Les approches protéomiques ciblées deviennent rapidement la méthode de choix pour la validation des protéines à partir d’expériences protéomiques à court terme ou d’expériences basées sur la biologie moléculaire. La surveillance des réactions multiples est l’une de ces approches ciblées qui est de plus en plus utilisée pour détecter et quantifier les protéines à partir d’échantillons biologiques. Dans cette étude, nous avons parcouru les différentes étapes impliquées dans la détection et la quantification des protéines du tissu cérébral humain dans le but d’initier les lecteurs aux exigences de base d’une expérience MRM.
Peser environ 50 mg de tissu cérébral et laver le tissu avec 300 microlitres de 1x solution saline tamponnée au phosphate. Cette étape est effectuée pour éliminer tout sang sur la surface externe du tissu, et il est donc conseillé d’enlever autant de sang que possible. Après les lavages avec PBS, ajoutez 300 microlitres de tampon de lyse au tube contenant le tissu.
Lysez le tissu à l’aide d’un sondeur à sonde tout en gardant le tube sur un bain de glace. Poursuivez l’homogénéisation des tissus à l’aide d’un batteur de billes pour lyser complètement le tissu. Centrifuger le contenu du tube à 6000 g pendant 15 minutes à quatre degrés centigrades.
Transférer le surnageant dans un tube frais et mélanger de manière homogène. Prenez une petite aliquote du surnageant et quantifiez la teneur en protéines à l’aide d’un test protéique standard. Nous montrons ici un exemple d’estimation des protéines à l’aide du test de Bradford.
Prendre 50 microgrammes de protéines dans un tube de microcentrifugation et réduire le contenu en ajoutant du TCEP de telle sorte que la concentration finale soit de 20 millimolaires. Incuber le contenu à 37 degrés pendant une heure. Après l’incubation, alkyler les protéines réduites en ajoutant de l’iodoacétamide au tube, de sorte que la concentration finale soit de 40 millimolaires.
Incuber le tube dans l’obscurité pendant 30 minutes. Maintenant, ajoutez le tampon B au tube contenant les protéines réduites et alkylées de sorte que la concentration finale d’urée soit inférieure à une molaire. Ajouter la trypsine dans 1 comme à 30 rapport enzyme-protéine et incuber les tubes pendant la nuit à 37 degrés avec un tremblement constant.
Après la digestion, concentrez les peptides digérés dans un concentrateur sous vide. À cette étape, les peptides peuvent être reconstitués et dessalés ou stockés à moins 80 pour une utilisation future. Le dessalement, ou nettoyage peptidique, est essentiel avant de charger les échantillons sur tout LC-MS MS. Les sels et autres contaminants présents dans l’échantillon peuvent obstruer la colonne et affecter la sensibilité de l’instrument à long terme.
Ce processus peut être effectué à l’aide de pointes ou de colonnes C18 STAGE disponibles dans le commerce. Ici, nous avons décrit le flux de travail pour le dessalement des peptides à l’aide d’une pointe C18 STAGE. Après le dessalement, sécher les peptides dans un concentrateur sous vide.
Reconstituer ces peptides propres et procéder à la quantification à l’aide de la méthode Scopes. Pour cela, chargez deux microlitres de l’échantillon dans une plaque de microgoutte et calculez la concentration comme indiqué dans la diapositive. La préparation de la liste de transition est une étape cruciale dans une expérience SRM ou MRM.
Une liste de transition contient toutes les informations requises par le spectromètre de masse pour surveiller la transition. Cela inclut les valeurs m par z des ions précurseurs et produits, l’énergie de collision de la transition, la polarité de l’instrument et la plage de temps pour l’acquisition des données. Préparez la liste de transition à l’aide de Skyline.
Préparez un protéome d’arrière-plan à l’aide du fichier Human Proteome Fasta d’UniProt et assurez-vous qu’il est sélectionné sous l’onglet Arrière-plan de Paramètres du peptide. Dans l’onglet Filtre, définissez une longueur minimale de 8 et une longueur maximale de 25. Continuez à utiliser les paramètres par défaut s’il n’y a pas d’autres modifications dans les peptides.
