שיטה זו מקלה על האפיון היעיל של שיטות הקשורות למחלות הקשורות לחיל האוויר המלכותי. טכניקה זו רגישה מאוד ובלתי ניתנת לשחזור, חסכונית, ידידותית למשתמש, ואינו דורש ציוד מתקדם. כדי למדוד את הפעילות הקטיטית של מוטציות חיל האוויר המלכותי, הכניסו מוטציות טכנולוגיות דגל לרצף הקידוד של חיל האוויר המלכותי על ידי PCR, לפני הכנסת רצפים שלמים לווקטור המתאים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים.
הכנס את הגלוטתיון כרצף קידוד transferase במעלה הזרם של רצפי קידוד מוטנטים RAF, כדי ליצור וקטורים קידוד גלוטתיון כמו transferase התמזגו מוטציות חיל האוויר המלכותי, באותו אופן. חוצים 80%-90%confluent 293T תרבויות תאים עם הווקטורים קידוד הדגל מתויגים KINASEs חיל האוויר המלכותי או המוטנטים שלהם, על פי פרוטוקולי סטנדרטים. לאחר 24 שעות של תרבות, להחליף את המדיום בכל תרבות.
לאחר 48 שעות של תרבות, להוסיף 400 microliters של חיץ תיזה בתוספת מעכבי פרוטאז ופוספטאז, לכל באר על קרח. לאחר חמש עד 10 דקות להעביר את התא lysates לצינור 1.5 מיליליטר עבור צנטריפוגה כדי להכביד על פסולת התא. להעביר 300 microliters של כל מדגם לתוך צינורות בודדים 1.5 מיליליטר מיקרו צנטריפוגה.
הניחו בצד 40 מיקרוליטרים לדגימה עבור lysate מאובנים סיטונאיים במורד הזרם אותות תאיים נוספים מוסדר קינאז אחד ושתיים ביטוי ופעילות ניתוח כתם אמינו. הוסיפו 20 מיקרוליטרים של בחנורי זיקה נגד דגל לכל צינור, לדגירה של שעה עם סיבוב בחדר קר של ארבע מעלות צלזיוס. בסוף הדגירה במהירות בעדינות לשטוף את גם נגד דגל פעם אחת עם חיץ תזה בחדר הקר ופעם אחת עם חיץ תגובת קינאז לפני הוספת 20 microliters של תערובת תגובת קינאז.
מוטנטים גרף עם זיקה דימה נמוכה עלולים לאבד את הפעילות הקטלטית שלהם במבחנה בגלל דיסוציאציה דימה. לכן, הכביסה המהירה והעדינה היא קריטית. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר עם היפוך כל דקה שנייה, לעצור את התגובות קינאז עם חמישה microliters של חמישה חיץ מדגם XSDS, לכל מדגם להרתיח את הדגימות ב 90 מעלות צלזיוס במשך חמש דקות.
בסוף הדגירה, הפעל את הדגימות על ג'ל אלקטרופורזה פוליאקרילמיד 9 עד 12% עם 0.1% SDS, ולאחר מכן העבר את החלבונים לממברנה ניטרוסלולוס כדי לאפשר זיהוי של רמות קינאז חלבון המופעל על ידי זרחן ו- RAF בכל דגימה, על ידי נפיחות חיסונית. כדי להעריך את הפעילות Allosteric של מוטציות חיל האוויר המלכותי מת kinase, לבנות וקטורים קידוד מקלט חיל האוויר המלכותי או מפעילי חיל האוויר המלכותי מת kinase. רוחב 293 תאי T עם שני וקטורים המנקים הן את מקלט חיל האוויר המלכותי והן את מפעיל חיל האוויר המלכותי המת kinase, או וקטור יחיד הממקד את אחד החלבונים כפי שהוכח.
