Encapsulation של תמלול נטול סלולרי ומכונות בתרגום לשלפוחית ​​לבניית מחקה סלולרי

בזאת אנו מתארים שיטות פשוטות להכנה של שלפוחית, אנקפסולציה של שעתוק ותרגום מכונה, והניטור של ייצור חלבון. מערכות תא ללא כתוצאה מכך יכולות לשמש כנקודת התחלה שממנו ניתן לבנות מחקה סלולרי מורכב יותר ויותר.

כמשמרות ריבית ממולקולות בודדות למערכות של מולקולות, מספר גדל והולך של מעבדות ביקשו לבנות מלמטה למעלה מחקה סלולרי שמייצגים טובים יותר את המורכבות של חיים תאיים. נכון להיום יש מספר המסלולים שניתן לנקוט כדי לבנות מחקה סלולרי ממודר, כולל ניצול של תחליבים מים בשמן, התקני microfluidic, ושלפוחית. כל אחת מהאפשרויות הזמינות יש יתרונות וחסרונות מסוימים. לדוגמה, תחליבים מים בשמן לתת יעילות גבוהה אנקפסולציה אבל לא לחקות היטב את מחסום החדירות של תאי חיים. היתרון העיקרי של השיטות שתוארו במסמך זה הוא שהם כולם קלים וזולים ליישום. מכונות תמלול-תרגום היא כמוסות פנימית של שלפוחית ​​פוספוליפידים באמצעות תהליך המנצל את המכשור משותף, כגון מאייד הצנטריפוגלי ומכבש. תגובות מנוטרות על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה. הפרוטוקולים יכול להיות מותאם לביטוי חלבון רקומביננטי, הבנייה מחקה סלולרי, החקירה של דרישות המינימום לחיים הסלולר, או ההרכבה של מעגלים גנטיים.

ללא תא, במבחנה תגובות שעתוק-תרגום והדור של שלפוחית ​​משומנים סינטטיים אינם דבר חדש. עם זאת, שילוב של שתיים לתוך הסלולר לחקות הוא באופן משמעותי יותר challenging1-6. א תמציות סלולריים coli עם או בלי RNA פולימראז T7 יכולות לשמש כמקור של מכונות שעתוק-תרגום ^7,8. תמציות סלולריים נהנות מהנוכחות של רכיבים סלולריים נוספים שיכול להקל ביטוי חלבון ומתקפל. לחלופין, שילוב של RNA בנפרד מטוהר ומולקולות חלבון, כלומר את מערכת PURE ^9, יכול לשמש כדי לתווך סינתזת חלבון intravesicular ^4,10-14. מערכת PURE מאפשרת לבניית מחקה סלולרי שהוגדר באופן מלא ואינו סובלת מפעילות nuclease מצאה בתמציות סלולריים. מבחינה מעשית, זה אומר שנדרש הרבה פחות תבנית ה-DNA, ובכך להקל על תהליכים עם יעילות נמוכה אנקפסולציה ¹¹ . למרות ששימוש בתדירות נמוך יותר, ניתן לבנות מחקה סלולרי עם תמציות תאים שמקורם מcells15 אוקריוטים. עד כה, דווחו מפלים כמוס מקודדים גנטי ומחק סלולריים שלחוש את סביבת ^16-18.

הדרך הפשוטה כדי לעקוב אחר תגובות שעתוק-תרגום היא למדוד את הקרינה או הארה של אלמנטים גנטי מקודדים. בדרך כלל, גחלילית לוציפראז ¹⁹ או GFP משמשים, אם כי במבחנה תגובות נמדדות לעתים קרובות על ידי radiolabeling. גילוי הקרינה בנוסף הוא מאפשר ניטור של אוכלוסיות של שלפוחית ^​​20,21 באמצעות שיטות מבוססות cytometry, ובכך מציע כמה תובנות לגבי האופי האקראי של תהליכים דמויי ביולוגיים. שיטות ניטור אלה כבר משמשים להגדרת קבוצה קטנה של כללי עיצוב וספרייה של חלקים ממנו ניתן לבנות, כולל אוסף של חלבוני ניאון התואמים אותיn מבחנת שעתוק-תרגום ^22, בהשפעת הארגון על ביטוי גנטי ^22, הפעילות של גורמי סיגמא ^16, ואת היעילות של Terminators תעתיק ^23. עם זאת, יש עדיין הרבה דברים שצריך לעשות כדי להגדיל את היכולת של הבנייה צפויה במבחנה, מכשירים מקודדים גנטי.

