מודל עכבר של צלקות היפרטרופיות דמויות אדם המונעות על ידי מכניקה

פרוטוקול זה יסביר כיצד לבסס מודל עכברי צלקות היפרטרופיות המגביר את איתות הטרנסדוקציה המכנית כדי לדמות צלקות דמויות אדם. שיטה זו כוללת הגברת מתח מכני על פני חתך ריפוי בעכבר ושימוש במכשיר מיוחד ליצירת רקמת צלקת מוגזמת הניתנת לשחזור לצורך ניתוחים היסטולוגיים וביואינפורמטיים מפורטים.

הצטלקות היפרטרופית (HTS) היא תהליך לא תקין של ריפוי פצעים המביא להיווצרות מוגזמת של רקמת צלקת. במהלך העשור האחרון, הראינו כי טרנסדוקציה מכנית - המרה של גירויים מכניים לתגובות תאיות - מניעה ריפוי מוגזם של צלקות פיברוטיות. מודל עכבר להערכת צלקות היפרטרופיות דמויות אדם יהיה כלי חיוני לבחינת טיפולים שונים ויכולתם להפחית צלקות ולשפר את הריפוי. באופן ספציפי, המעבדה שלנו פיתחה מודל פצע עכברים שמגביר את המתח המכני כדי לקדם HTS דמוי אדם. פרוטוקול זה משתמש במכשירי העמסה ביומכניים, העשויים ממרחיבי חיך 13 מ"מ מותאמים, שזרועותיהם ממוקמות משני צידי החתך ומוסחות זו מזו בהדרגה על מנת להפעיל מתח מתמשך על מצע הפצע במהלך הריפוי. במשך כמעט שני עשורים של שימוש, מודל זה קודם משמעותית לשיפור היעילות והשחזור. באמצעות מודל HTS של עכברים, ניתן לגרום לצלקות פיברוטיות עוריות משמעותיות להיות דומות מבחינה היסטולוגית לצלקות היפרטרופיות אנושיות. מודל עכברי זה מספק סביבה לפיתוח תרופות ביולוגיות המעורבות בטיפול ב-HTS ובמצבים הקשורים למכניקה כגון תגובת גוף זר.

ריפוי פצעים, התהליך שבו הגוף מנסה לתקן רקמות פגועות ולבנות מחדש את מחסום העור, יכול לגרום לריפוי לא טיפוסי אם תהליכי המוסטזיס, דלקת, התפשטות ועיצוב מחדש אינם סדירים¹. הצטלקות היפרטרופית (HTS) היא דוגמה לריפוי פצעים לא סדיר, המאופיינת בתצהיר מוגזם של מטריצה חוץ-תאית ורקמת חיבור באתר הפציעה וכתוצאה מכך היווצרות אזור רקמת צלקת מוגדל ^1,2,3. אזורים בגוף העוברים גירויים חוזרים ונשנים של מתיחות מכניות, כגון סביב המפרקים או על הפנים, מועדים יותר לפתח HTS ופיברוזיס 4,5,6,7,8,9,10. אנו ואחרים הראינו כי מתיחה מכנית על פני מצע פצע מקדמת היווצרות HTS באמצעות הפעלה של מסלולי טרנסדוקציה מכנית - המרה של גירויים מכניים לתגובות תאיות ^9,11.

HTS לא רק כרוך בתהליכים ביולוגיים מורכבים אלא גם טומן בחובו אתגרים חברתיים, רפואיים וכלכליים משמעותיים עבור האנשים שנפגעו. אנשים מושפעים יכולים להיאבק בהערכה עצמית ודיכאון, במיוחד כאשר הצלקות נמצאות באזורים גלויים כמו הפנים והידיים 1,9,10,12. מאמרי סקירה מדעית מצביעים על כך שהשכיחות של HTS נעה בין 32% ל-72% בארצות הברית^10,13. חומרת החששות האסתטיים הללו, במיוחד במקרים של פציעות כוויות חמורות באזור הפנים, מודגשת על ידי המספר ההולך וגדל של מקרי השתלת פנים מלאים לשיפור המראה¹⁰. צלקות אלו עלולות גם לגרום לליקויים תפקודיים על ידי הגבלת תנועה ^6,14, ולעתים קרובות נדרשת התערבות כירורגית כדי לכרות צלקות ולהחזיר את הניידות¹⁰. עלות הטיפול ב-HTS יכולה להיות משמעותית, כולל הוצאות עבור ניתוחים, טיפולים, פיזיותרפיה או אפילו טיפול סיעודי ^1,10. בארצות הברית לבדה, העלות השנתית של טיפול ב-HTS עולה על 4 מיליארד דולר¹⁰.

