Cette méthode facilite la caractérisation efficace des méthodes de kinase de RAF liées à la maladie. Cette technique est très sensible et reproductible, rentable, conviviale, et ne nécessite aucun équipement de pointe. Pour mesurer l’activité catalytique des mutants de la RAF, introduisez des mutations technologiques du drapeau dans la séquence de codage de la RAF par PCR, avant d’insérer des séquences entières dans le vecteur approprié selon les protocoles standard.
Insérez le glutathion comme séquence de codage transferase en amont des séquences de codage mutant de la RAF, pour générer des vecteurs codant le glutathion comme mutants de la RAF fusionnés transferase, de la même manière. Transvect 80% à 90% confluent 293T cultures cellulaires avec les vecteurs codant le drapeau marqué KINASEs RAF ou leurs mutants, selon les protocoles de normes. Après 24 heures de culture, remplacez le médium dans chaque culture.
Après 48 heures de culture, ajouter 400 microlitres de tampon de lyse complétés par des inhibiteurs de la protéase et de la phosphatase, à chaque puits sur la glace. Après cinq à dix minutes, transférer la cellule lysates dans un tube de 1,5 millilitre pour centrifugation pour sédimenter les débris cellulaires. Transférer 300 microlitres de chaque échantillon dans des tubes individuels de micro centrifugeuse de 1,5 millilitre.
Mettre de côté 40 microlitres par échantillon pour la vente en gros en aval lysate fossile signal cellulaire supplémentaire réglementé kinase une et deux expression et l’activité amino blot analyse. Ajouter 20 microlitres de perles d’affinité anti-FLAG à chaque tube, pour une incubation d’une heure avec rotation dans une chambre froide de quatre degrés Celsius. À la fin de l’incubation, lavez rapidement et doucement les perles anti-drapeau une fois avec un tampon de lyse dans la chambre froide et une fois avec un tampon de réaction de kinase avant d’ajouter 20 microlitres de mélange de réaction de kinase.
Graph Mutants avec une faible affinité Dima peut perdre leur activité catalytique in vitro en raison de la dissociation Dima. Par conséquent, le lavage rapide et doux est critique. Après 10 minutes à température ambiante avec retournement toutes les deux minutes, arrêter les réactions kinase avec cinq microlitres de cinq tampon échantillon XSDS, par échantillon et faire bouillir les échantillons à 90 degrés Celsius pendant cinq minutes.
À la fin de l’incubation, exécuter les échantillons sur un gel d’électrophoresis polyacrylamide de 9 à 12 % avec 0,1 % de SDS, puis transférer les protéines dans une membrane de nitrocellulose pour permettre la détection des niveaux de kinase protéique activée par phospho mitogène et de mutants RAF dans chaque échantillon, par immunoblotting. Pour évaluer l’activité allosterique des mutants de la RAF morts de kinase, construisez des vecteurs codant le récepteur de la RAF ou les activateurs de la RAF morts de kinase. Transvect 293 cellules T avec deux vecteurs codant à la fois le récepteur RAF et l’activateur mort kinase RAF, ou un seul vecteur codant l’une des protéines comme démontré.
Récolter la cellule entière lysates après 48 heures de culture comme démontré, et mélanger rapidement la cellule entière propre lysate avec cinq tampon échantillon XSDS à température ambiante, Avant de faire bouillir les lysates pendant cinq minutes à 90 degrés Celsius. Ensuite, exécutez les échantillons bouillis de lysate de cellules entières sur un gel d’électrophoresis de 9 à 12%polyacrylamide qui est 0.1%SDS et transférez les protéines à une membrane de nitrocellulose pour détecter les niveaux de phospho le signal cellulaire supplémentaire réglé kinase un et deux et les protéines de contrôle par le buvard immunisé comme démontré. Pour mesurer l’affinité relative de dimère et ou la stabilité des mutants de la RAF construire des vecteurs codant mutants projet de technologie drapeau fusionné au terminus de Firefly luciferase ou le Terminus C une luciferase luciferase luciferase firefly.
Transvect 293 cellules T avec une paire de vecteurs codant différents et Terminus de mutants firefly luciferase RAF et C Terminus une luciferase luciferase MUTANTS RAF comme démontré. 24 heures après la transvection replater deux fois 10 à la cinquième 293 transactions de cellules T par puits en plaques d’image noir cristal dans le milieu sans couleur. 48 heures après la transvestion ajouter la luciferine à 293 transvectents à cellules T et incuber pendant 30 minutes.
Avant de mesurer les signaux de luciferase sur un système de détection multi. À la fin de la mesure aspirer les supernatents, et blice les 293 cellules T traitées avec tampon lysas comme démontré. Exécutez les échantillons entiers de lysate de cellules sur un gel d’électrophoresis de polyacrylamide de neuf à 12%avec 0.1%SDS.
Détecter les niveaux d’expression du terminus final des mutants firefly luciferase RAF, ou le terminus C des mutants firefly luciferase RAF par tache anti-drapeau aminé comme démontré. Ensuite, normalisez les signaux de luciferase des 293 transvectants à cellule T en fonction des niveaux d’expression du terminus final de Firefly luciferase et C terminus des mutants firefly luciferase RAF. Le kinase asa in vitro peut être utilisé pour sonder efficacement l’activité catalytique de certains mutants constitutifs actifs de la colonne vertébrale R, mais pas celle des mutants morts kinase avec une colonne vertébrale C fusionnée.
L’activité catalytique des mutants de raf constitutifs actifs avec une affinité ou une stabilité faible de dimère cependant, pourrait ne pas être sondée en utilisant cet ASA car leurs dimers sont cassés pendant le processus de purification. Pour éviter la perte d’activité catalytique des mutants de la RAF avec une faible affinité ou stabilité dimer, ces mutants peuvent être fusionnés avec glutothionas transferase pour sauver l’activité catalytique des mutants. L’ASA de co-activation de raf peut être employée pour évaluer l’activité allosteric des mutants morts de RAF de kinase.
Comme les mutants morts kinase illustrés avec un motif terminal d’extrémité acide et la fusion de la colonne vertébrale C, fonctionnent comme activateurs allosteriques pour déclencher l’activité catalytique des mutants avec un motif terminal acide non phosphore relatable, lorsqu’il est co-exprimé dans les cellules 293T. En outre, un luciferase SA split gratuit peut être utilisé pour mesurer l’affinité relative dimer ou la stabilité des kinases de la famille RAF et de leurs mutants. L’utilisation d’un tampon de lysas avec une faible concentration de détergent, et une procédure de lavage rapide douce pendant la purification de l’échantillon est essentielle pour un succès in vitro kinase SA. Cette technique aidera les chercheurs à déterminer précisément comment la maladie relaie les mutants de la RAF, active la voie en aval, facilitant la sélection de stratégies thérapeutiques appropriées pour le traitement de la maladie.