ישנן שיטות רבות זמינות כדי להפוך שלפוחית. השיטות הנפוצות ביותר תלויות בדור של שומנים בדם סרט דק על משטח זכוכית ואחריו resuspension בsolution24 המימית. אם התמיסה המימית מכילה מכונות שעתוק-תרגום, למשל, אז חלק של שלפוחית ​​שנוצר היה להכיל את כל מרכיבים הדרושים לייצור חלבון. עם זאת, את היעילות של אנקפסולציה שיטות כאלה היא נמוכה, כלומר, רק אחוז קטן של שלפוחית ​​הם פעיל. רבים מהשיטות החלופיות מאופיינים EFF אנקפסולציה הרבה יותר גבוהiciency לנצל את ההמרה של טיפות מים בתחליב שמן לשלפוחית. אמנם סביר להניח כי שיטות כאלה תהיה דבר שבשגרה בעתיד, כיום שיטות אלה סובלים מהצורך של ציוד מיוחד ולתת לי שלפוחית ​​עם קרום קומפוזיציות שהשתנו ^25. יתרון בולט מים בתוך שמן של שיטות לשלפוחית ​​הוא הפוטנציאל לשלוט lamellarity הממברנה. השיטה המתוארת במסמך זה מבוססת על פרוטוקול סרט שומנים בדם הדק שתואר על ידי Yomo ¹¹ המעבדה עם שינויים קלים ביניהם צעד homogenization נוסף. שיטה זו היא קלה, זולה, ונותנת שלפוחית ​​חזקה גם מתאימה לאנקפסולציה של מכונות שעתוק-תרגום.

1. הכנת תבנית ה-DNA

1. לטהר את הפלסמיד מזן מעבדה סטנדרטי של א ' coli, כגון א ' coli DH5a או נובה כחולה עם ערכה מסחרית. לחלופין, מוצר ה-PCR ליניארי יכול להיות מטוהר באופן דומה עם ערכה מסחרית. Elute DNA עם O H ₂ בלבד.
2. פנול, כלורופורם לחלץ את פתרון ה-DNA ^26.
3. קבע את ריכוז ה-DNA ובטהרה, לדוגמה על ידי ספיגת קרינת UV או שיטות מתאימות אחרות. חשוב להשתמש בדנ"א טהור ביותר ליעיל שעתוק-תרגום.

2. הכנת סרט יפידים הדק

1. שוקל אבקת שומנים בדם היבשה ומתמוסס בממס. עבור 1-Palmitoyl-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (POPC), פתרונות מניות מוכנים בכלורופורם בריכוז של 40 מ"ג / מ"ל.
   הערה: ממסים אורגניים חייבים תמיד להיות מטופלים עם pipettes הזכוכית ובקבוקים. במילים אחרות, לא חייב להיות בשימוש פלסטיק. של החנותפתרונות טוק בבקבוקי אוויר חזק, ממס עמיד ענבר זכוכית ב -20 ° C, עדיף תחת ארגון.
2. Aliquot μmol POPC 12 (220 μl של פתרון מניות מ"ל 40 מ"ג /) לתוך בקבוק תחתית עגול 5 מ"ל.
3. להתאדות הממס עם מאייד סיבובי (איור 1) על מנת ליצור את סרט השומנים בדם הדק.
   1. מאובטח לצרף בקבוק תחתית העגול לצינור הזיקוק עם קליפ מעגלי ולהתחיל את הסיבוב של הבקבוק.
   2. ליזום את זרימת מים דרך סליל המעבה. שימוש באמבט חום הוא לא הכרחי, כי כלורופורם יש נקודת רתיחה נמוכה של 61.2 מעלות צלזיוס בלחץ אטמוספרי רגיל.
   3. ודא כי המערכת אינו פתוחה לאטמוספרה על ידי בדיקת שהסתום פתוח. הפעל את משאבת הוואקום ולסגור את הברז כדי להחיל את הוואקום למערכת לאט.
   4. סרט שומנים דק מופקד על קירות בקבוקון תחתית העגול במהלך אידוי סיבובי ויוצר סרט אטוםכי הוא גלוי על ידי העין. בואו נמשיך לאידוי הסיבובי 0.5-2 שעות. כדי לעצור את התהליך, לאט לאט לשחרר את לחץ הוואקום, להפסיק את הסיבוב, ולהסיר את בקבוק תחתית העגול.

