冷冻电镜高温样品网格的制备

蛋白质的功能是温度依赖性的，并且在温度下是最佳的。该协议提供了一种在较高温度下解决蛋白质结构的方法。这种方法可以提供功能相关的结构，并增强对蛋白质结构温度依赖性的理解。

演示该程序的将是中央研究院冷冻电镜设施经理张元志。首先在其封闭端的 50 毫米离心管上打一个 1 厘米的孔。将管子放在超声波出水口的玻璃化装置室中。

将玻璃化装置温度设置为指定温度，并允许玻璃化装置室达到55摄氏度和100%相对湿度。在开始实验之前，让它静置至少半小时以稳定条件。将水浴放在热板上，并将热板设置为所需温度。

用温度计检查以确保水达到55摄氏度。在水浴中孵育样品，并在印迹实验之前将移液器吸头在热板边缘预热两分钟或更长时间。辉光以 25 毫安的电流将多孔碳支撑的网格放电 30 秒。

在印迹实验前不早于五分钟将玻璃化滤纸放入玻璃化装置室中。将镊子与玻璃化装置中的网格一起孵育两分钟或更长时间。按照标准程序用乙烷构建乙烷容器，确保乙烷不会溢出。

使用移液器将 7 到 9 微升的样品涂在网格上。然后等待一到两秒钟，吸干一到一秒半，然后迅速将样品浸入液态乙烷中。将网格从液态乙烷转移到储存在液氮中的冷冻盒中。

夹住网格并卸载它们以获取电子显微镜或冷冻电镜仪器。使用冷冻电镜仪器的显示屏和软件的低剂量功能，在网格上筛选冰况和样品在网格上的分布。如果所得网格的质量不好，请在等待时间、印迹时间等各种条件下重复网格准备过程。

如果生成的网格质量良好，请重复相同的步骤以在不同的温度下制作网格。将高质量的网格转移到高分辨率冷冻电镜仪器上。根据既定程序执行数据收集和数据分析。

在成功网格的情况下，形成冰梯度，网格左上角的冰较厚，右下角的冰较薄。在成功的网格中观察到适合数据收集的蓝色和绿色框。在另一个网格中观察到了明亮的对比。

表示薄薄的一层，冰或没有冰。在第二个网格中，只有两个方块适合数据收集。其中一个网格由冰组成，主要以晶体形式组成，不适合数据收集。

另一方面，另一个网格显示冰层大多处于适合数据收集的无定形状态。作为容器和其他容器的准备工作需要根据时间点完成。时间控制和快速准确地完成实验是最重要的。

根据使用该协议获得的结果，研究人员在设置简单条件时可能必须更加小心。