בהתחשב בשכיחות של HTS והאמצעים הקיצוניים שננקטו כדי לטפל בסיבוכיו, טיפולים קונבנציונליים (למשל, כריתה כירורגית, זריקות קורטיקוסטרואידים וטיפול בלייזר) נותרו משתנים מאוד 1,2,15,16,17. בעוד שטיפולים אלה יכולים להציע הקלה במקרים מסוימים, הם יכולים להיות לא מספיקים בשל האופי המורכב של פתולוגיה של צלקות. גורמים כמו הבדלים גנטיים בין אנשים והבנה לא מלאה של המנגנונים המניעים HTS גורמים לאסטרטגיות טיפוליות להישאר לא מספקות מבחינה קלינית 18,19,20. נראה כי עתיד הטיפול ב-HTS טמון בגישות חדשניות חדשות המכוונות למניעים מכניסטיים תאיים של HTS, כגון טרנסדוקציה מכנית^11,21, אשר הוכחנו בהרחבה כמניעה ריפוי מוגזם של צלקות פיברוטיות ^{5,6,7,8,11,21,22,23,24,25}. באופן ספציפי, פיתחנו בעבר מודל עכברי שמגביר את העומס המכני של הפצע כדי לקדם HTS⁹ דמוי אדם. עם זאת, לאחר כמעט שני עשורים של שימוש, המודל קודם משמעותית לשיפור היעילות והשחזור. פרוטוקול זה יאפשר לחוקרים לנצל בצורה הטובה ביותר מודל עכבר HTS מעודכן ואופטימלי כדי לחקור את אוכלוסיות התאים והמניעים מאחורי צלקות מוגזמות. המטרה הכוללת של שיטה זו היא לספק לחוקרים פרוטוקול שנועד לייצר צלקות היפרטרופיות דמויות אדם בעכברים.

התקבל אישור מהוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים של אוניברסיטת אריזונה (IACUC) לכל הניסויים (מספר בקרה: 2021-0828). פרוטוקול זה משתמש בעכברים זכרים בני 15 שבועות C57BL/6J אם כי ניתן ליישם אותו על גילאים וזנים אחרים ^9,26.

1. יצירת מכשיר הטעינה הביומכני של HTS

הערה: שינוי מרחיבי החך למכשיר HTS יכול להתרחש בכל נקודה לפני הניסוי.

1. קח את מרחיב החיך הלא שונה והצג לליבת Makerspace או ליבת ייצור עם מפרט לפי איור 1A,B.
   הערה: אם אין ליבת Makerspace או Fabrication Core, המשך לשלבים הבאים.
2. השתמש בכלי כיפוף חוטים מיני אוניברסלי (MUB) כדי לשנות את מרחיב החך כך שיתאים למפרט של איור 1A,B.
3. הנח את המכשיר שטוח על משטח כפי שמוצג באיור 1A1.
4. כופפו את הזרועות ב-90° למעלה עבור הזרועות העליונות ו-90° כלפי מטה עבור הזרועות התחתונות כאשר המכשיר מונח שטוח עם ה-MUB כפי שניתן לראות באיור 1A2. ראה איור 1A3 למראה המכשיר כאשר הוא מונח שטוח על משטח, כאשר הזרועות כעת מקבילות לחלוטין לגוף המכשיר.
5. כופפו כל זרוע בחזרה לתוך הדף 90° לאורך ציר הקו המקווקו כפי שניתן לראות באיור 1A4. ראה איור 1A5 למכשיר לאחר כיפוף.

2. הסרת שיער וחתך ראשוני ביום שלאחר הניתוח 0 (POD 0)

הערה: נקה וחיטוי מספר סטים של מכשירים כירורגיים לפני הניתוח (למשל, מספריים לדיסקציה, אזמל, מלקחיים של אדסון, נהג מחט). הכן תפרים מעוקרים 5-0 לשימוש ויש טוש כירורגי בהישג יד.

