Method Article
בזאת אנו מתארים שיטות פשוטות להכנה של שלפוחית, אנקפסולציה של שעתוק ותרגום מכונה, והניטור של ייצור חלבון. מערכות תא ללא כתוצאה מכך יכולות לשמש כנקודת התחלה שממנו ניתן לבנות מחקה סלולרי מורכב יותר ויותר.
כמשמרות ריבית ממולקולות בודדות למערכות של מולקולות, מספר גדל והולך של מעבדות ביקשו לבנות מלמטה למעלה מחקה סלולרי שמייצגים טובים יותר את המורכבות של חיים תאיים. נכון להיום יש מספר המסלולים שניתן לנקוט כדי לבנות מחקה סלולרי ממודר, כולל ניצול של תחליבים מים בשמן, התקני microfluidic, ושלפוחית. כל אחת מהאפשרויות הזמינות יש יתרונות וחסרונות מסוימים. לדוגמה, תחליבים מים בשמן לתת יעילות גבוהה אנקפסולציה אבל לא לחקות היטב את מחסום החדירות של תאי חיים. היתרון העיקרי של השיטות שתוארו במסמך זה הוא שהם כולם קלים וזולים ליישום. מכונות תמלול-תרגום היא כמוסות פנימית של שלפוחית פוספוליפידים באמצעות תהליך המנצל את המכשור משותף, כגון מאייד הצנטריפוגלי ומכבש. תגובות מנוטרות על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה. הפרוטוקולים יכול להיות מותאם לביטוי חלבון רקומביננטי, הבנייה מחקה סלולרי, החקירה של דרישות המינימום לחיים הסלולר, או ההרכבה של מעגלים גנטיים.
ללא תא, במבחנה תגובות שעתוק-תרגום והדור של שלפוחית משומנים סינטטיים אינם דבר חדש. עם זאת, שילוב של שתיים לתוך הסלולר לחקות הוא באופן משמעותי יותר challenging1-6. א תמציות סלולריים coli עם או בלי RNA פולימראז T7 יכולות לשמש כמקור של מכונות שעתוק-תרגום 7,8. תמציות סלולריים נהנות מהנוכחות של רכיבים סלולריים נוספים שיכול להקל ביטוי חלבון ומתקפל. לחלופין, שילוב של RNA בנפרד מטוהר ומולקולות חלבון, כלומר את מערכת PURE 9, יכול לשמש כדי לתווך סינתזת חלבון intravesicular 4,10-14. מערכת PURE מאפשרת לבניית מחקה סלולרי שהוגדר באופן מלא ואינו סובלת מפעילות nuclease מצאה בתמציות סלולריים. מבחינה מעשית, זה אומר שנדרש הרבה פחות תבנית ה-DNA, ובכך להקל על תהליכים עם יעילות נמוכה אנקפסולציה 11 . למרות ששימוש בתדירות נמוך יותר, ניתן לבנות מחקה סלולרי עם תמציות תאים שמקורם מcells15 אוקריוטים. עד כה, דווחו מפלים כמוס מקודדים גנטי ומחק סלולריים שלחוש את סביבת 16-18.
הדרך הפשוטה כדי לעקוב אחר תגובות שעתוק-תרגום היא למדוד את הקרינה או הארה של אלמנטים גנטי מקודדים. בדרך כלל, גחלילית לוציפראז 19 או GFP משמשים, אם כי במבחנה תגובות נמדדות לעתים קרובות על ידי radiolabeling. גילוי הקרינה בנוסף הוא מאפשר ניטור של אוכלוסיות של שלפוחית 20,21 באמצעות שיטות מבוססות cytometry, ובכך מציע כמה תובנות לגבי האופי האקראי של תהליכים דמויי ביולוגיים. שיטות ניטור אלה כבר משמשים להגדרת קבוצה קטנה של כללי עיצוב וספרייה של חלקים ממנו ניתן לבנות, כולל אוסף של חלבוני ניאון התואמים אותיn מבחנת שעתוק-תרגום 22, בהשפעת הארגון על ביטוי גנטי 22, הפעילות של גורמי סיגמא 16, ואת היעילות של Terminators תעתיק 23. עם זאת, יש עדיין הרבה דברים שצריך לעשות כדי להגדיל את היכולת של הבנייה צפויה במבחנה, מכשירים מקודדים גנטי.
