזאת לפני שאר ביציות / עוברים משמשים מניפולציות נוספות. אם שיעורי ההישרדות בקבוצת הביקורת נמוכים מהצפוי, להפשיר עוד קש ממגרש אותו. אם שיעורי ההישרדות של הקבוצה השנייה הם גם נמוכים, לבטל את קשיות הנותרים ממגרש זה מקפיא.

<ol>
	<li>Whittingham, D. G., Leibo, S. P., Mazur, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survival+of+mouse+embryos+frozen+to+-196+and+-269+&#176;C.">Survival of mouse embryos frozen to -196 and -269 &#176;C.</a> Science. 178, 411-414 (1972).</li><li>Wilmut, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+cooling+rate,+warming+rate,+cryoprotective+agent+and+stage+of+development+on+survival+of+mouse+embryos+during+freezing+and+thawing.">The effect of cooling rate, warming rate, cryoprotective agent and stage of development on survival of mouse embryos during freezing and thawing.</a> Life Sci. 11, 1071-1079 (1972).</li><li>Parkening, T. A., Tsunoda, Y., Chang, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+various+low+temperatures,+cryoprotective+agents+and+cooling+rates+on+the+survival,+fertilizability+and+development+of+frozen-thawed+mouse+eggs.">Effects of various low temperatures, cryoprotective agents and cooling rates on the survival, fertilizability and development of frozen-thawed mouse eggs.</a> J. Exp. Zool. 197, 369-374 (1976).</li><li>Schneider, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryobiological+principles+of+embryo+freezing.">Cryobiological principles of embryo freezing.</a> J. In Vitro Fert. Embryo Transf. 3, 3-9 (1986).</li><li>Vajta, G., Kuwayama, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Improving+cryopreservation+systems.">Improving cryopreservation systems.</a> Theriogenology. 65, 236-244 (2006).</li><li>Duselis, A. R., Vrana, P. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Retrieval+of+mouse+oocytes.">Retrieval of mouse oocytes.</a> JoVE. 3, (2007).</li><li>Lassalle, B., Testart, J., Renard, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+embryo+features+that+influence+the+success+of+cryopreservation+with+the+use+of+1,2+propanediol.">Human embryo features that influence the success of cryopreservation with the use of 1,2 propanediol.</a> Fertil. Steril. 44, 645-651 (1985).</li><li>Ib&#225;&#241;ez, E., Grossmann, M., Vidal, F., Egozcue, J., Santal&#243;, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cryopreservation+of+caprine+beta-lactoglobulin+transgenic+mouse+embryos.">Cryopreservation of caprine beta-lactoglobulin transgenic mouse embryos.</a> Cryobiology. 35, 290-298 (1997).</li><li>Dinnyes, A., Wallace, G. A., Rall, W. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+genotype+on+the+efficiency+of+mouse+embryo+cryopreservation+by+vitrification+or+slow+freezing.">Effect of genotype on the efficiency of mouse embryo cryopreservation by vitrification or slow freezing.</a> Mol. Reprod. Dev. 40, 429-435 (1995).</li><li>Tateno, H., Kamiguchi, Y., Mikamo, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+freezing+and+thawing+method+of+hamster+oocytes+designed+for+both+the+penetration+test+and+chromosome+assay+of+human+spermatozoa.">A freezing and thawing method of hamster oocytes designed for both the penetration test and chromosome assay of human spermatozoa.</a> Mol. Reprod. Dev. 33, 202-209 (1992).</li><li>Biggers, J., McGuinnis, L. K., Raffin, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Amino+acids+and+preimplantation+development+of+the+mouse+in+the+protein-free+KSOM.">Amino acids and preimplantation development of the mouse in the protein-free KSOM.</a> Biol. Reprod. 63, 281-293 (2000).</li></ol>

