Les fonctions des protéines dépendent de la température et sont optimales à la température. Ce protocole fournit un moyen de résoudre les structures protéiques à des températures plus élevées. Cette approche peut fournir des structures fonctionnellement pertinentes et améliorer la compréhension de la dépendance à la température des structures protéiques.
Yuan-Chih Chang, directeur de l’installation Academia Sinica Cryo EM, fera la démonstration de la procédure. Commencez par faire un trou d’un centimètre dans un tube centrifuge de 50 millimètres à son extrémité fermée. Placez le tube dans la chambre de l’appareil de vitrification à la sortie d’eau à ultrasons.
Réglez la température de l’appareil de vitrification à la température spécifiée et laissez la chambre de l’appareil de vitrification atteindre 55 degrés Celsius et 100% d’humidité relative. Laissez reposer pendant au moins une demi-heure pour stabiliser les conditions avant de commencer l’expérience. Placez le bain-marie sur une plaque chauffante et réglez la plaque chauffante à la température désirée.
Vérifiez avec un thermomètre pour vous assurer que l’eau atteint 55 degrés Celsius. Incuber l’échantillon au bain-marie et préchauffer l’embout de la pipette sur le bord de la plaque chauffante pendant deux minutes ou plus avant l’expérience de buvardage. Décharge luminescente une grille supportée par du carbone troué à 25 milliampères pendant 30 secondes.
Placez le papier filtre de vitrification dans la chambre de l’appareil de vitrification au plus tôt cinq minutes avant l’expérience de buvardage. Incuber la pince à épiler avec la grille dans l’appareil de vitrification pendant deux minutes ou plus. Construisez le récipient d’éthane avec de l’éthane selon les procédures standard, en veillant à ce que l’éthane ne déborde pas.
Utilisez une pipette pour appliquer sept à neuf microlitres de l’échantillon sur la grille. Ensuite, attendez une à deux secondes, épongez pendant une à une seconde et demie et plongez rapidement l’échantillon dans de l’éthane liquide. Transférer la grille de l’éthane liquide à la boîte cryogénique stockée dans de l’azote liquide.
Coupez les grilles et déchargez-les pour acquérir un microscope électronique ou un instrument Cryo EM. Utilisez l’écran d’affichage de l’instrument Cryo EM et la fonction de faible dose du logiciel pour examiner l’état de la glace sur la grille et la distribution de l’échantillon sur la grille. Si la qualité de la grille résultante n’est pas bonne, répétez le processus de préparation de la grille avec des conditions variées telles que le temps d’attente, le temps de buvardage, etc.
Si la qualité de la grille résultante est bonne, répétez les mêmes étapes pour créer des grilles à une température différente. Transférez les grilles de bonne qualité sur un instrument Cryo EM haute résolution. Effectuer la collecte et l’analyse des données selon les procédures établies.
Dans le cas de la grille réussie, un gradient de glace s’est formé avec de la glace plus épaisse en haut à gauche de la grille et de la glace plus mince en bas à droite. Des cases bleues et vertes convenant à la collecte de données ont été observées dans la grille de réussite. Un contraste lumineux a été observé dans l’autre grille.
Indiquant une fine couche de glace ou une absence de glace. Seuls deux carrés se sont révélés appropriés pour la collecte de données dans la deuxième grille. L’une des grilles était constituée de glace principalement sous forme cristalline, ce qui ne convenait pas à la collecte de données.
D’autre part, l’autre grille a montré que la couche de glace était principalement dans un état amorphe adapté à la collecte de données. La préparation du conteneur et d’autres doivent être terminées en fonction d’un point de temps. Le contrôle du temps et la finition rapide et précise de l’expérience sont les plus importants.
Selon les résultats obtenus à l’aide de ce protocole, le chercheur devra peut-être être plus prudent dans la mise en place des conditions simples.