3. Resuspension שומנים בדם והשלפוחיות Homogenization

1. הוסף 1 מ"ל 18.2 MΩ H ₂ O לסרט השומנים הדק ישירות בבקבוק תחתית העגול. במרץ מערבולת הפתרון במהירות המרבית, כ 3,200 סל"ד, עד שסרט השומנים מתנתק מהזכוכית, אשר נצפית על ידי העין.
2. העבר את פיזור השומנים לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל.
3. הגדרת טבעת עומדת להחזיק homogenizer עם טיפ 5 מ"מ. הנח דוכן microcentrifuge מתחת homogenizer להחזיק היטב את פיזור השומנים בדם. יש לשטוף את אלמנט פיזור של homogenizer ידי טבילה בקצה 18.2 MΩ H ₂ O והפעלתו במשך כמה שניות.
4. הנח את אלמנט פיזור ישירות לפיזור השומנים הבטחת הבקצה לא נוגע בחלק התחתון של צינור microcentrifuge. Homogenize דקות 1 ברמת העצמה 4 או 14,000 סל"ד.

4. חול שלפוחית ​​וlyophilization

1. להרכיב את החלקים של אגוז מקדמה כי בתים דו קרום טפלון פנימי תומך, שתי טבעות אטימות, ומסב טפלון אחד מיני מכבש (איור 2), אשר מורכב ממעטפת חיצונית ו.
   1. מניחים את שתי טבעות האטימות לתוך החריצים של תומך בממברנה הפנימי. מסנני Prewet שני וקרום אחד 400 ננומטר. את המסננים יוצבו נגד הטפלון פנימי של טבעות O-עם הקרום ביניהם.
   2. מניחים את הקרום תומך למעטפת החיצונית מכבש עם הקרום מוקף בשני מסננים בין הטבעות האטימות. הנח את נושא הטפלון בתוך המעטפת ולצרף את האום המייצבת ולהדק ביד.
2. יש לשטוף את שני מזרקים ולמלא אחד עם 18.2 MΩ מים. הכנס את מחטי המזרק לתוך שעות קטנותOles בטפלון על כל צד של ההרכבה מכבש. המחטים צריכה להחליק בקלות, אל תכריחו את המחטים. אבטח את מכבש עם המזרקים לתוך דיור מכבש ולהדק.
3. להעביר את המים דרך מכבש על ידי דחיפת המים לאט ממזרק אחד לתוך השני. זה מייצג את מעבר אחד. חזור על פעולה עבור סכום כולל של שלושה קטעים להבטיח כי אין נזילות בהווה. הוצא את המזרק במים ולסלק את המים.
4. מלא מזרק אחד עם המדגם, לצרף למכבש, ולהעביר את פתרון השלפוחית ​​לאט דרך הקרום כמתואר לעיל בשלב 4.3. חזור על 10x עבור סכום כולל של 11 קטעים. ככל שמתקדם תהליך שחול, המדגם יהיה פחות עכור ויותר קל לדחוף על פני הקרום. ירידה פתאומית בהתנגדות, לעומת זאת, בדרך כלל מצביעה על פקיעת של הקרום.
5. מעבירים את פתרון השלפוחית ​​הנמתח ולעשות 40 aliquots μl של שלפוחית ​​לצינורות microcentrifuge.פלאש להקפיא כל aliquot באו קרח יבש או בחנקן נוזלי.
6. Lyophilize כל aliquot עם מאייד צנטריפוגלי לילה בשעה 30 ° C. אחסן את שלפוחית ​​ריקה lyophilized ב -20 ° C.

