Ce protocole permet de quantifier les niveaux et la dynamique de méthylation de l’arginine. Cette modification joue un rôle régulateur important et pourrait servir de biomarqueur de la maladie. L’avantage de cette méthode est qu’elle fournit un flux de travail simple pour un nombre presque illimité de matrices allant des cellules, des milieux aux tissus et aux biofluides.
La méthylation de l’arginine est élevée dans de nombreux cancers humains et les premiers inhibiteurs de la méthode arginine transférases sont testés dans des essais cliniques. Cette méthode pourrait aider à la stratification des patients et à l’évaluation des risques. Hansjorg Habisch, un technicien de recherche de mon laboratoire, fera la démonstration de la procédure.
Pour les échantillons liquides, ajouter 400 microlitres de méthanol glacé à 200 microlitres de l’échantillon, puis incuber pendant 30 minutes à moins 20 degrés Celsius. Centrifuger cet échantillon à 10 000 G pendant 30 minutes à quatre degrés Celsius. Déplacez le surnageant et recueillez la pastille dans des tubes de 1,5 millilitre.
Pour les matériaux solides, ajoutez 600 microlitres d’eau à 66 % de méthanol dans des tubes de réduction en pâte contenant 30 à 60 milligrammes de granulés de tissus ou de cellules. Homogénéiser les tissus mous une fois pendant 20 secondes et les tissus rigides deux fois pendant 20 secondes avec un intervalle de cinq minutes entre les deux. Placez immédiatement l’échantillon sur de la glace et transférez tout le lysat dans un nouveau tube de 1,5 millilitre, suivi d’une incubation.
Ensuite, centrifuger l’échantillon à 10 000 G pendant 30 minutes. À quatre degrés Celsius, sélectionnez le surnageant dans des tubes de 1,5 millilitre et procédez à l’hydrolyse des protéines à l’aide de ce surnageant. Tronquez les bouchons de chaque tube.
Ajoutez ensuite 500 microlitres d’acide chlorhydrique molaire neuf molaires à chaque échantillon. Enfin, mettez les tubes dans des tubes en verre. Fermez-les hermétiquement avec des bouchons, en veillant à une bonne étanchéité, et placez ces tubes dans un bécher en verre partiellement rempli de sable.
Hydrolyser les échantillons pendant 16 heures à 110 degrés Celsius dans une chambre de séchage. Refroidir les échantillons et les lyophiliser pendant la nuit à l’aide d’une centrifugeuse à vide poussé. Le lendemain, dissoudre les granulés complètement séchés dans un millilitre d’acide chlorhydrique 0,1 molaire.
Ajouter 50 microlitres de chloroforme à chaque tube et dissoudre complètement la pastille à l’aide d’une pipette de 1 000 microlitres. Transférer le volume complet dans un nouveau tube et centrifuger les échantillons pendant 10 minutes. Recueillir soigneusement la phase supérieure du liquide biphasique dans un nouveau tube.
Utilisez des tubes en plastique pour les tubes manuels ou en verre pour l’extraction robotique en phase solide. Pour l’extraction manuelle en phase solide, préconditionnez les cartouches à chaque passage, puis une centrifugation d’une minute. Ensuite, chargez l’échantillon sur des cartouches SPE et centrifugez-les à 600 G pendant deux minutes à température ambiante.
Lavez les cartouches avec un millilitre d’eau trois fois, chaque lavage suivi d’une centrifugation pendant une minute. Laver ensuite cinq fois avec un millilitre d’acide chlorhydrique 0,1 molaire, puis par centrifugation pendant une minute à 800 G à température ambiante. Lavez les cartouches deux fois avec un millilitre de méthanol suivi d’une centrifugation pendant une minute.
Éluter l’arginine et ses dérivés dans un seul tube de 15 millilitres en ajoutant un millilitre de trois solutions de remplacement X et centrifuger deux fois pendant une minute. Pour l’extraction robotisée en phase solide, placez les tubes pour la collecte des éluats et les tubes de verre contenant la phase supérieure du liquide biphasique dans la position respective du robot. Utilisez une application ou une méthode dans le logiciel en fonction des étapes décrites pour SPE manuel.
Lyophiliser les échantillons pendant la nuit pour les sécher complètement afin de se débarrasser de l’ammoniac et de l’eau. Dissoudre chaque échantillon dans 500 microlitres de tampon RMN jusqu’à ce qu’il devienne homogène. Ensuite, transférez une quantité égale d’échantillon homogène dans chaque tube RMN.
Les spectres J-RES des hydrolysats de protéines de levure purifiés à l’aide du protocole SPE sont présentés ici. Différents changements chimiques caractéristiques peuvent discriminer la L-arginine et l’ADMA à 3,25 et 3,02 parties par million. Les deux substances peuvent être séparées et quantifiées dans une matrice cellulaire.
Sur la base du nombre de protons du groupe méthyle ou méthylène spécifique au décalage chimique respectif, une spectroscopie de résonance magnétique nucléaire H permet une quantification précise. En utilisant cette approche, les décalages chimiques par résonance magnétique nucléaire d’un H de la SDMA et du MMA peuvent être séparés et quantifiés par des décalages chimiques caractéristiques à 2,76 parties par million de SDMA et 2,74 parties par million de MMA. Lors de l’exécution de ce protocole, prélever soigneusement la phase supérieure du liquide biphasique contenant la fraction soluble dans l’eau avec une pipette et la transférer dans de nouveaux tubes.
Utilisez des tubes de 1,5 millilitre pour le SPE manuel ou du verre de classe pour le SPE robotisé. Éviter de renverser du chloroforme et de son contenu. Les éluats contenant de l’arginine et les espèces d’arginine méthylée sont analysés par spectroscopie RMN.
Cela donne des quantités absolues de ces espèces. Notre technologie est actuellement utilisée dans une pléthore de projets de recherche fondamentale visant à disséquer le rôle physiopathologique de la méthylation de l’arginine. De plus, nous évaluons la méthylation de la protéine arginine comme candidat biomarqueur dans plusieurs maladies humaines.