ישנן שיטות רבות זמינות כדי להפוך שלפוחית. השיטות הנפוצות ביותר תלויות בדור של שומנים בדם סרט דק על משטח זכוכית ואחריו resuspension בsolution24 המימית. אם התמיסה המימית מכילה מכונות שעתוק-תרגום, למשל, אז חלק של שלפוחית שנוצר היה להכיל את כל מרכיבים הדרושים לייצור חלבון. עם זאת, את היעילות של אנקפסולציה שיטות כאלה היא נמוכה, כלומר, רק אחוז קטן של שלפוחית הם פעיל. רבים מהשיטות החלופיות מאופיינים EFF אנקפסולציה הרבה יותר גבוהiciency לנצל את ההמרה של טיפות מים בתחליב שמן לשלפוחית. אמנם סביר להניח כי שיטות כאלה תהיה דבר שבשגרה בעתיד, כיום שיטות אלה סובלים מהצורך של ציוד מיוחד ולתת לי שלפוחית עם קרום קומפוזיציות שהשתנו 25. יתרון בולט מים בתוך שמן של שיטות לשלפוחית הוא הפוטנציאל לשלוט lamellarity הממברנה. השיטה המתוארת במסמך זה מבוססת על פרוטוקול סרט שומנים בדם הדק שתואר על ידי Yomo 11 המעבדה עם שינויים קלים ביניהם צעד homogenization נוסף. שיטה זו היא קלה, זולה, ונותנת שלפוחית חזקה גם מתאימה לאנקפסולציה של מכונות שעתוק-תרגום.
1. הכנת תבנית ה-DNA
2. הכנת סרט יפידים הדק
3. Resuspension שומנים בדם והשלפוחיות Homogenization
4. חול שלפוחית וlyophilization
5. Encapsulating מכונות תמלול-תרגום
6. מיקרוסקופיה
מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה הקרינה שנצפתה רק החלק פנימי של שלפוחית, כי החומר הוא extravesicular enzymatically מושפל (איור 3). לביטוי של mVenus, intravesicular הקרינה מתחילה להיות שנצפתה לאחר 1.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס ומגיעה לעוצמת הקרינה המרבית בתוך 6 שעות. הטמפרטורה האופטימלית וזמן דגירה יכולות להשתנות בהתאם למבנים הספציפיים בשימוש. לדוגמה, חלבוני ניאון שונים להבשיל באופן שונה לגמרי באופן תלוי בטמפרטורה. במילים אחרות, ההתבוננות של ייצור חלבון היא לא תלויה אך ורק על סינתזה של חלבונים וקיפול, אלא גם על היווצרות chromophore. סינתזה של חלבון באופן כללי יכולה להיות מוגברת על ידי שילוב של חלבון קרום נקבוביות כדי לאפשר לזרם של רכיבים מדולדלים הדרושים לשעתוק ותרגום 27.
מומלץ לבצע שעתוק-תרגומים מקבילים תגובת tion בהעדר שלפוחית כדי להבטיח שהמבנה הגנטי ניצלו הוא פונקציונלי. תגובת שליטה זו היא פיקוח בקלות רבה יותר על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה ולא מיקרוסקופית. איור 4 מראה בתגובת שעתוק-תרגום חוץ גופית של mVenus קידוד לבנות. תגובות unencapsulated לתת הרבה יותר גבוה עוצמות הקרינה הכולל יותר מאשר תגובות intravesicular דומות. זאת בשל יעילות אנקפסולציה וכי סך נפח intravesicular הוא הרבה פחות מאשר נפח extravesicular (כלומר אפקט דילול).
איור 1. המאייד הסיבובי ומשאבת ואקום. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
עבור: לשמור-together.within עמודים = "תמיד">
איור 2. הדיור ובחלקים מהמכבש מוצגים בנפרד. משמאל לימין, מזרק, אגוז שכר טרחה, ועליו טפלון, הקרום פנימי תומך עם טבעות אטימות שחורות פונות אחד לשני, מעטפת חיצונית מכבש, ומזרק שני. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 3. תמונות הקרינה של ייצור חלבון בmVenus יפוזומים וC:.. תמונות שדה בהירות של שלפוחית multilamellar לאחר 1.5 שעות ו -2.5 שעות B ו &# 160; D: הייצור של mVenus הוא דמיינו ידי (בצבע הירוק), לאחר 1.5 ו -2.5 שעות, בהתאמה פלואורסצנטי. בר סולם הוא 20 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
איור 4. בתגובה שליטה במבחנה של nonencapsulated בשעתוק במבחנה ותרגום של mVenus. עוצמת הקרינה שנמדדה בכל 5 דקות במשך 4 שעות. הנתונים נרכשו עם מכשיר Real-Time PCR. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.