1. נקה את חלל ההפעלה עם תרסיס אתנול 70%.
2. הנח כרית חימום בטמפרטורה של 35 מעלות צלזיוס על שולחן ההכנה לפני הניתוח. הדביקו כרית סופגת מעל כרית החימום. יש להניח פד סופג נוסף מעל הפד הקודם (לאיסוף שיער מגולח). הדביקו את חרוט ההרדמה (או הקונוסים) על כרית הספיגה.
   הערה: [אופציונלי] אם קיים מחלץ אדים על שולחן העבודה, הנח את החרוט ליד סביבת העבודה והפעל את היניקה.
3. הנח את העכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה עם 1-3% איזופלורן וזרימת חמצן של 2 ליטר לדקה עד שהעכברים נושמים בשלווה (2-3 דקות).
4. הכנס את האף של כל עכבר לפתח חרוט האף, מה שמאפשר שאיפת הרדמה המורכבת מ-1-3% איזופלורן עם 2 ליטר לדקה של חמצן. אשר הרדמה מספקת על ידי היעדר תגובה לצביטה בבוהן. מרחו משחת סיכה עיניים על עיני העכבר.
5. השתמשו בסכין גילוח חשמלי כדי לגלח את השיער על הגב באזור כפי שניתן לראות באיור 1C.
6. מרחו את משחת האפילציה בעזרת אצבע עטויה כפפה או צמר גפן על העור, וכיסו את האזור המגולח. לאחר 45 שניות יש לנגב את העיסה עם גזה ואז ספוגית אלכוהול. נגבו את הגב עם ספוגית אלכוהול נוספת כדי להסיר את משחת האפילציה, והשאירו אחריהם כתם חסר שיער (איור 1C).
   הערה: חשוב להשתמש בכמות מתונה של משחה, להסיר את הדבק מיד ולנגב את העכבר לאחר הסרת הדבק כדי למנוע כוויות עור על ידי משחת האפילציה. עור העכברים דק, מה שהופך אותו לרגיש לכוויות כימיות מהירות שעלולות להיות השפעות מזיקות הן על בריאות העכברים והן על איכות הניסוי.
7. תג אוזן לעכבר לזיהוי.
8. לאחר הסרת השיער, החזר את העכבר לכלוב כדי למנוע חשיפה מוגזמת לאיזופלורן. נטר את העכבר.
9. הסר את כרית הספיגה העליונה המכוסה בשיער כדי לקבל משטח עבודה נקי לפני הניתוח.
10. הגדר אזור עבודה כירורגי נפרד. הנח כרית חימום מכוונת ל-35 מעלות צלזיוס על שולחן הניתוחים. הדביקו כרית סופגת מעל כרית החימום. הדביקו את חרוט ההרדמה (או הקונוסים) על כרית הספיגה.
11. הנח עכבר בתא האינדוקציה של ההרדמה עם 2-4% איזופלורן וזרימת חמצן של 2 ליטר לדקה עד שהעכבר נושם בשלווה (2-3 דקות).
12. הוצא את העכבר מתא האינדוקציה והנח אותו על משטח ההפעלה. הכנס את האף של כל עכבר לפתח חרוט האף, מה שמאפשר שאיפת הרדמה המורכבת מ-1-3% איזופלורן עם 2 ליטר לדקה של חמצן. אשר הרדמה מספקת על ידי היעדר תגובה לצביטה בבוהן. מרחו משחת סיכה עיניים על עיני העכבר.
13. יש להזריק 0.05 מ"ג/ק"ג בופרנורפין בשחרור מושהה לכתף באופן תת עורי באמצעות מחט 21 גרם לטיפול בכאב לאחר ניתוח.
14. חיטוי הגב של העכבר עם שלושה סבבים לסירוגין של פילינג על בסיס יוד/כלורהקסידין וספוגית אלכוהול. בעזרת עט הסימון הכירורגי וסרגל, סמנו קו של 2 ס"מ על קו האמצע הגבי שבו יבוצע החתך בעובי מלא, כפי שמוצג באיור 1D.
15. השתמש באזמל או במספריים לדיסקציה (העדפה כירורגית) כדי לבצע את חתך קו האמצע הגבי בעובי מלא דרך האזור המסומן.
    הערה: היזהרו לא לחתוך את הרקמה הבסיסית (למשל, שריר), כפי שניתן לראות באיור 1D.
16. בעזרת תפרים 5-0 בתבנית קטועה פשוטה, סגור את החתך על ידי חיתוך הפצע כפי שמוצג באיור 1D. השתמש לפחות ב-5 תפרים במרווחים שווים.
17. חותכים גזה טלפה לחתיכה בגודל 3 ס"מ על 1 ס"מ. הנח אותו במרכז תחבושת דבק קצף והנח את התחבושת הדביקה על גב העכבר כך שהגזה תכסה את החתך כפי שמוצג באיור 1D. מניחים תחבושת חצויה על הבטן ועוטפים בצורה היקפית עד שהיא פוגשת את התחבושת הגבית.
18. לאחר השלמת החבישה, הניחו את העכבר בכלוב סטרילי נפרד ועקבו אחריו עד להתאוששות מלאה מההרדמה.
19. חזור על ההליך עם כל העכברים, ללא קשר לקבוצת הניסוי. תן לחתך להחלים במהלך 4 הימים הבאים לפני השלב הבא.

3. מיקום מכשיר העמסה ביומכני HTS (POD 4)

הערה: נקה וחיטוי את מכשירי HTS ומספר סטים של מכשירים כירורגיים לפני הניתוח (למשל, מספריים לדיסקציה, אזמל, מלקחיים של אדסון, נהג מחט, מהדק עור, סיכות עור). הכן תפרים מעוקרים 5-0 לשימוש. [אופציונלי] אם קיים שואב אדים על שולחן העבודה, הנח את החרוט ליד סביבת העבודה והפעל את היניקה.

1. הכן את אזור הניתוח כמתואר בשלבים 2.1 ו-2.2.
2. להרדים את העכבר ולספק משככי כאבים על ידי ביצוע שלבים 2.11-2.13.
3. השתמש במלקחיים או במחט כדי להפריד את התחבושת מבטן העכבר על ידי הפעלת הכלי מצד לצד כנגד הצד הגחוני. משאירים את הכלי בין העטיפה לעור כדי להרים את התחבושת מהעור, השתמשו במספריים כדי לחתוך את התחבושת.
   הערה: היזהר לא לחתוך את עור העכבר, לקרוע את התחבושת או להפריע לחתך הריפוי.
4. נקו את הגב בעזרת ספוגית אלכוהול. בדוק את החתך לאיתור התפרקות פצע או סימני זיהום.
5. ודא שהתקן HTS אינו מורחב/מורחב ונמצא בצורתו המופחתת ביותר, כפי שמוצג באיור 1B. מצפים קלות את זרועות המכשיר בדבק רפואי.
6. ביד אחת, הפוך את העור על גב העכבר למתוח מעט בכיוון הרוחבי. ביד השנייה, הנח את מכשיר ה-HTS על גב העכבר כך שהחתך יהיה במרחק שווה מכל זרוע של מכשיר ה-HTS, ובכך מרכז את המכשיר מעל החתך. ודא שהעור בין הזרועות של מכשיר HTS מתוח באופן אחיד. החזק את המכשיר במקומו עד שהדבק יתייבש (~30 שניות), כפי שניתן לראות באיור 2A.
   הערה: חשוב לשמור על העור מתוח באופן אחיד כדי להבטיח כמויות שוות של מתח מונחות על החתך עם המכשיר. השאירו את התפרים שלמים במהלך תהליך זה מכיוון שתהליך הנחת המכשיר מוסיף מתח מכני לעור, שיכול לפתוח מחדש את חתך הריפוי. התפרים נשארים במקומם עד ליום הראשון של המתיחה כדי להבטיח שהפצע יישאר סגור.
7. אבטח ארבעה תפרים סביב כל זרוע ודרך העור כפי שמוצג באיור 2B. בזמן התפירה, ודא שהמחט יוצאת מהעור לכיוון החתך.
   הערה: החדרת המחט מצד החתך של המכשיר עלולה לפעמים לקרוע את החתך בשל הכוח הדרוש לניקוב העור.
8. כעת הניחו שלושה סיכות עור סביב הזרועות ודרך העור, והצמידו את מכשיר ה-HTS לעור כפי שמוצג באיור 2B.
9. חבוש את העכבר על ידי ביצוע השלבים 2.17 ו-2.18.
10. חזור על ההליך עם כל העכברים, ללא קשר לקבוצת הניסוי.
    הערה: כל העכברים מקבלים את אותה הכנה; עם זאת, הם מוקצים באופן אקראי בכל קבוצת ניסוי (למשל, ביקורת, מתיחה) כדי להבטיח התפלגות בלתי משוחדת של עכברים בתכנון הניסוי. באופן ספציפי, גם לעכברי בקרה וגם לעכברי מתיחה יהיה המכשיר מחובר לגב שלהם. המכשירים של עכברי ההדברה יישארו ללא מגע, בעוד שהעכברים המתוחים, יעברו את השלבים הבאים.