Une fois les paramètres peptidiques effectués, cliquez sur Paramètres de transition. Sous l’onglet Filtre, définissez les charges de précurseur sur 2 et 3. Définissez les charges d’ions sur 1 et définissez les types d’ions sur y.
Les ions de produit peuvent être sélectionnés en fonction du choix de l’utilisateur. Laissez tous les paramètres par défaut. Insérez maintenant les ID d’accession des protéines cibles sélectionnées.
Cela peut être fait en cliquant sur l’onglet Modifier, puis en sélectionnant Insérer et enfin en collant les D’accession. Les IDs seront mappés aux protéines du protéome de fond et une liste de transition sera créée en fonction du peptide et des paramètres de transition définis précédemment. Exportez cette liste de transition.
Assurez-vous que le bon instrument est sélectionné en cliquant sur l’option déroulante Type d’instrument. Dans ce cas, l’instrument est Thermo Altis. Étant donné que la liste de transitions non définie comporte trop de transitions, conservez une limite de seulement 350 transitions par liste et exportez-la en tant que méthodes multiples.
Un système de solvant binaire est utilisé. Le solvant A est de 1 % FA et le solvant B est de 80 % ACN. Maintenez le débit à 450 microlitres par minute et le gradient comme indiqué.
Réglez la température du compartiment de la colonne à 45 degrés Celsius. Pour plus de détails sur la colonne et le système LC, reportez-vous au texte. Assurez-vous que les paramètres MS de votre TSQ Altis sont comme indiqué ici.
Importez une liste de transition unique pour créer une nouvelle méthode. Nous suggérons de garder la résolution pour quadrupole 1 et quadrupole 3 à 7. Ceux-ci peuvent être optimisés si nécessaire.
Pour garantir la cohérence des exécutions et, par conséquent, la qualité des données, préparez votre séquence d’exécution comme indiqué. Commencez par quelques ébauches, référez-vous au texte pour la composition du mélange à blanc, suivi d’une lumière standard QC BSA de concentration connue pour surveiller toute variation de la réponse journalaire de l’instrument. Le QC effectué doit être juste avant les échantillons.
Ensuite, alignez tous les échantillons avec des blancs entre les deux. Injecter des volumes égaux de chaque échantillon, représentant 25 à 1 nanogramme de peptides par injection. Pour créer une méthode affinée, exécutez d’abord les méthodes non définies sur des échantillons entiers.
Importez les résultats dans Skyline et vérifiez manuellement chaque peptide. Pour chaque peptide, sélectionnez un précurseur montrant des pics toujours bons dans tous les échantillons. Supprimer les précurseurs et les peptides qui ne présentent pas de bons pics.
Assurez-vous que tous les pics sont annotés correctement. Pour sélectionner le bon pic et affiner davantage les transitions sous chaque précurseur, une bibliothèque peut être utilisée. Une bibliothèque est un ensemble de données spectrales MS-MS appariées avec des peptides et des transitions des données expérimentales actuelles.
Choisissez les pics dont les valeurs DART P sont plus proches de 1 et supprimez les transitions qui ne correspondent pas à la bibliothèque. Une valeur DART P indique la qualité de la correspondance entre le pic expérimental et le pic de bibliothèque. Après un ou deux tours d’optimisation, une liste affinée sera prête.
Cette liste affinée peut être exécutée pour des échantillons individuels. Importez les pistes raffinées dans Skyline et annotez correctement les pics. Utilisez l’onglet Annotation sous Paramètres du document pour annoter soigneusement chaque échantillon de la grille du document.
Utilisez la fonction de comparaison de groupes pour créer des comparaisons entre la condition 1 et la condition 2 de votre expérience. Cela donnera un tableau avec des valeurs P ajustées et des valeurs de changement de pliage entre les deux groupes. À notre connaissance, il s’agit de la première étude utilisant l’utilisation de la MRM pour détecter des peptides pour les protéines Apolipoprotéine A-1, Vimentine et Nicotinamide phosphoribosyltransférase dans des échantillons de tissus cérébraux humains.
L’optimisation de divers paramètres tels que le gradient LC, le temps de séjour, le temps de cycle et l’énergie de collision peut grandement influencer le succès d’une expérience MRM. Nous croyons que cette technique peut être utilisée pour développer des modèles de biomarqueurs capables de distinguer entre différentes conditions cliniques et maladies.
