Dieses Protokoll ist von Bedeutung, da es eine Schritt-für-Schritt-Methodik zur Isolierung von hochreinem Uterusepithel aus der Gebärmutter der Maus für die Kultur von Endometrium-Organoiden zeigt. Diese Methode nutzt effizient die enzymatische und mechanische Dissoziation, um das Uterusepithel zu isolieren. Die Techniken wurden optimiert, um Endometriumepithel-Organoide aus dem isolierten Epithel zu etablieren, zu behandeln und zu analysieren.
Beginnen Sie mit dem Auftauen der Gelmatrix auf Eis für etwa ein bis zwei Stunden vor der Anwendung. Dann sezieren Sie die eingeschläferte Maus, indem Sie mit einer Schere einen Mittellinienschnitt am Bauch machen und die Haut vorsichtig zurückziehen, um die darunter liegende Peritonealschicht freizulegen. Lokalisieren Sie die Gebärmutterhörner, indem Sie die Bauchfettpolster vorsichtig zur Seite schieben und die Gebärmutterhörner an der Gebärmutterhalsverbindung halten, bevor Sie sie entlang des Mesenterialfetts schneiden.
Entfernen Sie nach der Dissektion der Gebärmutter der Maus mit einer kleinen Schere gründlich Fettgewebe aus dem Uterushorn. Sobald Sie fertig sind, schneiden Sie jedes Gebärmutterhorn in kleine Fragmente, die jeweils etwa vier bis fünf Millimeter groß sind. Legen Sie alle Uterusfragmente aus einer Gebärmutter in eine Vertiefung einer 24-Well-Platte, die 0,5 Milliliter 1% Trypsin enthält.
Inkubieren Sie dann die 24-Well-Platte in einem 37 Grad Celsius befeuchteten Gewebekultur-Inkubator für etwa eine Stunde, um das Endometriumepithel enzymatisch vom darunter liegenden Stroma zu trennen. Nach der Inkubation werden die Uterusfragmente auf eine 35-Millimeter-Gewebekulturplatte übertragen, die einen Milliliter der phosphatgepufferten Dulbecco-Lösung (DPBS) enthält. Als nächstes trennen Sie das Uterusepithel unter einem Dissektionsmikroskop von der Gebärmutterröhre, indem Sie ein Ende eines Uterusfragments mit der Pinzette halten und die Pipettenspitze vorsichtig in Längsrichtung über das Fragment führen, wobei das Epithel aus dem anderen Ende des Uterusrohrs gedrückt wird.
Beobachten Sie dann die vom Uterusfragment abgetrennten Epithelblätter unter dem Dissektionsmikroskop. Als nächstes überführen Sie alle Epithelschichten vorsichtig mit der Ein-Milliliter-Pipette in dasselbe 1,5-Milliliter-Röhrchen. Und pelletieren Sie die dissoziierten Epithelschichten durch Zentrifugation bei 375 x g für fünf Minuten.
Entfernen Sie den Überstand vorsichtig, ohne das Zellpellet zu stören, und resuspendieren Sie das Zellpellet in 0,5 Milliliter 2,5 Milligramm pro Milliliter Kollagenase plus zwei Milligramm pro Milliliter DNA-Lösung. Pipettieren Sie ca. 10 Mal auf und ab oder bis eine einzellige Suspension erreicht ist. Als nächstes fügen Sie 0,5 Milliliter DMEM F / 12 plus 10% fötales Rinderserum oder FBS plus Antibiotika hinzu und zentrifugieren Sie die Zellen für fünf Minuten bei 375 x g.
Entfernen Sie den Überstand, resuspendieren Sie die Zellen in einem Milliliter DMEM/F12 plus 10% FBS plus Antibiotika und zentrifugieren Sie die Zellen. Legen Sie die Gelmatrix auf Eis, bis sie fertig ist. Als nächstes entfernen Sie den Überstand aus den Zentrifugenzellen und resuspendieren Sie das Zellpellet mit dem 20-fachen Volumen der Gelmatrix, ohne die Blasen einzuführen.
Lassen Sie die Gelmatrix-Zellsuspension ca. 10 Minuten bei Raumtemperatur einwirken. Sobald die Gelmatrixzellsuspension zu einem halbfesten Gel wird, verwenden Sie eine P200-Mikropipette mit einer 200-Mikroliter-Spitze mit breitem Durchmesser und saugen Sie vorsichtig 25 Mikroliter der Gelmatrixzellsuspension ab. Dosieren Sie drei separate 25-Mikroliter-Kuppeln pro Vertiefung einer 12-Well-Platte und lassen Sie die Gelmatrix 15 Minuten lang aushärten und einen 37 Grad Celsius befeuchteten Gewebekultur-Inkubator.
Nachdem die Gelmatrix ausgehärtet ist, geben Sie 750 Mikroliter Organoidmedium in jede Vertiefung, die Gelmatrix-Kuppel enthält, und Inkubator bei 37 Grad Celsius in einen befeuchteten Gewebekultur-Inkubator. Phasenkontrastaufnahmen von Endometrium-Organoiden der Maus zeigten, dass die Trennung von Epithel- und Stromazellen Proben mit nicht mehr als 10% bis 15% Kontamination des entgegengesetzten Zelltyps ergab. Die Epithelzellen der Gebärmutterschleimhaut wurden innerhalb von drei bis vier Tagen zu Organoiden zusammengesetzt.
Die in Formalin fixierten, paraffineingebetteten Endometrium-Organoide wurden durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbungen sichtbar gemacht, die die einzelne Schicht aus Epithel und Hohlzentren, die Lumen der Organoide, zeigten. Die fluoreszenzmikroskopische Bildgebung zeigte, dass alle Zellen in den Organoiden Cytokeratin-8-positiv waren und DAPI enthielten, was darauf hindeutet, dass die Fixierung, Einbettung und Verarbeitung der Endometrium-Organoide mit der Antikörper-basierten Immunfärbung kompatibel ist. Die quantitative Echtzeit-PCR zeigte, dass die Stimulation mit 10 nanomolaren Östradiolen die Expression von Lipocalin 2, Lactoferrin und Progesteronrezeptor in den epithelialen Organoiden erhöhte, was darauf hindeutet, dass Endometriumepithel-Organoide erfolgreich verwendet werden können, um die Genexpressionsänderungen als Reaktion auf Östradiol zu messen.
Es ist wichtig sicherzustellen, dass während des mechanischen Dissoziationsschritts eine klare Trennung des Endometriumepithels erreicht wird. Man sollte in der Lage sein, Epithel zu beobachten, das aus der Eileiter austritt. Andere Methoden umfassen die Etablierung der epithelialen Organoide durch Verkapselung in eine Gelmatrix.
Falls gewünscht, kann das Stromakompartiment weiter verdaut werden, um 3D-epitheliale Stroma-Kokulturen zu erzeugen. Die Methode kann helfen, Fragen zu den Signalen zu beantworten, die die Erneuerung der Gebärmutterschleimhaut steuern. Es könnte helfen, Krankheiten bei Frauen wie Endometriose, Schwangerschaftsverlust und Krebs zu behandeln.
