وتغليف من النسخ خالية من الخلايا وآلات الترجمة في الحويصلات لتشييد المقلدون الخلوية

هنا نحن تصف طرق بسيطة لإعداد الحويصلات، والتغليف من النسخ وآلات الترجمة، ورصد إنتاج البروتين. نظم خالية من الخلايا الناتجة يمكن استخدامها كنقطة انطلاق من خلالها لبناء يقلد الخلوية تزداد تعقيدا.

كما التحولات الفائدة من الجزيئات الفردية لأنظمة الجزيئات، وقد سعى عدد متزايد من مختبرات لبناء من أسفل إلى أعلى يقلد الخلوية التي تمثل أفضل تعقيد الحياة الخلوية. حتى الآن هناك عددا من المسارات التي يمكن اتخاذها لبناء يقلد الخلوية مجزأة، بما في ذلك استغلال مستحلبات الماء في الزيت، وأجهزة ميكروفلويديك، والحويصلات. كل واحد من الخيارات المتاحة لديها مزايا وعيوب محددة. على سبيل المثال، مستحلبات الماء في الزيت تعطي كفاءة عالية التغليف ولكن لا تحاكي جيدا حاجز نفاذية الخلايا الحية. الميزة الأساسية من الطرق الموصوفة هنا هو أنها كلها سهلة ورخيصة لتنفيذ. يتم تغليف آلات النسخ الترجمة داخل الحويصلات فوسفورية خلال العملية التي تستغل الأجهزة المشتركة، مثل المبخر الطرد المركزي والطارد. ويتم رصد ردود الفعل من قبل مضان الطيفي. بروتوكولو يمكن تكييفها لالمؤتلف تعبير البروتين، وبناء يحاكي الخلوية، واستكشاف متطلبات الحد الأدنى للحياة الخلوية، أو الجمعية من الدوائر الجينية.

خالية من الخلايا، في المختبر التفاعلات النسخ الترجمة وتوليد الحويصلات من الدهون الاصطناعية ليست شيئا جديدا. ومع ذلك، والجمع بين اثنين الى الخلوية تقليد هو أكثر بكثير challenging1-6. E. مقتطفات الخلية القولونية مع أو بدون T7 RNA البلمرة يمكن استخدامها كمصدر للآلات النسخ، ترجمة ^7،8. فائدة مقتطفات خلية من وجود المكونات الخلوية الإضافية التي يمكن أن تسهل تعبير البروتين وقابلة للطي. بدلا من ذلك، مزيج من حدة تنقية الحمض النووي الريبي وجزيئات البروتين، أي نظام PURE ^9، ويمكن استخدامها للتوسط intravesicular تخليق البروتين ^4،10-14. نظام PURE يسمح لبناء يقلد الخلوية محددة تماما ولا يعاني من النشاط نوكلياز وجدت في مقتطفات الخلية. عمليا، هذا يعني أنه مطلوب قالب الحمض النووي أقل من ذلك بكثير، مما يسهل عمليات مع انخفاض كفاءة التغليف ¹¹ . وإن كانت أقل استخداما، ويمكن أن يبنى يقلد الخلوية مع مقتطفات الخلية المستمدة من cells15 حقيقية النواة. حتى الآن، تم الإبلاغ عن شلالات مغلفة المشفرة وراثيا ويقلد الخلوية التي الإحساس بالبيئة ^16-18.

إن أبسط طريقة لرصد ردود الفعل النسخ الترجمة هو قياس مضان أو التلألؤ من عناصر المشفرة وراثيا. عادة، luciferase يراعة ¹⁹ أو GFP تستخدم، على الرغم من أن في المختبر غالبا ما تقاس ردود الفعل من قبل radiolabeling. الكشف عن مضان يسمح أيضا لرصد السكان من الحويصلات ^20،21 من خلال الطرق المعتمدة على الخلوي، مما يوفر بعض التبصر في طبيعة العشوائية من العمليات البيولوجية مثل. وقد استخدمت هذه الأساليب الرصد لتحديد مجموعة صغيرة من قواعد التصميم ومكتبة من أجزاء من خلالها بناء من، بما في ذلك مجموعة من البروتينات الفلورية التي تتوافق مع طن النسخ المختبر الترجمة ^22، وتأثير منظمة الجيني على التعبير ^22، النشاط من العوامل سيجما ^16، وكفاءة الإنهاء النسخي ^23. ومع ذلك، لا يزال هناك الكثير الذي يتعين القيام به لزيادة القدرة على بناء يمكن التنبؤ بها في المختبر والأجهزة المشفرة وراثيا.

هناك العديد من الأساليب المتاحة لجعل الحويصلات. الأساليب الأكثر شيوعا تعتمد على جيل من فيلم الدهون رقيقة على سطح الزجاج تليها إعادة تعليق في solution24 مائي. إذا كان محلول مائي يحتوي على آلات النسخ، الترجمة، على سبيل المثال، ثم جزء من الحويصلات شكلت شأنه أن يحتوي على العناصر اللازمة لإنتاج البروتين. ومع ذلك، فإن كفاءة التغليف من هذه الأساليب هو منخفض، وهذا يعني أنه ليس هناك سوى نسبة ضئيلة من الحويصلات نشطة. العديد من الطرق البديلة التي تتسم أعلى من ذلك بكثير EFF التغليفiciency استغلال التحويل من قطرات الماء في مستحلب النفطية إلى حويصلات. في حين أنه من المرجح أن مثل هذه الأساليب سوف تكون أمرا شائعا في المستقبل، في الوقت الراهن هذه الأساليب يعانون من الحاجة إلى المعدات المتخصصة وإعطاء الحويصلات مع التراكيب غشاء تتغير ^25. ميزة واضحة من المياه في النفط إلى أساليب حويصلة هو القدرة على السيطرة lamellarity الغشاء. وتستند هذه الطريقة الموصوفة هنا على بروتوكول فيلم الدهون رقيقة وصفها من قبل المختبر Yomo ¹¹ مع تعديلات طفيفة بما في ذلك خطوة التجانس إضافية. هذه الطريقة سهلة ورخيصة، ويعطي الحويصلات قوية مناسبة تماما لتغليف آلات النسخ، الترجمة.

1. إعداد قالب الحمض النووي

1. تنقية البلازميد من سلالة المختبرية القياسية من E. القولونية، مثل E. القولونية DH5a أو نوفا الأزرق مع مجموعة تجارية. بدلا من ذلك، وهو منتج PCR خطي يمكن تنقيته وبالمثل مع مجموعة تجارية. أزل الحمض النووي مع H ₂ O فقط.
2. الفينول كلوروفورم استخراج الحمض النووي حل ^26.
3. تحديد تركيز الحمض النووي والنقاء، على سبيل المثال عن طريق امتصاص الأشعة فوق البنفسجية أو طرق أخرى مناسبة. من المهم أن استخدام الحمض النووي نقية للغاية لكفاءة النسخ الترجمة.

2. إعداد فيلم الدهن رقيقة

1. وزن مسحوق الدهون الجافة وتذوب في المذيبات. ل 1-بالميتويل-2-oleoyl-SN-glycero-3-phosphocholine (POPC)، يتم إعداد الحلول الأسهم في الكلوروفورم بتركيز 40 ملغ / مل.
   ملاحظة: يجب دائما التعامل مع المذيبات العضوية الماصات الزجاج والزجاجات. وبعبارة أخرى، يجب ألا تستخدم أبدا البلاستيك. متجر لياليحلول توك في ضيق، المذيبات مقاومة الزجاجات العنبر الهواء عند درجة حرارة -20 درجة مئوية، ويفضل أن يكون تحت الأرجون.
2. قسامة 12 ميكرومول POPC (220 ميكرولتر من 40 ملغ / مل محلول المخزون) في الجولة 5 مل قارورة أسفل.
3. تتبخر المذيب مع المبخر الدوار (الشكل 1) لتوليد فيلم الدهون رقيقة.
   1. نعلق آمن قارورة أسفل جولة لأنبوب التقطير مع مقطع دائري وبدء دوران من القارورة.
   2. بدء تداول المياه من خلال لفائف المكثف. باستخدام حمام الحرارة ليست ضرورية، لأن الكلوروفورم لديه نقطة غليان منخفضة من 61.2 درجة مئوية تحت الضغط الجوي العادي.
   3. تأكد من أن نظام مفتوح إلى الغلاف الجوي عن طريق التحقق من أن محبس مفتوح. بدوره على مضخة فراغ وببطء إغلاق محبس لتطبيق فراغ إلى النظام.
   4. يترسب فيلم رقيقة الدهون على جدران القارورة أسفل جولة خلال التبخر الدوارة تشكيل فيلم مبهمةأن يكون مرئيا بالعين. السماح للتبخر الدوارة يستمر لمدة 0.5-2 ساعة. لإيقاف عملية، والإفراج عن ببطء ضغط الفراغ، والتوقف عن الدوران، وإزالة قارورة أسفل جولة.

3. إعادة تعليق الدهون والتجانس الحويصلة

1. إضافة 1 مل 18.2 MΩ H ₂ O للفيلم الدهون رقيقة مباشرة في قارورة أسفل جولة. دوامة بقوة حل في أقصى سرعة، ما يقرب من 3،200 دورة في الدقيقة، حتى الفيلم الدهون يفصل من الزجاج، والتي يمكن ملاحظتها بالعين.
2. نقل تشتت الدهون في أنبوب microcentrifuge 2 مل.
3. انشاء حلقة الوقوف على عقد الخالط مع طرف 5 مم. وضع الوقوف microcentrifuge تحت الخالط لعقد آمن تشتت الدهون. شطف عنصر تشتيت للالخالط بغمر طرف في 18.2 MΩ H ₂ O والجري لبضع ثوان.
4. وضع عنصر تشتيت مباشرة في تشتت الدهون ضمان الفي الطرف لا تلمس الجزء السفلي من أنبوب microcentrifuge. التجانس لمدة 1 دقيقة في مستوى الطاقة 4 أو 14،000 دورة في الدقيقة.

4. النتوء حويصلة وتجفيد

1. تجميع أجزاء من مصغرة الطارد (الشكل 2)، والذي يتكون من الغلاف الخارجي والجوز التجنيب الذي يضم اثنين من غشاء تفلون الداخلية تدعم، واثنين من الحلقات، واحدة تحمل تفلون.
   1. وضع اثنين O-الخواتم في الأخاديد من الدعم الغشاء الداخلي. Prewet اثنين من المرشحات واحدة 400 نانومتر الغشاء. سيتم وضع فلاتر ضد تفلون داخل O-حلقات مع غشاء بينهما.
   2. وضع غشاء يدعم في الغلاف الخارجي الطارد مع غشاء يحيط بها اثنين من المرشحات في بين O-حلقات. ضع تحمل تفلون داخل غلاف وإرفاق الجوز التجنيب وتشديد باليد.
2. شطف اثنين من المحاقن وملء واحدة مع 18.2 MΩ المياه. إدراج إبر حقنة في ح الصغيرةأوليس في تفلون على حد سواء من الجمعية الطارد. ينبغي أن الإبر الانزلاق بسهولة في؛ لا قوة الإبر. تأمين الطارد مع المحاقن في الطارد الإسكان وربط.
3. تمرير المياه من خلال الطارد عن طريق دفع المياه ببطء للخروج من حقنة واحدة وإلى الآخر. هذا يمثل مرور واحدة. تكرار لما مجموعه ثلاثة مقاطع ضمان عدم وجود تسرب الحالي. إزالة المحقنة من المياه والتخلص من المياه.
4. ملء حقنة واحدة مع العينة، نعلق على الطارد، وببطء تمرير حل حويصلة من خلال الغشاء كما هو موضح أعلاه في الخطوة 4.3. كرر 10X لما مجموعه 11 المقاطع. ومع استمرار عملية البثق، وسوف العينة تصبح أقل عكر وأسهل للدفع عبر الغشاء. انخفاض مفاجئ في المقاومة، ومع ذلك، عادة ما يشير إلى تمزق الغشاء.
5. نقل الحل حويصلة مقذوف وجعل 40 مأخوذة ميكرولتر من الحويصلات في أنابيب microcentrifuge.تجميد فلاش كل قسامة في أي من الثلج الجاف أو في النيتروجين السائل.
6. يجفد كل قسامة مع المبخر الطرد المركزي بين عشية وضحاها في 30 درجة مئوية. تخزين حويصلات فارغة مجفف بالتجميد في -20 درجة مئوية.

5. التغليف ماكينات النسخ الترجمة

1. خلط مكونات رد فعل النسخ الترجمة وإضافة 20 وحدة من ريبونوكلياز المانع. احتضان على الجليد.
2. إضافة القالب الحمض النووي. لرد فعل السيطرة، 250 نانوغرام من mVenus ترميز البلازميد أو بروتين فلوري مماثلة وراء المروج T7 النسخي وE. قوية ينصح القولونية موقع ملزمة الريبوسوم.
3. جلب الحجم النهائي إلى 25 ميكرولتر مع ريبونوكلياز خالية من المياه.
4. هيدرات قسامة من الحويصلات مجفف بالتجميد (من الخطوة 4.6) مع 10 ميكرولتر من رد فعل تجميعها في الخطوة 5.3. دوامة لفترة وجيزة الخليط حتى يتم معلق الحويصلات. وهذا ينبغي أن يستغرق أقل من 30 ثانية.
5. احتضان رد فعل على الجليد لمدة 30 دقيقة للسماح الحويصلات إلى تضخم.
6. تمييع الخليط حويصلة 20 أضعاف لتصل إلى الحجم النهائي من 30 ميكرولتر من خلال إضافة 1.5 ميكرولتر من الحويصلات إلى 27.0 ميكرولتر من 50 ملي تريس، حمض الهيدروكلوريك، و 50 ملي مول كلوريد الصوديوم، ودرجة الحموضة 7.4 و 1.5 ميكرولتر من 20.2 ملغ / مل بروتين K. الدناز وريبونوكلياز ويمكن أيضا أن تضاف في هذه المرحلة كبديل للبروتين كاف أن تتحلل المواد extravesicular.
7. احتضان لمدة 2.5 ساعة على الأقل عند 37 درجة مئوية.

6. المجهر

1. دراسة الحويصلات والتقدم من إنتاج بروتين فلوري في نقاط زمنية مختلفة. سوف الحويصلات يكون قطرها أكبر من 400 نانومتر حجم المسام في الغشاء تستخدم لقذف حويصلة.
   1. إعداد غرفة عينة عن طريق وضع 20 × 5 مم التبادل السيليكون على شريحة المجهر القياسية. ماصة 10 ميكرولتر من الحويصلات إلى حجرة العينة. وضع غطاء زجاجي siliconized الانزلاق على الحجرة.
   2. لاحظ الحويصلات مع 63X النفط تشتت سR هدف مماثل من قبل حقل مشرق ومضان المجهري باستخدام مجموعة التصفية المناسب للبروتين فلوري استغلالها.

مضان المجهري يكشف لوحظ أن مضان فقط داخل الحويصلات، وذلك لأن مادة extravesicular هو المتدهورة إنزيمي (الشكل 3). للتعبير عن mVenus، يبدأ intravesicular مضان التي يجب مراعاتها بعد 1.5 ساعة عند 37 درجة مئوية وتصل أقصى كثافة مضان في غضون 6 ساعة. درجة الحرارة المثلى وفترة حضانة يمكن أن تختلف تبعا للبنيات المحددة المستخدمة. على سبيل المثال، البروتينات الفلورية مختلفة تنضج بشكل مختلف تماما في درجة الحرارة بطريقة تعتمد. وبعبارة أخرى، فإن المراقبة من إنتاج البروتين لا تعتمد فقط على تخليق البروتين وقابلة للطي ولكن أيضا على تشكيل حامل اللون. ويمكن زيادة تخليق البروتين الكلي من خلال دمج المسام بروتين الغشاء للسماح لتدفق المكونات اللازمة لالمنضب النسخ والترجمة ^27.

فمن المستحسن لإجراء مماثل النسخ، transla رد فعل نشوئها في غياب حويصلات لضمان بناء الوراثية استغلال وظيفي. ويتم رصد رد الفعل هذا التحكم بسهولة أكبر عن طريق التحليل الطيفي مضان بدلا من المجهري. الشكل 4 يظهر في رد فعل النسخ المختبر-ترجمة لmVenus ترميز بناء. ردود الفعل Unencapsulated تعطي أعلى بكثير مجموع كثافة مضان من ردود الفعل intravesicular مماثلة. هذا يرجع إلى كفاءة التغليف ولأن إجمالي حجم intravesicular هو أقل بكثير من حجم extravesicular (أي تأثير التخفيف).

الشكل 1. المبخر الدوار ومضخة فراغ. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

FO: المحافظة على together.within الصفحات = "دائما">
الشكل 2. وترد السكن وأجزاء من الطارد بشكل منفصل. من اليسار إلى اليمين، حقنة، الجوز التجنيب، تفلون واضعة، الغشاء الداخلي يدعم مع الأسود O-الخواتم التي تواجه بعضها البعض، الطارد الغلاف الخارجي، وحقنة ثانية. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل 3 صور الإسفار من إنتاج البروتين mVenus في الجسيمات الشحمية A و C:. الصور مجال مشرق من الحويصلات الصفاحات بعد 1.5 ساعة و 2.5 ساعة وB &# 160؛ D: إنتاج mVenus هو تصور من قبل مضان (اللون الأخضر) بعد 1.5 و 2.5 ساعة على التوالي. شريط النطاق هو 20 ميكرون. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

الشكل 4. وفي رد فعل السيطرة المختبر من عديم المحفظة في المختبر النسخ والترجمة من mVenus. وقد تم قياس كثافة مضان كل 5 دقائق أكثر من 4 ساعة. تم الحصول على البيانات بأداة PCR الوقت الحقيقي. انقر هنا لمشاهدة صورة بشكل اكبر .

على الرغم من أن البيولوجيا الاصطناعية خالية من الخلايا لا يزال في مراحله الأولى، قد وضعت أساسا من التقدم الذي نظم مثل الخلية التي تزداد تعقيدا ويمكن إجراء. كان إعادة تشكيل آلات النسخ، الترجمة من يعرف تماما مكونات ⁹ داخل الحويصلات ²⁸ أهمية خاصة في تسهيل جهود لاحقا في بناء اصطناعية تستجيب للبيئة cells17، 18. وبالمثل، وقد استخدمت دراسات الخلية الاصطناعية لبحث العمليات التطورية ^4،29،30، وتفاصيل الآلية من RNA وتخليق البروتين ^22،31، وتأثيرات أيضية load32، 33، والجمعية من الجسيمات الفيروسية ^34. الأهم من ذلك، ما يكفي من المعرفة موجود الآن يمكن أن يعاد تشكيل تلك الوظيفة الخلوية الأساسية داخل الحويصلات في المختبر بعد هذه التقارير السابقة والبروتوكولات المذكورة في هذه الوثيقة.

بالإضافة إلى كونه سهل، والتغليف وصفها العلاقات العامةocedure له فوائد عدة. على سبيل المثال، يمكن إجراء العديد من فارغة، مأخوذة حويصلة مجفف بالتجميد في وقت مبكر وتخزينها في -20 درجة مئوية لاستخدامها لاحقا. بروتوكول يفعل الجزيئات البيولوجية لا تخضع للمذيبات العضوية، والتغيرات في درجات الحرارة جذرية، أو فترات طويلة من غسيل الكلى. ونحن نتوقع أن دماثة الإجراء سيسهل دمج مكونات إضافية حسب الحاجة. ونحن أيضا لم يلاحظ الآثار السلبية لتغير تكوين الدهون في غشاء على التغليف أو كفاءة النسخ الترجمة. ولذلك، والدهون أكثر استعدادا لإدراج بروتينات الغشاء، الأشكال التضاريسية محددة، أو التصور يمكن تصور أن تستغل.

فإن القيود الرئيسية من الطريقة الموضحة هو أن الحويصلات الناتجة ليست متجانسة في الحجم أو lamellarity. للعديد من التطبيقات، هذه الصعوبات لا تتعارض مع تفسير البيانات. ومع ذلك، إذا لزم الأمر، ويمكن إدراج خطوات إضافية لال ضيقتوزيع حجم البريد وتقلل من طبقات من الأغشية، مثل جولات أخرى من قذف بعد التغليف، وتجميد ذوبان الجليد، أو غسيل الكلى ^35. وسيتم تطوير طرق أفضل مما لا شك فيه أن الالتفاف على هذه المشاكل وغيرها. حتى ذلك الحين، نجد بروتوكول الموصوفة هنا لتكون مناسبة تماما لبناء يقلد الخلوية.

الكتاب ليس لديهم ما يكشف.

الكتاب نعترف مؤسسة Armenise-هارفارد، وماري كوري ترينتينو COFUND (ACS)، المقاطعة المتمتعة بالحكم الذاتي من ترينتو (Ecomm)، وCIBIO للحصول على التمويل.