לקצור את התא כולו lysates לאחר 48 שעות של תרבות כפי שהוכח, במהירות לערבב את התא כולו נקי lysate עם חמישה חיץ מדגם XSDS בטמפרטורת החדר, לפני רותחים את lysates במשך חמש דקות ב 90 מעלות צלזיוס. לאחר מכן להפעיל את כל התא מבושל lysate דגימות על 9 עד 12%polyacrylamide אלקטרופורזה ג'ל זה 0.1% SDS ולהעביר את החלבונים קרום nitrocellulose לגילוי רמות של פוספו אותות סלולריים נוספים מוסדר קינאז אחד ושתיים ולשלוט חלבונים על ידי כתמים חיסוניים כפי שהוכח. כדי למדוד את הזיקה העמומה יחסית ואת היציבות של מוטציות חיל האוויר המלכותי לבנות וקטורים קידוד דגל טק טיוטה מוטנטים התמזגו לטרמינוס של Firefly luciferase או C Terminus לוציפראז גחליל אש.
Transvect 293 תאי T עם זוג וקטורים קידוד שונה ו Terminus של מוטציות חיל האוויר המלכותי גחליל לוציפראז ו C Terminus מוטציות חיל האוויר המלכותי גחליל כפי שהודגם. 24 שעות לאחר טרנסווט replate פעמיים 10 כדי החמישי 293 עסקאות תא T לתוך גם לתוך לוחות תמונה שחור קריסטל במדיום צבע חינם. 48 שעות לאחר transvestion להוסיף את luciferin כדי 293 T רוחבי תא דגירה במשך 30 דקות.
לפני מדידת אותות הלוציפראז במערכת זיהוי מרובה. בסוף המדידה שאפו את העל-טבעיים, והתעלו על תאי 293 T המהומשים עם מאגר ליזות כפי שהוכח. הפעל את כל תא lysate דגימות על ג'ל אלקטרופורזה 9 עד 12%polyacrylamide עם 0.1%SDS.
לזהות את רמות הביטוי של שליחות קטלנית של מוטציות חיל האוויר המלכותי פיירפלי לוציפראז, או את המינוח C של מוטציות RAF פיירפליי לוציפראז על ידי כתם אמינו אנטי דגל כפי שהוכח. ואז לנרמל את אותות luciferase של 293 T transvectants תא על פי רמות הביטוי של שליחות הסופית של Firefly luciferase ו C שליחות קטלנית של מוטציות חיל האוויר המלכותי פיירפלי לוציפראז. ניתן להשתמש ב- in vitro kinase asa כדי לחקור ביעילות את הפעילות הקטליטית של כמה מוטנטים פעילים R-spine, אך לא של מוטציות מתות קינאז עם עמוד שדרה C מותך.
הפעילות הקטאליטית של מוטציות חיל האוויר המלכותי פעילים באופן מכונן עם זיקה עמומה חלשה או יציבות עם זאת, לא יכול להיות נבדק באמצעות אס"א זה כמו עמעום שלהם שבורים במהלך תהליך הטיהור. כדי למנוע אובדן של פעילות קטיטית של מוטציות חיל האוויר המלכותי עם זיקה עמומה חלשה או יציבות, מוטנטים אלה יכולים להיות התמזגו עם העברת glutothionas כדי להציל את הפעילות הקטיטית של המוטנטים. ASA שיתוף הפעלה חיל האוויר המלכותי יכול לשמש כדי להעריך את הפעילות allosteric של מוטציות חיל האוויר המלכותי מת קינאז.
כפי שמודגם מוטציות מתות קינאז עם מוטיב מסוף קצה חומצי והיתוך עמוד השדרה C, לתפקד כמפעילים allosteric לעורר את הפעילות הקטלטית של מוטנטים עם מוטיב מסוף קצה חומצי שאינו זרחן, כאשר co לידי ביטוי בתאי 293T. עוד יותר לוציפראז פיצול חינם SA יכול לשמש למדידת הזיקה העמומה יחסית או יציבות של kinases משפחת חיל האוויר המלכותי ואת המוטנטים שלהם. שימוש במאגר ליססה עם ריכוז נמוך של חומר ניקוי, והליך שטיפה עדין ומהיר במהלך טיהור הדגימה חיוני ל- SA מוצלח במבחנה. טכניקה זו תסייע לחוקרים לקבוע בדיוק כיצד המחלה מעבירה את המוטנטים של חיל האוויר המלכותי, מפעילה את מסלול במורד הזרם, ומקלה על בחירת אסטרטגיות טיפוליות מתאימות לטיפול במחלות.