למרות שביולוגיה סינטטי ללא תא היא עדיין בחיתוליו, התקדמות הניחה בסיס שממנו ניתן לבצע מערכות כמו תאים מורכבות יותר ויותר. הכינון מחדש של מכונות שעתוק-תרגום מוגדר באופן מלא בתוך 9 רכיבים של שלפוחית 28 היה משמעותי במיוחד בקידום מאמצים מאוחרים יותר בבנייה מלאכותית מגיב לסביבה cells17, 18. כמו כן, נעשו שימוש במחקרים בתאים מלאכותיים כדי לחקור תהליכים אבולוציוניים 4,29,30, הפרטים מכניסטית של RNA והסינתזה של חלבוני 22,31, את ההשפעות של load32 חילוף חומרים, בת 33, ואת ההרכבה של חלקיקים נגיפיים 34. חשוב מכך, קיים כיום מספיק ידע שהתפקוד הבסיסי של התא ניתן מחדש פנימי של שלפוחית במעבדה בעקבות דוחות קודמים אלו ואת הפרוטוקולים שתוארו במסמך זה.
בנוסף להיותו קל, אנקפסולציה תאר יחסי הציבוריש ocedure מספר יתרונות. לדוגמה, רבים aliquots שלפוחית ריק, lyophilized יכול להתבצע מראש ומאוחסן ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. הפרוטוקול עושה מולקולות ביולוגיות אינו כפופות לממסים אורגניים, שינויי טמפרטורה קיצוניות, או תקופות ארוכות של דיאליזה. אנו מצפים כי עדינותו של הנוהל תאפשר שילוב של רכיבים נוספים לפי צורך. יש לנו גם לא נצפו תופעות לוואי לשינוי בהרכב השומנים של הקרום על אנקפסולציה או יעילות שעתוק-תרגום. לכן, שומנים נוחים יותר לשילוב של חלבונים בממברנה, מורפולוגיות ספציפיות, או להדמיה יכולים להעלות על הדעת ניתן לנצל.
המגבלה העיקרית של השיטה היא שתארה את שלפוחית כתוצאה מכך הם אינם הומוגני בגודל או lamellarity. עבור יישומים רבים, הקשיים אלה לא מפריעים לפרשנות של נתונים. עם זאת, במידת הצורך, ניתן לשלב בצעדים נוספים ל הצרההתפלגות גודל הדואר ולהקטין את השכבות של ממברנות, כגון סבב נוסף של חול לאחר אנקפסולציה, הקפאת הפשרה, או דיאליזה 35. אין ספק ששיטות טובות יותר לעקוף בעיות אלה ואחרות תפותח. עד אז, אנו מוצאים את הפרוטוקול מתואר כאן כדי להיות מתאים גם לבניית מחקה סלולרי.
המחברים אין לחשוף.
המחברים מודים קרן Armenise-הרווארד, מארי קירי טרנטינו COFUND (ACS), המחוז האוטונומי של טרנטו (Ecomm), וCIBIO למימון.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Quick Spin Mini-prep kit | Qiagen | 27104 | |
Spectrometer | NanoDrop 1000 | NDB767ND | |
POPC | Avanti Polar Lipids | 770557 | MW 760 g/mol Transition Temp -2 °C CAS# 26853-31-6 |
Ethanol | Sigma Aldrich | 459836 | Anhydrous, >99.5% |
Phenol-choloroform-isoamyl alcohol 25:24:1, for molecular biology use | Sigma Aldrich | P3803-100mL | Saturated with 10 mM Tris, pH 8.0, 1 mM EDTA |
Chloroform | Biotech Grade Fluka | 496189-1L | Contain ethanol at 0.5-1.0% v/v as stabilizer |
Brown amber glass bottles | VWR | 89043-518 | 55X 48 mm |
Rotary evaporator | Buchi Rotovapor R-210/Sigma | Z563846EU-1EA | With jack and water bath, 29/32 joint 240 V |
Analog vortex mixer | VWR | 945300 | Speed 1,000-3,200 rpm |
Homogenizer | IKA T10 Basic Ultra-Turbax | 3420000 | |
Mini-extruder | Avanti Polar Lipids | 610020 | |
Extruder filters | Whatman | 610014 | drain disc 10 mm |
Extruder polycarbonate membrane 400 nm | Whatman | 61007 | nuclepore polycarbonate |
Speed vacuum | Labconco | 7970011 | Centritrap DNA concentrator |
PURExpress kit | New England Biolabs | NRM #E6800S | |
RNAse inhibitor (40,000 U/ml) | New England Biolabs | #M0307S | |
Proteinase K (20.2 mg/ml) | Fermentas | #EO0491 | |
Microscope | Zeiss Observer Z1with a AxioCam MRm camera | ||
RealTime | CFX96 Real time PCR Detection System (Biorad) | ||
Silicon press to seal -Molecular Probe | Life Technologies | P18174 | Resistant from -25-30 °C |
Siliconized glass circle cover slides | Hampton Research | HR3-231 | Diameter= 22 mm |
ImageJ | NIH |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionThis article has been published
Video Coming Soon
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved