Ce protocole est important car il montre une méthodologie étape par étape pour isoler l’épithélium utérin très pur de l’utérus de souris pour la culture d’organoïdes endométrial. Cette méthode utilise efficacement la dissociation enzymatique et mécanique pour isoler l’épithélium utérin. Les techniques ont été rationalisées pour établir, traiter et analyser les organoïdes de l’épithélium de l’endomètre dérivés de l’épithélium isolé.
Commencez par décongeler la matrice de gel sur de la glace pendant environ une à deux heures avant utilisation. Ensuite, disséquez la souris euthanasiée en faisant une incision médiane sur l’abdomen à l’aide de ciseaux, et en décollant doucement la peau pour exposer la couche péritonéale sous-jacente. Localisez les cornes utérines en déplaçant doucement les coussinets graisseux abdominaux de côté et maintenez les cornes utérines à la jonction cervicale avant de les couper le long de la graisse mésentérique.
Après la dissection de l’utérus de souris, retirez soigneusement le tissu adipeux de la corne utérine avec de petits ciseaux. Une fois cela fait, coupez chaque corne utérine en petits fragments, chacun mesurant environ quatre à cinq millimètres. Placez tous les fragments utérins d’un utérus dans un puits d’une plaque de 24 puits contenant 0,5 millilitre de 1% de trypsine.
Incuber ensuite la plaque de 24 puits dans un incubateur de culture tissulaire humidifiée à 37 degrés Celsius pendant environ une heure pour la séparation enzymatique de l’épithélium de l’endomètre du stroma sous-jacent. Après l’incubation, transférer les fragments utérins dans une plaque de culture tissulaire de 35 millimètres contenant un millilitre de solution tamponnée au phosphate de Dulbecco ou DPBS. Ensuite, séparez l’épithélium utérin de la trompe utérine au microscope à dissection en tenant une extrémité d’un fragment utérin avec la pince et en faisant passer doucement l’extrémité de la pipette longitudinalement sur le fragment, en pressant l’épithélium hors de l’autre extrémité de la trompe utérine.
Ensuite, observez les feuillets épithéliaux séparés du fragment utérin au microscope à dissection. Ensuite, transférez doucement toutes les feuilles épithéliales dans le même tube de 1,5 millilitre à l’aide de la pipette d’un millilitre. Et enduire les feuillets épithéliaux dissociés par centrifugation à 375 x g pendant cinq minutes.
Retirez soigneusement le surnageant sans perturber la pastille de cellule et remettez en suspension la pastille de cellule dans 0,5 millilitre de 2,5 milligrammes par millilitre de collagénase plus deux milligrammes par millilitre de solution d’ADN. Pipeter de haut en bas environ 10 fois ou jusqu’à ce qu’une suspension à une seule cellule soit obtenue. Ensuite, ajoutez 0,5 millilitre de DMEM F/12 plus 10% de sérum bovin fœtal ou FBS plus antibiotiques et centrifugez les cellules pendant cinq minutes à 375 x g.
Retirez le surnageant, remettez les cellules en suspension dans un millilitre de DMEM/F12 plus 10% FBS plus antibiotiques et centrifugez les cellules. Placez la matrice de gel sur la glace jusqu’à ce qu’elle soit prête. Ensuite, retirez le surnageant des cellules de centrifugation et remettez en suspension la pastille cellulaire en utilisant 20 fois le volume de la matrice de gel sans introduire les bulles.
Laisser la suspension cellulaire à matrice gel se déposer à température ambiante pendant environ 10 minutes. Une fois que la suspension de cellules à matrice gel devient un gel semi-solide, utilisez une micropipette P200 avec une pointe de 200 microlitres de large alésage et aspirez doucement 25 microlitres de la suspension cellulaire à matrice de gel. Distribuez trois dômes distincts de 25 microlitres par puits d’une plaque de 12 puits et laissez la matrice de gel durcir pendant 15 minutes et un incubateur de culture tissulaire humidifié à 37 degrés Celsius.
Une fois la matrice de gel durcie, ajoutez 750 microlitres de milieu organoïde à chaque puits contenant un dôme à matrice de gel et un incubateur à 37 degrés Celsius dans un incubateur de culture tissulaire humidifié. Les images de contraste de phase des organoïdes de l’endomètre de souris ont montré que la séparation des cellules épithéliales et stromales a produit des échantillons avec pas plus de 10% à 15% de contamination du type cellulaire opposé. Les cellules épithéliales de l’endomètre ont été assemblées en organoïdes en trois à quatre jours.
Les organoïdes endométriaux fixés à la paraffine au formol ont été visualisés par des colorations à l’hématoxyline et à l’éosine, qui présentaient la couche unique d’épithélium et les centres creux, les lumières des organoïdes. L’imagerie au microscope à fluorescence a montré que toutes les cellules des organoïdes étaient positives à la cytokératine 8 et contenaient du DAPI, ce qui indique que la fixation, l’incorporation et le traitement des organoïdes de l’endomètre sont compatibles avec l’immunomarquage à base d’anticorps. La PCR quantitative en temps réel a montré que la stimulation avec 10 nanomolaires d’estradiol augmentait l’expression de la lipocaline 2, de la lactoferrine et du récepteur de la progestérone dans les organoïdes épithéliaux, indiquant que les organoïdes épithéliaux de l’endomètre peuvent être utilisés avec succès pour mesurer les changements d’expression génique en réponse à l’œstradiol.
Il est important de s’assurer qu’une séparation claire de l’épithélium endométrial est obtenue pendant l’étape de dissociation mécanique. On devrait pouvoir observer l’épithélium émergeant de la trompe utérine. D’autres méthodes incluent l’établissement des organoïdes épithéliaux par encapsulation dans une matrice de gel.
Si vous le souhaitez, le compartiment stromal peut être digéré davantage pour créer des co-cultures stromales épithéliales 3D. La méthode peut aider à répondre aux questions sur les signaux contrôlant le renouvellement de l’endomètre. Il pourrait aider à traiter les maladies chez les femmes, telles que l’endométriose, la perte de grossesse et le cancer.