5. Encapsulating מכונות תמלול-תרגום

1. מערבבים את המרכיבים של תגובת שעתוק-התרגום ולהוסיף 20 יחידות של מעכב RNase. דגירה על קרח.
2. הוסף את תבנית ה-DNA. לתגובת שליטה, 250 ng של mVenus קידוד פלסמיד או חלבון פלואורסצנטי דומה מאחורי אמרגן T7 תעתיק וא חזק אתר מחייב הריבוזום coli מומלץ.
3. להביא את הנפח הסופי ל -25 μl עם מים RNase חינם.
4. מימה aliquot של שלפוחית ​​lyophilized (משלב 4.6) עם 10 μl של התגובה התאסף בשלב 5.3. מערבולת בקצרה את התערובת עד שהשלפוחית ​​היא resuspended. זה אמור לקחת פחות מ -30 שניות.
5. דגירה התגובה על קרח 30 דקות, כדי לאפשר את שלפוחית ​​להתנפח.
6. לדלל את תערובת השלפוחית ​​פי 20 לנפח סופי של 30 על ידי הוספת 1.5 μl μl של שלפוחית ​​ל27.0 μl של 50 מ"מ טריס-HCl, 50 מ"מ NaCl, pH 7.4 ו 1.5 μl של 20.2 מ"ג / מיליליטר proteinase ק DNase וRNase ניתן גם להוסיף בשלב זה כאלטרנטיבה לproteinase K להשפיל חומר extravesicular.
7. דגירה של לפחות 2.5 שעות ב 37 ° C.

6. מיקרוסקופיה

1. לבחון את שלפוחית ​​ואת ההתקדמות של ייצור חלבון פלואורסצנטי בנקודות זמן שונים. שלפוחית ​​תהיה בקוטר גדול יותר מאשר 400 ננומטר נקבובית בגודל של קרום שלפוחית ​​משמש להבלטה.
   1. הכן מדגם קאמרי על ידי הצבת spacer מ"מ 20 X 5 סיליקון לשקופית מיקרוסקופ רגיל. פיפטה μl 10 של שלפוחית ​​לתוך תא המדגם. במקום להחליק כיסוי זכוכית siliconized על קאמרי.
   2. שים לב לשלפוחית ​​עם פיזור שמן o 63Xמטרה דומה על ידי R שדה בהיר ומיקרוסקופ פלואורסצנטי באמצעות מערכת הסינון המתאימה לחלבון פלואורסצנטי ניצלו.

מיקרוסקופ פלואורסצנטי מגלה הקרינה שנצפתה רק החלק פנימי של שלפוחית, כי החומר הוא extravesicular enzymatically מושפל (איור 3). לביטוי של mVenus, intravesicular הקרינה מתחילה להיות שנצפתה לאחר 1.5 שעות על 37 מעלות צלזיוס ומגיעה לעוצמת הקרינה המרבית בתוך 6 שעות. הטמפרטורה האופטימלית וזמן דגירה יכולות להשתנות בהתאם למבנים הספציפיים בשימוש. לדוגמה, חלבוני ניאון שונים להבשיל באופן שונה לגמרי באופן תלוי בטמפרטורה. במילים אחרות, ההתבוננות של ייצור חלבון היא לא תלויה אך ורק על סינתזה של חלבונים וקיפול, אלא גם על היווצרות chromophore. סינתזה של חלבון באופן כללי יכולה להיות מוגברת על ידי שילוב של חלבון קרום נקבוביות כדי לאפשר לזרם של רכיבים מדולדלים הדרושים לשעתוק ותרגום ^27.

מומלץ לבצע שעתוק-תרגומים מקבילים תגובת tion בהעדר שלפוחית ​​כדי להבטיח שהמבנה הגנטי ניצלו הוא פונקציונלי. תגובת שליטה זו היא פיקוח בקלות רבה יותר על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה ולא מיקרוסקופית. איור 4 מראה בתגובת שעתוק-תרגום חוץ גופית של mVenus קידוד לבנות. תגובות unencapsulated לתת הרבה יותר גבוה עוצמות הקרינה הכולל יותר מאשר תגובות intravesicular דומות. זאת בשל יעילות אנקפסולציה וכי סך נפח intravesicular הוא הרבה פחות מאשר נפח extravesicular (כלומר אפקט דילול).