4. מתיחה ראשונית של מכשיר טעינה ביומכני HTS (POD 5)

הערה: נקה ובצע חיטוי של מספר סטים של מכשירים כירורגיים (למשל, מספריים לדיסקציה, אזמל, מלקחיים של אדסון, נהג מחט) לפני הניתוח. [אופציונלי] אם קיים שואב אדים על שולחן העבודה, הנח את החרוט ליד סביבת העבודה והפעל את היניקה.

1. הקצה באופן אקראי כל עכבר באמצעות תג אוזן לקבוצה הרצויה. עבור עכברי בקרה, פשוט הסר את התפרים על החתך והחלף את חבישות הפצעים (שלבים 1-6, ולאחר מכן 8-9). אם תרצה, הסר את המכשיר בזמן המתיחה וצלם עם מכשיר מדידה לקנה מידה כדי לעקוב אחר גודל הצלקת.
2. הכן את אזור הניתוח, הרדים את העכבר והסר את התחבושת על ידי ביצוע שלבים 3.1-3.4.
   הערה: היזהר לא לקרוע את התחבושת או להפריע לחתך הריפוי. אם זרוע של מכשיר HTS התנתקה מהעור, הדביקו קלות בחזרה למקומה והוסיפו סיכות עור או תפר בהתאם לגודל הניתוק.
3. הסר את התפרים מהפצע בעזרת מספריים לדיסקציה או שיטה אחרת לבחירה.
4. הכניסו את מפתח מכשיר ה-HTS למכשיר וסובבו כדי להרחיב את המכשיר עד שהעור מתוח אך לא נמצא בסיכון לקרוע את העור, כפי שניתן לראות באיור 2C.
   הערה: הסחת דעת ראשונית זו עשויה להימשך כ-4-8 סיבובים מלאים של המפתח מכיוון שהעור עשוי להיות רופף בין זרועות המכשיר.
5. חבוש את העכבר על ידי ביצוע שלבים 2.17 ו- 2.18.

5. מתיחה עוקבת של מכשיר הטעינה הביומכני של HTS (POD 7, 9, 11, 13, 15, 17)

הערה: נקה ובצע חיטוי של מספר סטים של מכשירים כירורגיים (למשל, מספריים לדיסקציה, אזמל, מלקחיים של אדסון, נהג מחט) לפני הניתוח. [אופציונלי] אם קיים מחלץ אדים על השולחן, הנח את החרוט ליד סביבת העבודה והפעל את היניקה.

1. עבור עכברי ביקורת, פשוט החלף את חבישות הפצעים (שלבים 1-5, ולאחר מכן שלבים 13-14). אם תרצה, הסר את המכשיר בזמן המתיחה וצלם את הצלקת בעזרת כלי מדידה לקנה מידה כדי לעקוב אחר גודל הצלקת.
2. הכן את אזור הניתוח, הרדים את העכבר והסר את התחבושת על ידי ביצוע שלבים 3.1-3.4.
   הערה: אם זרוע של מכשיר HTS התנתקה מהעור, הדביקו אותה למקומה והוסיפו סיכות עור או תפר בהתאם לגודל הניתוק.
3. הכנס את מפתח התקן HTS למכשיר וסובב כדי להרחיב את המכשיר עד שהעור מתוח אך לא בסיכון לקריעת העור.
   הערה: זה עשוי לקחת כ-4 סיבובים או ~2 מ"מ של הסחת דעת כוללת. אם המכשיר הגיע להארכה מקסימלית ולא ניתן להאריך אותו עוד יותר, בצע את שלבים 5.4-5.7 כדי להמריא ולחבר מחדש מכשיר חדש. אחרת, חבוש את העכבר על ידי ביצוע שלבים 2.17 ו-2.18.
4. אם המכשיר הגיע להארכה מקסימלית, הסר את המכשיר מהגב של העכבר על ידי הסרת הסיכות בעזרת מסיר סיכות או מספריים על ידי פתיחת שיני הסיכות. לאחר מכן, הסר את התפרים והסר בזהירות את המכשיר.
5. נקה את המכשיר בעזרת אזמל, ספוגיות אלכוהול ומגבות נייר. משרים את המכשיר ב-70% אתנול למשך ~20 דקות כדי לסייע בניקוי. לאחר מכן, השתמש במפתח כדי לכווץ את המכשיר לצורתו הדקה ביותר.
6. חבר מחדש את התקן HTS לפי שלבים 3.5-3.8.
7. חבוש את העכבר על ידי ביצוע השלבים 2.17 ו-2.18.

