La dissection rétinienne de la souris est un processus très délicat en raison de la taille et de la forme des yeux et de la fragilité de la section rétine. Impératif de pratiquer, avoir un protocole détaillé qui fournissent une méthode efficace et des conseils est la clé de la dissection rétinienne de haute qualité et la section. Nous fournissons des conseils et des conseils pour aider les chercheurs à éviter les pièges courants et à obtenir des sections rétiniennes de haute qualité adaptées à l’immunohistochimie.
Marquer la partie temporelle de l’œil d’une souris euthanasiée à l’aide d’un cautérisateur de queue en touchant la cornée très légèrement et pendant au plus une fraction de seconde pour brûler légèrement la cornée et éviter de faire un trou. Immédiatement après cela utilisé courbe Dumont 545 forceps pour enucleate yeux de souris. Placez les yeux dans un cryotube de 1,5 millilitre avec un millilitre de 4% PFA et PBS et incubez pendant 15 minutes sur la glace.
Ensuite, transférez les yeux fixes à l’aide des forceps Dumont 545 incurvés vers un plat de dissection modifié de 35 millimètres rempli de PBS et placez-le au microscope disséquant. Utilisez un microknife pour faire une petite incision à la marque de brûlure perpendiculaire à et juste au-dessus de la bordure des limbes de la cornée. Insérez des ciseaux incurvés dans l’incision et effectuez une coupe circonférentielle de la cornée suivant le limbe.
Ensuite, à l’aide de minces forceps Dumont 5, retirez la cornée, extrayez la lentille et soulevez-la délicatement loin de la partie postérieure de l’œil. Le corps vitreux sortira avec la lentille et la rétine sera visible comme une surface blanche couvrant l’intérieur de la coupe postérieure de l’œil. Lavez les cils isolés deux fois en un millilitre de PBS pendant 10 minutes à température ambiante.
Pour cryo-protéger les cils, équilibrez-les en saccharose à 15 % et en PBS pendant la nuit à quatre degrés Celsius jusqu’à ce qu’ils coulent. Ensuite, transférez les cils à 30% saccharose et PBS pendant deux à trois heures jusqu’à ce qu’ils coulent. Placez les cils en OCT en cryo-moules de 10 par 10 millimètres pour l’intégration.
Sous un microscope disséquant, orientez l’œil dans le cryo-moule le long de son axe ventral dorsal en tournant l’œil jusqu’à ce que la marque de brûlure soit sur le dessus. Le nerf optique est l’un à gauche et la partie découpée du moule fait face à la droite. Pour casser le tissu rétinien, immerger le cryo-moule pendant au moins cinq minutes dans un bécher métallique contenant de l’isopentane, puis placer le bécher dans de l’azote liquide jusqu’à un tiers de la hauteur du bécher.
Retirer le bloc congelé, l’envelopper dans du papier d’aluminium et le conserver à moins 80 degrés Celsius. Utilisez un stylo ou Sharpie pour marquer le bloc gelé pour enregistrer son orientation. Après avoir ajusté la température du cryostat entre moins 20 et moins 25 degrés Celsius, placez les moules contenant les cils intégrés à l’intérieur et laissez-les équilibrer à la température du cryostat pendant une heure.
Installez le bloc dans le cryostat avec l’orientation ventrale dorsale et commencez à couper 10 sections de série micrométriques d’épaisseur. Placez soigneusement les sections rétiniennes sur des diapositives annotées et numérotées au microscope, puis rangez-les dans des boîtes à diapositives à moins 20 degrés Celsius ou moins 80 degrés Celsius jusqu’à ce qu’elles soient prêtes pour l’immunostaining. Immunohistochimie avec des anticorps à la rhodopsine, un marqueur photorécepteur, decarboxylase acide glutamique 65, et marqueur cellulaire amacrine, synthétase de glutamine et marqueur cellulaire muller, et calbindin, un marqueur horizontal de cellules a été exécuté sur des sections rétiniennes.
Les résultats indiquent que ce protocole donne des sections rétiniennes de haute qualité et bien conservées contrairement aux sections rétiniennes de mauvaise qualité obtenues à partir d’un protocole différent. Les segments intérieurs et extérieurs riches en rhodopsine restent verticaux et intacts avec peu ou pas de séparation de l’épithélium pigmenté rétinien. Les interneurones, tels que les cellules amacrines positives Gad65, restent correctement stratifiés dans la couche nucléaire interne et la couche plexiforme interne.
En outre, les cellules muller restent bien conservées avec du soma correctement aligné dans les processus cytoplasmiques qui s’étendent de la couche cellulaire ganglionnaire à la couche nucléaire externe. En outre, des cellules horizontales bien définies sont détectables à la couche nucléaire intérieure et à la bordure extérieure de la couche plexiforme. Il est important de marquer la région topper des yeux et de garder l’orientation pendant l’intégration.
Préparez toujours du paraformaldéhyde sous le capot avec l’équipement de protection individuelle approprié.
