Notre protocole utilise des sondes fluorophores régulières et des techniques simples de préparation d’échantillons qui maintiennent la cellule imbrique dans un état physiologique pour étudier le processus cellulaire hautement dynamique et les structures subcellulaires détaillées. Cette technique nous permet d’étudier les processus cellulaires à une super résolution et dans des conditions physiologiques pendant une période prolongée sans sacrifier la résolution spéciale ou temporaire. Commencez par couper une membrane de dialyse de coupure de poids moléculaire de 12 à 14 kilodaltons en petits morceaux et trempez les morceaux avec 100 microlitres de milieu cellulaire vivant pendant environ cinq minutes.
Pendant que les membranes trempent, coupez l’anneau extérieur d’un tube de 50 millilitres en petits morceaux et stérilisez les morceaux dans de l’éthanol à 70%. Pour la dissection et le montage des testicules, transférer dix mouches mâles anesthésiées âgées de deux à trois jours dans une parabole de dissection sous un microscope de dissection et utiliser une pince fine pour enlever les testicules. Lorsque tous les testicules ont été collectés, lavez les testicules deux fois dans un milieu cellulaire vivant et utilisez une pointe de pipette pour étaler 100 à 150 microlitres de milieu cellulaire vivant sur le fond de verre préparé.
Utilisez une pince fine pour transférer les testicules volants au centre de la parabole et enlevez tous les microlitres du milieu sauf environ 10. Rapidement, placez la membrane pré-humide sur les testicules et placez deux à trois petits poids en plastique sur la membrane. Immédiatement, ajoutez 100 à 150 microlitres de milieu cellulaire vivant frais et replacez l’anneau sur le côté élevé du plat.
Replacez le couvercle sur l’anneau et faire pivoter un morceau de papier de soie dans de l’eau avant de placer le papier sur le bordereau de couverture. Ensuite, couvrez le plat avec un couvercle et fixez le plat sur la scène d’un microscope à super résolution. Pour l’imagerie des cellules souches germinales, ouvrez le logiciel d’imagerie et allumez la lumière transmise.
Utilisez l’objectif 63X pour vous concentrer sur le tissu des testicules et allumez les lasers. Cliquez sur Live"pour localiser les cellules souches germinales. Ajustez le focus et cliquez sur Taille de l’image « pour définir la taille de l’image entre 512 par 512 et 1024 par 1024 pixels, et Moyenne"pour définir la moyenne de l’image sur un ou deux.
Cliquez sur Master Gain « pour définir le gain de multiplication des électrons à moins de 800, et Lasers"pour régler la puissance laser sur 1% à 2%Zoom sur la région ou la cellule d’intérêt pour réduire le temps d’acquisition de l’image et réduire le blanchiment de la photo, et confirmez que l’image a été configurée de manière optimale avant de cliquer sur Démarrer l’expérience"pour démarrer la capture d’image time lapse. Si Airyscan Acquisition n’est pas configuré de manière optimale, cliquez sur Optimal dans les sections taille de trame, Z-Stack et Scan Area, et optimisez l’intervalle de temps, le nombre de tranches Z et la durée de l’imagerie time-lapse, en fonction de la conception expérimentale et du type d’échantillon. Après l’imagerie, sélectionnez Traitement, Traitement par lots et Traitement Airyscan, puis sélectionnez les images à traiter.
Cliquez ensuite sur Exécuter le processus"pour obtenir les images de super résolution. L’imagerie cellulaire en direct des testicules de drosophile exprimant l’alpha-tubuline GFP dans les cellules germinales de stade précoce à l’aide d’un microscope confocal à disque tournant, permet la visualisation de l’intensité asymétrique des signaux GFP à deux centrosomes, comme un signal plus lumineux au centrosome mère et un signal relativement plus faible aux centrosomes filles. La différence de luminosité est probablement reflétée par l’asymétrie temporelle de la nucléation des microtubules, mais la morphologie détaillée et la quantité des microtubules ne peuvent pas être résolues à l’aide de la microscopie confocale à disque tournant.
En revanche, l’imagerie à super résolution de cellules vivantes permet la visualisation et la quantification de la morphologie et du nombre de microtubules. Cette résolution améliorée révèle également des modèles de nucléation asymétrique des microtubules, d’allongement et d’interaction accrue avec la membrane nucléaire. L’imagerie des cellules vivantes permet également la visualisation de l’invagination asymétrique de la membrane nucléaire, mais pas des microtubules individuels qui pénètrent directement dans le noyau.
En revanche, cette technique de super résolution de cellules vivantes permet l’observation directe de ces événements par imagerie simultanée des microtubules et de la lame nucléaire. Pendant la métaphase, les deux centromères frères peuvent être détectés comme un seul signal utilisant la microscopie de disque tournant, bien que la fixation centrale de microtubule ne puisse pas être observée. En revanche, l’imagerie en direct de super résolution permet la visualisation de l’attachement du centromère des microtubules dans la prophase précoce.
Assurez-vous de placer une membrane sur les testicules pour vous assurer qu’ils ne bougent pas ou ne flottent pas pendant l’imagerie et pour optimiser les réglages du microscope pour éviter le blanchiment photographique et la phototoxicité. Il existe de nombreuses façons d’appliquer cette méthode, par exemple pour étudier la dynamique des protéines, le stress linéaire ou les défenses et processus cellulaires.