6. קצירת רקמת HTS (POD 19)

הערה: קצירת רקמות יכולה להתרחש בכל שלב בתהליך. אספנו רקמות לאחר 4 ימים בלבד של מתיחה כדי לבחון נקודות זמן מוקדמות; עם זאת, הרקמה נקצרת באופן העקבי ביותר ב-POD 19 (שבועיים לאחר תחילת הזן). נקה ובצע חיטוי של מספר סטים של מכשירים כירורגיים (למשל, מספריים לדיסקציה, אזמל, מלקחיים של אדסון) לפני הניתוח. כדי לקבל תמונות של הצלקת לאורך זמן, ניתן להסיר את המכשיר לפני כל שלב מתיחה כדי לצלם את הצלקת לפני הנחת המכשיר מחדש והתחלת מאמץ מכני מחדש. [אופציונלי] אם קיים שואב אדים על שולחן העבודה, הנח את החרוט ליד סביבת העבודה והפעל את היניקה. מחלץ האדים על השולחן עשוי להיות כבוי כאשר גז האיזופלורן אינו בשימוש עוד.

1. הכן את אזור הניתוח, הרדים את העכבר והסר את התחבושת על ידי ביצוע שלבים 3.1-3.4.
2. להקריב את העכבר באמצעות פריקת צוואר הרחם.
   הערה: הקפד לא למשוך את העור ולקרוע את הגב של העכבר.
3. השתמש במספריים לניתוח או במסיר סיכות עור כדי להסיר את סיכות העור. חותכים את התפרים. הסר בעדינות את מכשיר ה- HTS, הקפד לא לקרוע את העור.
4. בעזרת אזמל או מספריים, חתכו את העור המקיף את צלקת HTS. שמור על העור לניתוח היסטולוגי בצורה הרצויה.
   הערה: אם יש להשתמש בעור לניתוח טרנסקריפטומי או חלבון (למשל, qPCR, כתם מערבי, ניתוח תא בודד), הקפד לכרות רק את רקמת הצלקת של HTS כדי למזער את כמות הרקמה הבריאה שמסביב. זה יבטיח שהניתוח יתפוס רק את רקמת הצלקת.
5. מגרדים את מכשירי HTS בעזרת אזמל. הניחו מכשירים בכוס עם 70% אתנול כדי לרכך את כל הדבק או הרקמה שנותרו.
   הערה: לאחר השריית 70% אתנול, המכשירים עשויים לדרוש ניגוב, גירוד וניקוי נוספים לפני החיטוי.

7. מדידת רוחב צלקת ממוצע

הערה: זה הושג באמצעות תוכנת ניתוח התמונות ImageJ, והמידע נרשם בגיליון אלקטרוני.

1. פתח תמונות ב-ImageJ. עקבו אחר שולי הצלקת בעזרת הכלי מצולע . לחץ על נתח | מדוד כדי למדוד אזור זה.
   הערה: ניתן לזהות את הצלקת על ידי שינוי צבעה והיעדר זקיקי שיער.
2. מדוד את אורך הצלקת מקצה לקצה באמצעות כלי הקטע . לחץ על נתח | מדוד כדי למדוד אורך זה.
3. מדוד אורך של 1 ס"מ או כל יחידת אורך סטנדרטית אחרת בתמונה, באמצעות כלי הסגמנט . לחץ על נתח | מדוד כדי למדוד אורך זה.
4. בעזרת הגיליון האלקטרוני, קחו את אזור הצלקת (בפיקסלים; פיקסלים) וחלקו אותו באורך הצלקת (אורך פיקסלים). תוצאה זו נותנת את רוחב הצלקת הממוצע בפיקסלים.
5. חלקו את התוצאה ביחידת האורך הסטנדרטית הנמדדת (אורך פיקסלים). התוצאה תהיה רוחב הצלקת הממוצע ביחידת יחידת האורך הסטנדרטית (למשל, ס"מ) המשמשת לניסוי.

כדי להדגים בבירור את השימוש היעיל בפרוטוקול HTS ולזהות תוצאות "חיוביות" מוצלחות, המודל הוקם כפי שמוצג באיור 3A. במחקר המייצג, היו שתי קבוצות: ללא בקרת מתיחה (n = 6) וקבוצת HTS מתיחה מכנית (n = 6) שבהן רמות דמויות אדם של מתח מכני הושרו על פני החתך כדי ליצור HTS, כפי שניתן לראות באיור 3B,C. במסגרת תוכנית הניסוי הניתנת באיור 3A-C, צולם צילום גס של הצלקת ב-PODs 5, 9, 15 ו-19. הצלקות אותרו באמצעות ImageJ ונותחו עבור הרוחב הממוצע של הצלקות בנקודות הזמן השונות (איור 3D). רוחב הצלקות הממוצע הוצב בגרף כנגד הזמן ובין הקבוצות באיור 3E. בעקבות הפעלת מאמץ מכני ב-POD 5, כאשר הצלקות לא היו שונות באופן משמעותי בין ה-Stretch ל-Control, קבוצת המתיחה הציגה צלקות רחבות משמעותית מה-Control, והגיעה לרוחב שיא של 0.99 מ"מ ב-POD 9 (p = 0.045). רוחב צלקת גדול משמעותית בהשוואה לבקרה המשיך ב-POD 15 (p = 0.043) ו-19 (p = 0.045). מומלץ לצלם צילום ברוטו רק בימים שבהם יש צורך להסיר את מכשיר ה-HTS (כלומר, מכשיר ה-HTS הגיע להרחבה מקסימלית ויש לחבר אותו מחדש או במהלך הוצאה) מכיוון שהמכשיר חוסם צילום תקין של הצלקת. בפרוטוקול זה, ניתוחי תמונות ורוחב צלקות על פני מספר נקודות זמן נותנים תצוגה ברורה יותר של התקדמות הפצע של המודל עבור הקורא.

