هذا البروتوكول يجعل من الممكن تحديد مستويات وديناميات مثيلة أرجينين. يلعب هذا التعديل أدوارا تنظيمية مهمة ويمكن أن يكون بمثابة مؤشر حيوي للمرض. ميزة هذه الطريقة هي أنها توفر سير عمل بسيط لعدد غير محدود تقريبا من المصفوفات التي تتراوح من الخلايا والوسائط إلى الأنسجة والسوائل الحيوية.
مثيلة أرجينين مرتفعة في العديد من السرطانات البشرية ويتم اختبار المثبطات الأولى لطريقة أرجينين ترانسفيراز في التجارب السريرية. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في التقسيم الطبقي للمرضى وتقييم المخاطر. سيوضح الإجراء هانسجورج هابيش ، فني أبحاث من مختبري.
بالنسبة للعينات السائلة ، أضف 400 ميكرولتر من الميثانول البارد المثلج إلى 200 ميكرولتر من العينة متبوعة بالحضانة لمدة 30 دقيقة عند 20 درجة مئوية تحت الصفر. جهاز طرد مركزي لهذه العينة عند 10،000 G لمدة 30 دقيقة عند أربع درجات مئوية. حرك المادة الطافية واجمع الحبيبات في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر.
بالنسبة للمواد الصلبة ، أضف 600 ميكرولتر من ماء الميثانول بنسبة 66٪ إلى أنابيب اللب التي تحتوي على 30 إلى 60 ملليغرام من الأنسجة أو كريات الخلايا. تجانس الأنسجة الرخوة مرة واحدة لمدة 20 ثانية والأنسجة المتيبسة مرتين لمدة 20 ثانية مع فاصل زمني مدته خمس دقائق بينهما. ضع العينة على الفور على الثلج وانقل كل المحللة إلى أنبوب جديد سعة 1.5 ملليلتر ، متبوعا بالحضانة.
ثم ، الطرد المركزي العينة في 10،000 غرام لمدة 30 دقيقة. عند أربع درجات مئوية ، حدد المادة الطافية في أنابيب سعة 1.5 ملليلتر وتابع التحلل المائي للبروتين باستخدام هذا الطاف. اقتطاع أغطية كل أنبوب.
ثم أضف 500 ميكرولتر من تسعة حمض الهيدروكلوريك المولي إلى كل عينة. أخيرا ، ضع الأنابيب في أنابيب زجاجية. أغلقها بأغطية بإحكام ، مع ضمان الختم المناسب ، وضع هذه الأنابيب في دورق زجاجي مملوء جزئيا بالرمل.
تحلل العينات لمدة 16 ساعة عند 110 درجة مئوية في غرفة التجفيف. تبريد العينات وتجفيفها بالتجميد بين عشية وضحاها باستخدام جهاز طرد مركزي عالي الفراغ. في اليوم التالي ، قم بإذابة الكريات المجففة تماما في ملليلتر واحد من 0.1 مولار حمض الهيدروكلوريك.
أضف 50 ميكرولتر من الكلوروفورم إلى كل أنبوب وقم بإذابة الحبيبات تماما باستخدام ماصة 1،000 ميكرولتر. نقل الحجم الكامل إلى أنبوب جديد والطرد المركزي العينات لمدة 10 دقائق. اجمع بعناية المرحلة العليا من السائل ثنائي الطور في أنبوب جديد.
استخدم الأنابيب البلاستيكية للأنابيب اليدوية أو الزجاجية لاستخراج الطور الصلب الروبوتي. لاستخراج الطور الصلب اليدوي ، قم بتهيئة الخراطيش مسبقا في كل تشغيل متبوعا بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة. بعد ذلك ، قم بتحميل العينة على خراطيش SPE وطرد مركزي لها عند 600 جم لمدة دقيقتين في درجة حرارة الغرفة.
اغسل الخراطيش بملليلتر واحد من الماء ثلاث مرات ، كل غسلة متبوعة بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة. ثم يغسل خمس مرات مع ملليلتر واحد من 0.1 المولي حمض الهيدروكلوريك ، تليها الطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة في 800 غرام في درجة حرارة الغرفة. اغسل الخراطيش مرتين بملليلتر واحد من الميثانول متبوعا بالطرد المركزي لمدة دقيقة واحدة.
قم بتخفيف الأرجينين ومشتقاته في أنبوب واحد سعة 15 ملليلتر بإضافة ملليلتر واحد من محلول استبدال ثلاثة X وأجهزة طرد مركزي مرتين لمدة دقيقة واحدة. لاستخراج الطور الصلب الروبوتي ، ضع أنابيب لجمع الشطف والأنابيب الزجاجية التي تحتوي على المرحلة العليا من السائل ثنائي الطور في الموضع المعني للروبوت. استخدم تطبيقا أو أسلوبا في البرنامج استنادا إلى الخطوات الموضحة ل SPE اليدوي.
تجفيف العينات بالتجميد طوال الليل حتى تجف تماما للتخلص من الأمونيا والماء. قم بإذابة كل عينة في 500 ميكرولتر من المخزن المؤقت للرنين المغناطيسي النووي حتى تصبح متجانسة. ثم انقل كمية متساوية من العينة المتجانسة إلى كل أنبوب NMR.
أطياف J-RES لتحلل بروتين الخميرة المنقى باستخدام بروتوكول SPE موضحة هنا. يمكن أن تميز التحولات الكيميائية المميزة المختلفة L-arginine و ADMA عند 3.25 و 3.02 جزء في المليون. يمكن فصل كلتا المادتين وقياسهما في مصفوفة خلوية.
استنادا إلى عدد البروتونات من مجموعة الميثيل أو الميثيلين المحددة عند التحول الكيميائي المعني ، يسمح التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي H بالقياس الكمي الدقيق. باستخدام هذا النهج ، يمكن فصل التحولات الكيميائية بالرنين المغناطيسي النووي H ل SDMA و MMA وقياسها كميا من خلال التحولات الكيميائية المميزة عند 2.76 جزء في المليون SDMA و 2.74 جزء في المليون MMA. عند تنفيذ هذا البروتوكول ، اجمع بعناية المرحلة العليا من السائل ثنائي الطور الذي يحتوي على الجزء القابل للذوبان في الماء باستخدام ماصة وانقله إلى أنابيب جديدة.
استخدم أنابيب 1.5 ملليلتر ل SPE اليدوي أو زجاج فئة SPE الروبوتية. تجنب انسكاب الكلوروفورم ومحتوياته. يتم تحليل الشطف الذي يحتوي على أرجينين وأنواع أرجينين الميثيلي باستخدام التحليل الطيفي بالرنين المغناطيسي النووي.
هذا ينتج كميات مطلقة من هذه الأنواع. تستخدم تقنيتنا حاليا في عدد كبير من المشاريع البحثية الأساسية التي تهدف إلى تشريح الدور الفيزيولوجي المرضي لمثيلة الأرجينين. علاوة على ذلك ، نقوم بتقييم مثيلة بروتين أرجينين كمؤشر حيوي مرشح في العديد من الأمراض البشرية.
