亚细胞结构的超分辨率活细胞成像

我们的协议使用定期荧光探针和简单的标本制备技术，在生理条件下维持成像细胞，以研究高动态细胞过程和详细的亚细胞结构。这项技术使我们能够在超分辨率和生理条件下长期研究细胞过程，而不会牺牲特殊或临时分辨率。首先将12至14千达尔顿分子重量的截断透析膜切成小块，用100微升活细胞介质浸泡约5分钟。

当膜浸泡时，将50毫升管的外环切成小块，用70%乙醇对碎片进行消毒。对于睾丸解剖和安装，将十只两到三天的麻醉雄性苍蝇转移到解剖显微镜下的解剖盘中，并使用细钳切除睾丸。收集完所有睾片后，在活细胞介质中清洗睾试两次，并使用移液器尖端将 100 到 150 微升活细胞介质扩散到准备好的玻璃底盘中。

使用细钳将苍蝇睾片转移到盘的中心，并去除所有，但约10微升的介质。快速将预湿膜放在睾片上，并将两到三个小塑料重量放在膜上。立即加入100至150微升的新鲜活细胞介质，并将环放回盘子的高架侧。

将盖子滑回环上，将一块纸巾旋转到水中，然后将纸放在盖子上。然后，用盖子盖住盘子，将盘子固定在超分辨率显微镜的舞台上。对于生殖系干细胞成像，打开成像软件并打开传输的光。

使用 63X 目标聚焦睾片组织并打开激光。点击"活"找到老年干细胞。调整对焦并单击帧大小"，将帧大小设置为 512 乘 512 和 1024 到 1024 像素之间，并平均"将帧平均设置为一到两个。

单击"主增益"将电子乘法增益设置为小于 800，将激光功率设置为 1% 到 2% 放大到感兴趣的区域或单元格，以减少图像采集时间并减少照片漂白，并在单击"开始实验"之前确认图像已优化配置"，以启动延时图像捕获。如果 Airyscan 采集没有以最佳方式配置"显示"，请单击帧大小、Z 堆栈和扫描区域"部分中的"最佳"，并根据标本的实验设计和类型优化 Z 切片的时间间隔、Z 切片数量和延时成像的持续时间。成像后，选择处理、批次和 Airyscan 处理，并选择要处理的图像。

然后单击"运行过程"以获取超分辨率图像。使用旋转的圆盘共聚焦显微镜在早期生殖细胞中表达α tubulin GFP 的果蝇的活细胞成像，使两个中心体的 GFP 信号的不对称强度可视化，作为母体中心体的较亮信号和在女儿中心体的相对较弱的信号。亮度的差异可能反映在微管核的时间不对称上，但微管的详细形态和数量无法通过旋转盘共聚焦显微镜解决。

相比之下，活细胞超分辨率成像允许显化和量化微管形态和数字。这种改进的分辨率还揭示了不对称微管核化、拉长和与核膜相互作用增加的模式。活细胞成像还允许不对称核膜的可视化，但不允许直接进入核体的单个微管可视化。

相比之下，这种活细胞超分辨率技术允许通过同时成像微管和核拉米纳来直接观察这些事件。在元相期间，使用旋转盘显微镜可以检测到两个姐妹中心为一个信号，但无法观察到微管中央附件。相比之下，超分辨率实时成像允许在早期前相中可视化微管中心附件。

请务必在睾片上放置膜，以确保它们在成像过程中不会移动或漂浮，并优化显微镜设置以避免照片漂白和照片毒性。有许多方法可以应用，例如研究蛋白质动力学、线性应力或细胞防御和过程。