ניתוח רקמת HTS יכול להיעשות במספר דרכים, כגון צביעת IHC לסמנים פיברוטיים, צביעת H&E וטריכרום לבחינת אזורי הצלקת ההיסטולוגית, צביעה אדומה של פיקרוזיריוס כדי להעריך את ארכיטקטורת הקולגן של הצלקות, ושיטות אחרות לניתוח פצעים - כולן שימשו את^{המעבדה לאורך} ההיסטוריה^. 8,21,24,25,27,28(איור 4). איור 4 מראה מאפיינים היסטולוגיים של רקמת HTS, כגון רקמת צלקת מוגבהת (איור 4A), אובדן מבנים אדנקסליים וזקיקי שיער (איור 4B), יישור של סיבי קולגן בכיוון העומס המכני (איור 4C), ושרוולי קולגן (איור 4F). איור 4 מדגים גם צביעה אימונוהיסטוכימית של צפיפות תאי פיטום וכלי דם של HTS עכברי ומשווה אותו לרקמת HTS אנושית (איור 4D,E,G,H). יתר על כן, ניתוח צלקת HTS יכול להיעשות באמצעות ניתוח תא בודד אם הרקמה נקצרת, מוכנה ונלקחת לליבה ביואינפורמטית מיד לאחר הכריתה.

איור 1: הכנת מכשיר ה-HTS והגב של העכבר. (A) תהליך שינוי של מרחיב חיך 13 מ"מ ליצירת מכשיר HTS, (1) הצגת מבנה המרחיב הראשוני, (2) כיפוף הזרועות 90° למעלה עבור הזרועות העליונות ולמטה עבור הזרועות התחתונות כאשר המכשיר מונח שטוח, (3) תוצאה של כיפוף ראשוני, כאשר הזרועות כעת מקבילות לחלוטין לגוף המכשיר, (4) כיפוף זרועות ליצירת מכשיר סופי עם מדידות; כל אחת מהזרועות צריכה להיות כפופה ב-90 מעלות לתוך הדף כפי שניתן לראות ב-(5) המכשיר הסופי. (ב) מכשיר ה-HTS המורכב במלואו מזוויות שונות, הן לא מורחבות והן מורחבות. (ג) שלבים עוקבים להכנת הגב של העכבר: (1) מצב התחלתי עם פרווה, (2) לאחר הגילוח, ו-(3) לאחר מריחת משחת האפילציה. (ד) נוהל יצירת החתך הגבי: (1) סימון מקום החתך בקו מנחה של 2 ס"מ, (2) ביצוע החתך, (3) תפירת הפצע, (4) מריחת גזה טלפה, ו-(5) קיבוע באמצעות חבישה דביקה. (ה) צילום גס של (1) החתך, ו-(2) לאחר סגירת החתך. קיצור: HTS = צלקות היפרטרופיות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 2: מיקום ומתיחה של התקן HTS. (א) המחשה של המיקום הנכון של מכשיר ה-HTS על גב העכבר, תוך הבטחת יישור נכון עם מקום החתך. התמונה השמאלית מציגה את מיקום המכשיר כפי שהוא נראה ממצב אחורי. התמונה הימנית מציגה את מיקום ההתקן במבט רוחבי. (ב) איור של החיבור של מכשיר HTS: (1) מיקום ראשוני, (2) מיקום התפרים, (3) מיקום סיכות העור. (ג) הדגמה של מתיחת מכשיר ה-HTS עם מפתח התקן HTS המסומן: (1) תצורת התחלה, (2) הפעלת מתח, (3) המצב המורחב הסופי שנועד להפעיל מתח מכני עקבי על פני חתך הריפוי כדי לקדם היווצרות צלקת היפרטרופית, 2 מ"מ של התרחבות מופעלת. (D) צילום גס של הפעלת מתח על התקן HTS, עם תווית HTS Device Key. (ה) צילום גס של העכבר החבוש במלואו. קיצור: HTS = צלקות היפרטרופיות. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 3: יישום מאמץ מכני לפיתוח צלקות. (A) ציר הזמן של הליך הניסוי מיצירת החתך (POD 0) ועד להפעלת מתח מכני (POD 4) ולאורך תקופת המתיחה (POD 5 עד POD 19), ששיאו בהוצאת רקמות (POD 19). (ב) איור של שתי הקבוצות: קבוצות HTS ללא בקרת מתיחה ומתיחה מכנית. (C) סכמת חתך המתארת את ההבדל בתגובת הרקמה בין קבוצות No Stretch Control ו-Stretch HTS. (D) תמונות גסות מייצגות של צלקות של קבוצות ללא בקרת מתיחה ו-Stretch HTS בימים שלאחר הניתוח (POD 5, 9, 15 ו-19), כאשר הצלקות ההיפרטרופיות מסומנות בקו מקווקו צהוב. (ה) ניתוח כמותי של רוחב הצלקת הממוצע לאורך זמן, המדגים הבדלים משמעותיים בהתפתחות הצלקת בין קבוצות No Stretch ו-Stretch, עם פסי שגיאה המייצגים סטיית תקן. הבדלים משמעותיים מסומנים בכוכביות (*). ניתוח סטטיסטי בוצע באמצעות ניתוח שונות דו-כיווני (ANOVA). ערכים של *p <-0.05 נחשבו מובהקים סטטיסטית. קיצורים: HTS = צלקות היפרטרופיות; POD = יום לאחר הניתוח. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