איור 1. המאייד הסיבובי ומשאבת ואקום. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

עבור: לשמור-together.within עמודים = "תמיד">
איור 2. הדיור ובחלקים מהמכבש מוצגים בנפרד. משמאל לימין, מזרק, אגוז שכר טרחה, ועליו טפלון, הקרום פנימי תומך עם טבעות אטימות שחורות פונות אחד לשני, מעטפת חיצונית מכבש, ומזרק שני. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 3. תמונות הקרינה של ייצור חלבון בmVenus יפוזומים וC:.. תמונות שדה בהירות של שלפוחית ​​multilamellar לאחר 1.5 שעות ו -2.5 שעות B ו &# 160; D: הייצור של mVenus הוא דמיינו ידי (בצבע הירוק), לאחר 1.5 ו -2.5 שעות, בהתאמה פלואורסצנטי. בר סולם הוא 20 מיקרומטר. לחץ כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

איור 4. בתגובה שליטה במבחנה של nonencapsulated בשעתוק במבחנה ותרגום של mVenus. עוצמת הקרינה שנמדדה בכל 5 דקות במשך 4 שעות. הנתונים נרכשו עם מכשיר Real-Time PCR. לחצו כאן לצפייה בתמונה גדולה יותר.

למרות שביולוגיה סינטטי ללא תא היא עדיין בחיתוליו, התקדמות הניחה בסיס שממנו ניתן לבצע מערכות כמו תאים מורכבות יותר ויותר. הכינון מחדש של מכונות שעתוק-תרגום מוגדר באופן מלא בתוך ⁹ רכיבים של שלפוחית ^​​28 היה משמעותי במיוחד בקידום מאמצים מאוחרים יותר בבנייה מלאכותית מגיב לסביבה cells17, 18. כמו כן, נעשו שימוש במחקרים בתאים מלאכותיים כדי לחקור תהליכים אבולוציוניים ^4,29,30, הפרטים מכניסטית של RNA והסינתזה של חלבוני ^22,31, את ההשפעות של load32 חילוף חומרים, בת 33, ואת ההרכבה של חלקיקים נגיפיים ^34. חשוב מכך, קיים כיום מספיק ידע שהתפקוד הבסיסי של התא ניתן מחדש פנימי של שלפוחית ​​במעבדה בעקבות דוחות קודמים אלו ואת הפרוטוקולים שתוארו במסמך זה.

בנוסף להיותו קל, אנקפסולציה תאר יחסי הציבוריש ocedure מספר יתרונות. לדוגמה, רבים aliquots שלפוחית ​​ריק, lyophilized יכול להתבצע מראש ומאוחסן ב -20 ° C לשימוש מאוחר יותר. הפרוטוקול עושה מולקולות ביולוגיות אינו כפופות לממסים אורגניים, שינויי טמפרטורה קיצוניות, או תקופות ארוכות של דיאליזה. אנו מצפים כי עדינותו של הנוהל תאפשר שילוב של רכיבים נוספים לפי צורך. יש לנו גם לא נצפו תופעות לוואי לשינוי בהרכב השומנים של הקרום על אנקפסולציה או יעילות שעתוק-תרגום. לכן, שומנים נוחים יותר לשילוב של חלבונים בממברנה, מורפולוגיות ספציפיות, או להדמיה יכולים להעלות על הדעת ניתן לנצל.

המגבלה העיקרית של השיטה היא שתארה את שלפוחית ​​כתוצאה מכך הם אינם הומוגני בגודל או lamellarity. עבור יישומים רבים, הקשיים אלה לא מפריעים לפרשנות של נתונים. עם זאת, במידת הצורך, ניתן לשלב בצעדים נוספים ל הצרההתפלגות גודל הדואר ולהקטין את השכבות של ממברנות, כגון סבב נוסף של חול לאחר אנקפסולציה, הקפאת הפשרה, או דיאליזה ^35. אין ספק ששיטות טובות יותר לעקוף בעיות אלה ואחרות תפותח. עד אז, אנו מוצאים את הפרוטוקול מתואר כאן כדי להיות מתאים גם לבניית מחקה סלולרי.

המחברים אין לחשוף.

המחברים מודים קרן Armenise-הרווארד, מארי קירי טרנטינו COFUND (ACS), המחוז האוטונומי של טרנטו (Ecomm), וCIBIO למימון.