עם ביציות זה אוגר פרוטוקול עוברי עכבר ניתן cryopreserved בהצלחה. קפוא פעם, ביציות / עוברים ניתן לאחסן מכלי חנקן נוזלי ללא הגבלת זמן והחלים בכל זמן או מקום הרצוי. זו מציעה את היתרון שיש דגימות כמעט מוכנה להשתמש בכל פעם לפי הצורך. מצד שני, פרוטוקול זה יכול לשמש גם כדי לייצר cryobanks העובר מן הזנים העכבר ערך (כגון קווי מהונדס), כחלופה חסכוני ובטוח יותר לשמירה על מושבות חיים לחיות. חשוב לציין כי פרוטוקול מותאם cryopreserve ביציות אוגר היברידית עוברי עכבר B6CBAF1. הבדלים שלאחר ההפשרה שיעורי ההישרדות בקרב עוברי עכבר עם רקע גנטי שונה תוארו 8,9, ולכן יש להיזהר כדי להעריך את התנאים cryopreservation על כל זן של המין או ביציות / עוברים להקים את הפרוטוקול המתאים לפני הדור של הביצית או העובר cryobanks. ביציות אוגר ניתן להשתמש אנושי מרפאות רבייה סייעה לבדיקה חדירת זרע או לניתוח הזרע כרומוזום 10, או כמו לתרגל חומר למתחילים הזרקת זרע intracytoplasmic (ICSI). מצד שני, היברידית עכבר B6CBAF1 עוברים בשלבים pronuclear או 2 תאים ניתן להשתמש בסיוע אנושי מרכזי רבייה או במעבדות מחקר כדי לבדוק את האיכות של תרבות התקשורת העובר או את התפקוד התקין של החממות.

<table><tbody><tr><td>Material Name</td><td>Type</td><td>Company</td><td>Catalogue Number</td><td>Comment</td></tr><tr><td>French type mini-straw 0.25 ml</td><td></td><td>Mini-tub</td><td>13407/0010</td><td></td></tr><tr><td>hCG</td><td></td><td>Farma-Lepori, Spain</td><td>749036.4</td><td></td></tr><tr><td>Hyaluronidase</td><td></td><td>Sigma</td><td>H-3884</td><td></td></tr><tr><td>KSOM-H medium</td><td></td><td></td><td></td><td>Ref. [11]</td></tr><tr><td>Liquid Nitrogen </td><td></td><td>Air Liquide</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Plastic plugs</td><td></td><td>Mini-tub</td><td>19046</td><td></td></tr><tr><td>PMSG</td><td></td><td>Intervet, Spain</td><td>1.614/8447</td><td></td></tr><tr><td>Propilenglycol</td><td></td><td>Fluka</td><td>82280</td><td></td></tr><tr><td>Sucrose</td><td></td><td>Merck</td><td>107687</td><td></td></tr><tr><td>Surgical Scissors</td><td></td><td>Aesculap</td><td>BC-060R; BG-061R</td><td></td></tr><tr><td>Thermo-sealer</td><td></td><td>SIZ</td><td>220</td><td></td></tr><tr><td>35 and 90 mm culture dishes</td><td></td><td>Nunc</td><td>153066; 150350</td><td></td></tr><tr><td>10 ml tubes</td><td></td><td>Greiner Bio-one</td><td>163160</td><td></td></tr><tr><td>Nitrogen tank</td><td></td><td>MVE, Cryogenics</td><td>XC 43/28</td><td></td></tr><tr><td>Programmable Freezer</td><td></td><td>Planner Products Ltd.</td><td>Kryo-10 Series III</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td></td><td>Aesculap</td><td>BD-331R; BD-053R; OC-020R</td><td></td></tr></tbody></table>

collection and cryopreservation of hamster oocytes and mouse embryos

עוברים וביציות היו הראשונים cryopreserved בהצלחה יותר מ -30 שנים, כאשר Whittingham<i&gt; Et al.</i&gt;<sup&gt; 1</sup&gt; ו וילמוט<sup&gt; 2</sup&gt; תיאר בנפרד כי עוברי עכבר יכול להיות קפוא המאוחסן -196 מעלות צלזיוס, כמה שנים מאוחר יותר, Parkening<i&gt; ואח&#39;</i&gt;.<sup&gt; 3</sup&gt; דיווח על לידת צאצאים חיים הנובע הפריה חוץ גופית (IVF) של ביציות cryopreserved. מאז, השימוש בטכניקות cryopreservation התפשט במהירות להיות מרכיב חיוני בפועל של שעתוק בסיוע אדם ובעלי חיים ועל שימור משאבי גנטית של חיות. נכון לעכשיו, יש שתי שיטות עיקריות משמש cryopreserve ביציות ועוברים: הקפאת vitrification איטי. מגוון רחב של גישות שימשו כדי לנסות לשפר הן טכניקות של מיליוני בעלי חיים אלפי ילדים נולדו מעוברים cryopreserved. עם זאת, חסרונות חשובים הקשורים ל cryopreservation עדיין צריך להתגבר, מאז היווצרות קרח קריסטל, אפקטים פתרון הלם אוסמוטי נראה לגרום cryoinjuries מספר שלאחר להפשיר ביציות ועוברים. הקפאה איטית עם מקפיאים לתכנות יש את היתרון של שימוש בריכוזים נמוכים של cryoprotectants, אשר מזוהה בדרך כלל עם רעילות כימית הלם אוסמוטי, אבל היכולת שלהם למנוע היווצרות קרח קריסטל בריכוזים נמוכים היא מוגבלת. הקפאה איטית גם גורם תופעות קירור כי יש להימנע באמצעות זריעה ידנית או אוטומטית<sup&gt; 4</sup&gt;. בתהליך vitrification, ריכוזים גבוהים של cryoprotectants לדכא היווצרות של גבישי קרח ו להוביל להיווצרות של מדינה מזוגגת glasslike שבו המים הקרושה, אך לא הרחיב. עם זאת, בשל רעילות של cyroprotectants על ריכוזי בשימוש, ביציות / עוברים רק יכול להיחשף לפתרון cryoprotectant לתקופה קצרה מאוד של זמן בפתרון נפח המינימום, לפני השריית דגימות ישירות חנקן נוזלי<sup&gt; 5</sup&gt;. בעשור האחרון, vitrification הפך פופולרי יותר כי היא שיטה מהירה מאוד שבו לא ציוד יקר (במקפיא לתכנות) נדרשת. עם זאת, הקפאה איטית ממשיכה להיות השיטה הנפוצה ביותר עבור cryopreservation הביצית / העובר. במאמר וידאו זה אנו מראים, צעד אחר צעד, איך לאסוף לאט להקפיא ביציות אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.

Watch this Scientific Journal Video about Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos at JoVE.com

Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

במאמר וידאו זה אנו מציגים הפגנה צעד אחר צעד כיצד לאסוף ביציות cryopreserve אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.

איסוף cryopreservation של ביציות ועוברים אוגר עכבר

Embryos and oocytes were first successfully cryopreserved more than 30 years ago, when Whittingham et al. 1 and Wilmut 2 separately described that mouse ...

collection-and-cryopreservation-of-hamster-oocytes-and-mouse-embryos

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Biology

16.9K Views.  Universitat Autonoma de Barcelona. במאמר וידאו זה אנו מציגים הפגנה צעד אחר צעד כיצד לאסוף ביציות cryopreserve אוגר עם שלאחר ההפשרה שיעור גבוה הישרדות. ההליך אותו יכול גם להיות מיושם בהצלחה להקפיא להפשיר עוברי עכבר בשלבים שונים של פיתוח preimplantation.

Video: Collection and Cryopreservation of Hamster Oocytes and Mouse Embryos

Retrieval of Mouse Oocytes

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus Genetic Stock Center (http://stkctr.biol.sc.edu), we are characterizing the salient differences needed to develop this system.  A primary goal has been to optimize oocyte/early embryo retrieval.

This protocol illustrates the technique for extracting oocytes or early-stage fertilized embryos from the oviduct of mice. The ability to identify the infindibulum and insert a blunt end needle into it is essential to correctly performing the procedure.

איחזור של ביציות עכבר

To date, only a few studies have reported successful manipulations of Peromyscus embryogenesis or reproductive biology.  Together with the Peromyscus ...

Derivation of Stem Cell Lines from Mouse Preimplantation Embryos

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines retain the ability to either self-renew or differentiate under specific conditions. Due to these properties, mESC are a useful tool in regenerative medicine, disease modeling, and tissue engineering studies. This article describes a simple protocol to obtain mESC lines with high derivation efficiencies (60-80%) by culturing blastocysts from permissive mouse strains on feeder cells in defined medium supplemented with leukemia inhibitory factor. The protocol can also be applied to efficiently derive mESC lines from non-permissive mouse strains, by the simple addition of a cocktail of two small-molecule inhibitors to the derivation medium (2i medium). Detailed procedures on the preparation and culture of feeder cells, collection and culture of mouse embryos, and derivation and culture of mESC lines are provided. This protocol does not require specialized equipment and can be carried out in any laboratory with basic mammalian cell culture expertise.

This article describes a protocol to efficiently derive and culture pluripotent stem cell lines from mouse embryos at the blastocyst stage.

נגזרת של שורות תאי גזע מעוברים של עכבר

Mouse embryonic stem cell (mESC) derivation is the process by which pluripotent cell lines are established from preimplantation embryos. These lines ...

Developmental Biology

Use of Freeze-thawed Embryos for High-efficiency Production of Genetically Modified Mice

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. The CRISPR/Cas9 system allows researchers to modify the genome with unprecedented efficiency, fidelity, and simplicity. Harnessing this technology, researchers are seeking a rapid, efficient, and easy protocol for generating GM mice. Here we introduce an improved method for cryopreservation of one-cell embryos that leads to a higher developmental rate of the freeze-thawed embryos. By combining it with optimized electroporation conditions, this protocol allows for the generation of knockout and knock-in mice with high efficiency and low mosaic rates within a short time. Furthermore, we show a step-by-step explanation of our optimized protocol, covering CRISPR reagent preparation, in vitro fertilization, cryopreservation and thawing of one-cell embryos, electroporation of CRISPR reagents, mouse generation, and genotyping of the founders. Using this protocol, researchers should be able to prepare GM mice with unparalleled ease, speed, and efficiency.

Here, we present a modified method for cryopreservation of one-cell embryos as well as a protocol that couples the use of freeze-thawed embryos and electroporation for the efficient generation of genetically modified mice.

השימוש של עוברים הקפאת-הפשפה לייצור יעילות גבוהה של עכברים ששונו גנטית

The use of genetically modified (GM) mice has become crucial for understanding gene function and deciphering the underlying mechanisms of human diseases. ...

Genetics

Minimum Volume Vitrification of Immature Feline Oocytes

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to promote biodiversity preservation. In felids, most species are threatened with extinction, and domestic breeds are used as a model to increase the efficiency of protocols for germplasm banking. Among oocyte cryopreservation techniques, vitrification is more and more popular in human and veterinary assisted reproduction. Cryotop vitrification, which was at first developed for human oocytes and embryos, has demonstrated to be well-suited for cat oocytes. This method offers several advantages, such as the feasibility in field conditions and the speed of the procedure, which can be helpful when several samples need to be processed. However, the efficiency is strongly dependent on the operator&#8217;s skills, and intra- and inter-laboratory standardization are needed, as well as personnel training. This protocol describes minimum volume vitrification of immature feline oocytes on a commercial support in a step by step field-friendly protocol, from oocyte collection to warming. Following the protocol, preservation of oocyte integrity and viability at warming (as high as 90%) can be expected, although there is still room for improvement in post-warming maturation and embryonic development outcomes.

This manuscript describes a protocol for the minimum volume vitrification of immature cat oocytes with laboratory-made media on commercial supports. It covers every step from oocyte isolation from ex vivo gonads to vitrification and warming.

כמות מינימלית של ויטריפיקציה של חתולים לא בוגרים

In wild animals&#8217; conservation programs, gamete banking is crucial to safeguard genetic resources of valuable individuals and rare species and to ...

Mouse Oocyte Microinjection, Maturation and Ploidy Assessment

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells. In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Haploid gametes form through species-specific developmental programs that are coupled to meiosis. The first meiotic division (MI) is unique to meiosis because sister chromatids remain attached while homologous chromosomes are segregated. For reasons not fully understood, this reductional division is prone to errors and is more commonly the source of aneuploidy than errors in meiosis II (MII) or than errors in male meiosis 1,2. 
In mammals, oocytes arrest at prophase of MI with a large, intact germinal vesicle (GV; nucleus) and only resume meiosis when they receive ovulatory cues. Once meiosis resumes, oocytes complete MI and undergo an asymmetric cell division, arresting again at metaphase of MII. Eggs will not complete MII until they are fertilized by sperm. Oocytes also can undergo meiotic maturation using established in vitro culture conditions 3. Because generation of transgenic and gene-targeted mouse mutants is costly and can take long periods of time, manipulation of female gametes in vitro is a more economical and time-saving strategy. 
Here, we describe methods to isolate prophase-arrested oocytes from mice and for microinjection. Any material of choice may be introduced into the oocyte, but because meiotically-competent oocytes are transcriptionally silent 4,5 cRNA, and not DNA, must be injected for ectopic expression studies. To assess ploidy, we describe our conditions for in vitro maturation of oocytes to MII eggs. Historically, chromosome-spreading techniques are used for counting chromosome number 6. This method is technically challenging and is limited to only identifying hyperploidies. Here, we describe a method to determine hypo-and hyperploidies using intact eggs 7-8. This method uses monastrol, a kinesin-5 inhibitor, that collapses the bipolar spindle into a monopolar spindle 9 thus separating chromosomes such that individual kinetochores can readily be detected and counted by using an anti-CREST autoimmune serum. Because this method is performed in intact eggs, chromosomes are not lost due to operator error.

Oocytes are prone to aneuploidy due to errors in chromosome segregation during meiotic maturation. Aneuploid eggs can cause infertility, miscarriages or developmental disorders like Down syndrome. Here, we describe methods to introduce materials of choice into oocytes and methods to study meiotic maturation and assess ploidy.

הביצית Microinjection עכבר, הבשלה ו Ploidy הערכה

Mistakes in chromosome segregation lead to aneuploid cells.  In somatic cells, aneuploidy is associated with cancer but in gametes, aneuploidy leads to ...

Cryopreservation of Mouse Embryos by Ethylene Glycol-Based Vitrification

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic modifications and the number is consistently increasing year by year. Its technical development started with slow freezing methods in the 1970s1, then followed by vitrification methods developed in the late 1980s2. Generally, the latter technique is advantageous in its quickness, simplicity, and high survivability of recovered embryos. However, the cryoprotectants contained are highly toxic and may affect subsequent embryo development. Therefore, the technique was not applicable to certain strains of mice, even when the solutions are cooled to 4&deg;C to mitigate the toxic effect during embryo handling. At the RIKEN BioResource Center, more than 5000 mouse strains with different genetic backgrounds and phenotypes are maintained3, and therefore we have optimized a vitrification technique with which we can cryopreserve embryos from many different strains of mice, with the benefits of high embryo survival after vitrifying and thawing (or liquefying, more precisely) at the ambient temperature4.
Here, we present a vitrification method for mouse embryos that has been successfully used at our center. The cryopreservation solution contains ethylene glycol instead of DMSO to minimize the toxicity to embryos5. It also contains Ficoll and sucrose for prevention of devitrification and osmotic adjustment, respectively. Embryos can be handled at room temperature and transferred into liquid nitrogen within 5 min. Because the original method was optimized for plastic straws as containers, we have slightly modified the protocol for cryotubes, which are more easily accessible in laboratories and more resistant to physical damages. We also describe the procedure of thawing vitrified embryos in detail because it is a critical step for efficient recovery of live mice. These methodologies would be helpful to researchers and technicians who need preservation of mouse strains for later use in a safe and cost-effective manner.

An ethylene glycol-based vitrification method for mouse embryos is described. It is advantageous to other methods in its simplicity and low embryonic toxicity, and therefore can be broadly applicable to many strains of mice, including inbred and gene-modified mice.

Cryopreservation של עוברי עכברים ידי Vitrification אתילן גליקול מבוסס

Cryopreservation of mouse embryos is a technological basis that supports biomedical sciences, because many strains of mice have been produced by genetic ...

Mouse Sperm Cryopreservation and Recovery using the I&middot;Cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies. Many of these valuable animals exist only as live animals, with no backup plan in case of emergency. Cryopreservation of embryos can provide this backup, but is costly, can be a lengthy procedure, and generally requires a large number of animals for success. Since the discovery that mouse sperm can be successfully cryopreserved with a basic cryoprotective agent (CPA) consisting of 18&#37; raffinose and 3&#37; skim milk, sperm cryopreservation has become an acceptable and cost-effective procedure for archiving, distributing and recovery of these valuable strains.
 Here we demonstrate a newly developed I&bull;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Sperm from five commonly-used strains of inbred mice were frozen using this kit and then recovered. Higher protection ratios of sperm motility (&gt; 60&#37;) and rapid progressive motility (&gt; 45&#37;) compared to the control (basic CPA) were seen for sperm frozen with this kit in 5 inbred mouse strains. Two cell stage embryo development after IVF with the recovered sperm was improved consistently in all 5 mouse strains examined. Over a 1.5 year period, 49 GM mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&bull;Cryo kit and later recovered by IVF.

Here we demonstrate the newly developed I&#x2022;Cryo kit for mouse sperm cryopreservation. Two-cell stage embryo development with frozen-thawed sperm was improved consistently in 5 mouse strains with the use of this kit. Over a 1.5 year period, 49 genetically modified mouse lines were archived by sperm cryopreservation with the I&#x2022;Cryo kit and later successfully recovered by IVF.

הזרע עכבר cryopreservation ושחזור באמצעות · אני cryo Kit

Thousands of new genetically modified (GM) strains of mice have been created since the advent of transgenesis and knockout technologies.  Many of these ...

Mouse Embryonic Development in a Serum-free Whole Embryo Culture System

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in an oxygenated rolling bottle culture system. Mouse embryos at E10.5 were carefully isolated from the uterus with intact yolk sac and in a process involving precise surgical maneuver the embryos were gently exteriorized from the yolk sac while maintaining the vascular continuity of the embryo with the yolk sac. Compared to embryos prepared with intact yolk sac or with the yolk sac removed, these embryos exhibited superior survival rate and developmental progression when cultured under similar conditions. We show that these mouse embryos, when cultured in a defined medium in an atmosphere of 95% O2 / 5% CO2 in a rolling bottle culture apparatus at 37 &#176;&#8203;C for 16-40 hr, exhibit morphological growth and development comparable to the embryos developing in utero. We believe this method will be useful for investigators needing to utilize whole embryo culture to study signaling interactions important in embryonic organogenesis.

Serum utilized in embryo cultures contains unknown components that can affect the outcome of experiments especially in studies involving signaling interactions. Here we utilized a serum-free oxygenated culture system and show that mid-gestation mouse embryos cultured for 16-40 hr&#160;exhibit morphological development comparable to embryos developing in utero.

עכבר עוברי פיתוח במערכת סרום ללא תרבות שלמה עובר

Mid-gestation stage mouse embryos were cultured utilizing a serum-free culture medium prepared from commercially available stem cell media supplements in ...

Meiotic Spindle Assessment in Mouse Oocytes by siRNA-mediated Silencing

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon fertilization. The resulting aneuploidy in developing embryos is recognized as a major cause of pregnancy loss and congenital birth defects such as Down&#8217;s syndrome. Accurate chromosome segregation is critically dependent on the formation of the microtubule spindle apparatus, yet this process remains poorly understood in mammalian oocytes. Intriguingly, meiotic spindle assembly differs from mitosis and is regulated, at least in part, by unique microtubule organizing centers (MTOCs). Assessment of MTOC-associated proteins can provide valuable insight into the regulatory mechanisms that govern meiotic spindle formation and organization. Here, we describe methods to isolate mouse oocytes and deplete MTOC-associated proteins using a siRNA-mediated approach to test function. In addition, we describe oocyte fixation and immunofluorescence analysis conditions to evaluate meiotic spindle formation and organization.

Here, we present a protocol for specific siRNA-mediated mRNA depletion followed by immunofluorescence analysis to evaluate meiotic spindle assembly and organization in mouse oocytes. This protocol is suitable for in vitro depletion of transcripts and functional assessment of different spindle and/or MTOC-associated factors in oocytes.

Meiotic ציר ההערכה בעכבר ביציות על ידי השתקה בתיווך siRNA

Errors in chromosome segregation during meiotic division in gametes can lead to aneuploidy that is subsequently transmitted to the embryo upon ...

Cryopreservation of Zebrafish Spermatogonia by Whole Testes Needle Immersed Ultra-Rapid Cooling

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods for safe storage of genetic resources beyond the common practices of keeping breeding colonies. The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Cryopreservation of early-stage germ cells by whole testes NIV offers possibilities for the storage of zebrafish genetic resources, especially since after transplantation they can mature into both male and female gametes. Testes were excised, pinned on an acupuncture needle, equilibrated in two cryoprotective media (equilibration solution containing 1.5 M methanol and 1.5 M propylene glycol; and vitrification solution containing 3 M dimethyl sulfoxide and 3 M propylene glycol) and plunged into liquid nitrogen. Samples were warmed in a series of three consequent warming solutions. The main advantages of this technique are (1) the lack of spermatozoa after digestion of warmed testes thus facilitating downstream manipulations; (2) ultra-rapid cooling enabling the optimal exposure of tissues to liquid nitrogen therefore maximizing the cooling and reducing the required concentration of cryoprotectants, thereby reducing their toxicity; (3) synchronous exposure of several testes to cryoprotectants and liquid nitrogen; and (4) repeatability demonstrated by obtaining viability of above 50% in five different zebrafish strains.

The main purpose of this study was to adapt the needle immersed vitrification (NIV) procedure to cryopreserve whole zebrafish testes. Additionally, the repeatability of the method in five different zebrafish strains was tested.

הקפאה קריוגנית של דג זברה Spermatogonia על ידי מחט האשכים כולו שקוע צינון אולטרה מהיר

Current trends in science and biotechnology lead to creation of thousands of new lines in model organisms thereby leading to the necessity for new methods ...