איור 4: היסטולוגיה של הצלקת. היסטולוגיה זו של צלקות עכברים נקצרה לאחר שבועיים של לחץ מכני בעבודה שפורסמה בעבר^9,26. (A) התמונה הגדולה יותר מציגה הדמיה היסטולוגית של H&E של חתך הצלקת, בעוד שהתמונה הימנית התחתונה מציגה הדמיה היסטולוגית טריכרום של חתך הצלקת, שמראה כיצד אזור הצלקת מורם. (B) התמונה הגדולה יותר מציגה הדמיה היסטולוגית של H&E של חתך הצלקת, בעוד שהתמונה הימנית התחתונה מציגה הדמיה היסטולוגית טריכרום של חתך הצלקת, שמראה כיצד אזור הצלקת מדגים אובדן של מבנים אדנקסליים וזקיקי שיער. (C) התמונה הגדולה יותר מציגה הדמיה אדומה של חתך הצלקת, בעוד שהתמונה הימנית התחתונה מציגה הדמיה היסטולוגית טריכרומית של חתך הצלקת, שמראה סיבי קולגן מיושרים בכיוון העומס המכני. (D) התמונה הגדולה יותר מציגה הדמיה של אימונוהיסטוכימיה CD117 ברקמת HTS של עכבר, בעוד שהימנית התחתונה מציגה הדמיה של אימונוהיסטוכימיה CD117 ברקמה אנושית, המדגימה צפיפות תאי פיטום דומה לרקמת HTS אנושית. (E) התמונה הגדולה יותר מציגה הדמיה של אימונוהיסטוכימיה CD31 של כלי דם ברקמת HTS של עכבר, בעוד שהימנית התחתונה מציגה הדמיה של אימונוהיסטוכימיה CD117 ברקמה אנושית, המדגימה צפיפות תאי פיטום דומה לרקמת HTS אנושית. (F) שרוולי קולגן, שנראים בצלקות היפרטרופיות אנושיות בוגרות בתמונה מימין למטה, נראים גם בצלקות עכברים טעונות לאחר 24 שבועות באזור המוקף עיגול בהדמיית H&E של עכברים. (G) תמונות גסות מייצגות של צלקות של קבוצת ביקורת (חתך + ללא מתיחה), קבוצת ביקורת מתיחה (ללא חתך + מתיחה) וקבוצת HTS מתיחה. (H) מראה אימונוהיסטוכימיה המשווה בין קבוצת הביקורת (חתך + ללא מתיחה) לבין קבוצת Stretch HTS. באמצעות צביעה משותפת לסמנים פיברוטיים pEPF, aSMA ו-YAP עם DAPI, יש עלייה בסמנים הפיברוטיים בקבוצת HTS. A-F אומצו מ-Aarabi, S. et ^al.9. G,H אומצו מ-Mascharak, S. et al. הודפס מחדש באישור FASEB²⁶. קיצורים: HTS = צלקות היפרטרופיות; H&E = המטוקסילין ואאוזין; pEPF = פיברובלסטים חיוביים למעוגל; aSMA = אקטין שריר חלק אלפא; YAP = חלבון הקשור ל-Yes; DAPI = 4',6-דיאמידינו-2-פנילינדול. אנא לחץ כאן לצפייה בגרסה גדולה יותר של איור זה.

מודל העכבר HTS הוא שיטה חסכונית וניתנת לשחזור מאוד להשראת HTS באמצעות טרנסדוקציה מכנית ופיתוח טיפולים פוטנציאליים. בעוד שקיימת עקומת למידה ראשונית לשימוש יעיל במודל, הפרוטוקול יכול, עם תרגול, להתבצע על ידי כל חוקר ללא הכשרה כירורגית. השימוש במודל זה מאפשר לחוקרים להבין טוב יותר את היווצרות HTS ואת תפקיד הטרנסדוקציה המכנית בריפוי פצעים, מה שעשוי להוביל לשיפורים מוחשיים בטיפול בפצעים במטופלים. הדגמת הווידאו המלווה פרוטוקול זה תפחית באופן אידיאלי את עקומת הלמידה עבור החוקרים ותקל על יישום חלק של מודל זה במחקרים עתידיים. עם זאת, ישנם מספר שלבים קריטיים בפרוטוקול שיכולים להפיק תועלת מהסבר נוסף כדי לשפר את הבהירות עבור המשתמשים.

בהתקדמות כרונולוגית מתחילת הפרוטוקול, הצעד המרכזי הראשון הוא סגירת החתך הניתוחי ביום הניתוח 0 (POD 0). הכרחי שהחתך ייסגר לחלוטין עם שכבות העור במיקום מושלם²⁹. זאת על מנת להבטיח שהחתך יחלים כראוי ולא ייפתח לאחר הנחת המכשיר ויצירת מתח על פני הפצע. אם הפצע נפתח (פירוק), אין להשתמש בבעל החיים לניסויים נוספים.

כאשר מניחים את מכשיר ה-HTS על POD 4, חיוני להבטיח כמויות שוות של מתח על פני הגב של העכבר. עם מיקום נכון של המכשיר, המתח המופעל יהיה אחיד לאורך כל החתך, מה שמפחית את הסיכון להפעלת כוח משתנה שעלול לגרום לתוצאות ניסוי לא אופטימליות (צלקות לא אחידות). אם המכשיר מחובר בצורה לא נכונה, חלקים מהחתך לא יקבלו באותה מידה את הסחת הדעת הממוצעת של 2 מ"מ כל יומיים כדי לגרום ל-HTS. הרחבת המכשיר אמורה לחסל רפיון בעור ולהפוך אותו למתוח. במקביל, יש להקפיד על מניעת הארכת יתר של המכשיר, שעלולה לגרום לפצע להתפרק. אם המכשירים משמשים למספר סבבי ניסויים, ההילוך המסתובב בו ממוקם המפתח כדי להרחיב ולכווץ את המכשיר יכול להשתחרר. אם זה קורה, יש לייצר מכשיר חדש ולזרוק את המכשיר הישן.

כאשר מתח מתחיל ב-POD 5, יש להתחיל לתת כל טיפול המיועד למניעת צלקות. טיפולים כגון משחות מקומיות ניתנים בדרך כלל אחת ליומיים כאשר המתח מתחיל על ידי פיזור על מקום החתך. הידרוג'לים ממוקמים באופן דומה מעל אתר החתך. ניתן להזריק טיפולים סיסטמיים לזרם הדם דרך וריד הזנב או רטרו-אורביטלית.

רצוי להתגלח ו/או למרוח קלות משחת הסרת שיער על גב העכבר סביב הצלקת ב-POD 19 או לפני צילום הצלקת. זה משפר את הנראות ואת הניתוח הבא של גודל הצלקת עם ImageJ. בנוסף, בעת שימוש במשחת אפילציה יש לטעות בצד של פחות משחה ופרקי זמן קצרים יותר. חשיפת יתר של גב העכבר למשחה עלולה לגרום לכוויות כימיות שעלולות להפריע לתהליך ריפוי הפצעים. עור העכבר דק יותר מעור האדם ונוטה יותר לכוויות כימיות³⁰.

מודל העכבר HTS מוגבל מטבעו מכיוון שהוא אינו משתמש בעור אנושי ולכן אינו יכול לסכם במלואו HTS אנושי. עם זאת, יש לו מספר משמעותי של יתרונות לוגיסטיים על פני מודלים אחרים של בעלי חיים; מבוצע כראוי, דגם HTS זה של עכבר אמין, זול ומבוצע בקלות. מבחינה ביולוגית, ה-HTS מושרה באמצעות עלייה פיזית באיתות מכני. מודלים אחרים של HTS בארנבים גורמים ל-HTS באוזן או בגב באמצעות פגיעה תרמית וכימית 30,31,32. העור בצד הגחון של אוזן הארנב אינו מערב תאים רבים מלבד תאי עור במהלך הריפוי, כגון כונדרוציטים ^1,30. שיטה נוספת היא מודל HTS לשריפה על עור חזיר³³, אך היא יכולה להיות מאתגרת מבחינה לוגיסטית מבחינת עלות וטיפול. המודל החזירי הוא ככל הנראה הדומה ביותר בסיכום HTS אנושי; עם זאת, זוהי שיטה יקרה לאיסוף תוצאות ראשוניות. מודל HTS סופי הוא השתלת עור HTS אנושי על עכברים, אך זה יכול לעורר תגובה חיסונית ואינו חוקר היווצרות צלקות חדשות³⁴.

השיטות הנ"ל להשראת HTS במודלים של בעלי חיים אינן מעוררות כראוי את תגובת הריפוי הטבעית של הגוף באותו אופן שבו נוצרות צלקות HTS אנושיות. לעומת זאת, מודל ה-HTS של העכבר המבוסס על מכניקה משתמש במאמץ מכני כדי ליזום הצטלקות היפרטרופית, המשקפת באופן הדוק את ה-HTS האנושי ^1,9,21. שיטה זו מסתמכת על התהליך הפיזיולוגי של איתות מכני טרנסדוקציה כדי ללכוד את הביומכניקה הבסיסית של הרקמות ואת מניעי אוכלוסיית התאים מאחורי פיברוזיס. מודל זה אופטימלי לחקר מטרות ביולוגיות לעיכוב או אפילו לגרום למסלולי טרנסדוקציה מכנית, מה שעשוי להוביל לגילוי טיפולים תרגומיים חדשים.

למחברים אין אינטרסים מתחרים או ניגודים אחרים הקשורים לתוכן מאמר זה.

עבודה זו נתמכה על ידי פרסי הפרויקט התרגומי הבין-תחומי של המרכז לשיקום רקמות שיניים, פה וגולגולת פנים והתחדשות איברים בתמיכת המכון הלאומי לחקר שיניים וגולגולת פנים (U24 DE026914) (GCG) ומענק המחקר התרגומי של הקרן לכירורגיה פלסטית (837107) (K.C.).