Tout projet de sciences de la vie qui nécessite une étude ultrastructure 3D d’une région spécifique d’intérêt pour un échantillon biologique complexe peut faire usage de cette technique. La procédure de préparation de l’échantillon est la même pour deux modalités d’imagerie étant SBF/SEM et FIB-SEM. L’utilisation du four à micro-ondes accélère considérablement la partie de traitement de l’échantillon.
Bien que montré ici pour les bouts de racine, ce protocole peut être employé pour n’importe quel système biologique de modèle avec des ajustements minimaux. Avant d’utiliser ce workflow pour corréler le SBF/SEM et le FIB-SEM, il faut connaître les technologies individuelles. L’exécution de certaines étapes est facile à démontrer mais difficile à décrire dans le texte écrit.
Peter Borghgraef, technicien dans notre laboratoire, démontrera la procédure. Pour commencer, couper les extrémités des racines des semis fixes d’Arabidopsis thaliana sur les plaques d’agar et mettre deux à trois pointes dans les tubes d’Eppendorf contenant le même fixatif pendant la nuit à quatre degrés Celsius. Le matin, avec une pipette, remplacer fixatif par 0,1 tampon de phosphate molaire au pH 6,8 dans les tubes avec les tubes sur une table rotative à 100 RPM et laver pendant 10 minutes.
Répétez ensuite le lavage à l’aide d’un tampon de phosphate frais cinq fois. Dans une hotte de fumée, post-fixer les extrémités des racines en remplaçant le tampon de phosphate par 2% de tétoxyde d’osmium et 0,2% de ruthénium rouge en tampon phosphate molaire 0,1 à pH 6,8 avec les tubes avec couvercles ouverts au micro-ondes et commencer le programme. Puis jetez la solution dans les tubes et lavez les pointes des racines deux fois avec de l’eau distillée double pendant cinq minutes chacune.
Pour le troisième et le quatrième lavage à l’eau distillée double, utilisez le four à micro-ondes pour aider au lavage. Après le premier lavage à l’eau distillée double de 40 secondes, sortez les échantillons d’extrémité des racines du four à micro-ondes et remplacez l’eau distillée double par de l’eau fraîche distillée double. Remettre les échantillons au micro-ondes et poursuivre le programme.
Ensuite, préparez la solution TCH en ajoutant 0,1 gramme de thiocarbohydrazide à 10 millilitres d’eau distillée double dans un tube de 15 millilitres. Placer le tube au four et chauffer à 60 degrés Celsius pendant une heure pour dissoudre. Filtrez ensuite la solution TCH à l’aide d’un filtre seringue de 0,22 micromètre.
Remplacez immédiatement la solution dans les tubes d’échantillon par la solution TCH filtrée et continuez avec le protocole. Maintenant, immerger les échantillons dans l’éthanol et les placer dans le micro-ondes pour se déshydrater dans des étapes classées de 50%70%90%, puis deux fois de traitement 100% éthanol. Après le traitement de déshydratation par oxyde de propylène, ajouter 50% de résine spurr dans les tubes pour commencer l’infiltration des extrémités des racines pendant au moins deux heures.
Après l’incubation finale dans la résine de 100%Spurr, placez les extrémités des racines dans les moules d’intégration et remplissez les moules avec de la résine fraîche 100% Spurr et polymérisez dans un four à 65 degrés Celsius pendant 36 à 48 heures. Tout d’abord, utilisez une lame de rasoir pour couper grossièrement l’échantillon polymérisé en un mince bloc. Avec le côté ayant le tissu exposé face vers le bas, fixez l’échantillon au centre d’une goupille en métal avec de la résine époxy conductrice pour avoir le tissu touchant la goupille en métal.
Placer l’échantillon dans un four à 65 degrés Celsius pour guérir l’époxy pendant la nuit. Le matin, chargez la goupille métallique dans le support et utilisez une lame de rasoir pour éliminer tout excès d’époxy de l’échantillon. Pour lisser davantage la face de l’échantillon, chargez le support avec la goupille métallique dans le support pour l’ultramicrotome.
Dans l’ultramicrotome, utilisez un couteau en verre ou en diamant pour lisser la face des côtés du bloc formant une pyramide. Assurez-vous qu’au moins une partie du tissu est déjà exposée sur la face du bloc. Placez ensuite le bloc d’échantillon paré dans le revêtement de pulvérisateur et ajustez les réglages en platine à deux à cinq nanomètres pour enrober l’échantillon d’une fine couche.
Insérez le support dans le microscope SBF-SEM. Apportez le couteau à diamants près de la surface de l’échantillon et coupez la partie supérieure de l’échantillon pour enlever la couche de platine et exposer une partie du tissu. Réglez ensuite la tension d’accélération à 1,5 à 2 kilovolts.
Capturez une image du tissu et configurez une course d’imagerie. À l’aide du logiciel Fidji, sélectionnez le fichier, importez, séquencez d’image et localisez la pile d’images pour charger les images. Après avoir ajusté l’image en fonction du manuscrit, vérifiez l’alignement en faisant défiler l’ensemble de données.
Utilisez la commande d’sauvegarde sous le menu de fichiers pour enregistrer l’ensemble de données alignés en tant que fichier TIFF 3D. Analyser attentivement l’ensemble de données pour voir si le retour sur investissement est inclus et contient les informations nécessaires à la question biologique. Sur la dernière image de la pile, qui est la face de bloc actuelle dans le microscope SBF-SEM, sélectionnez un nouveau roi pour FIB-SEM.
Après avoir recouvert de platine à nouveau, chargez l’échantillon dans le FIB-SEM et utilisez le détecteur d’électrons secondaire à 15 kilovolts et une nanoampe pour localiser le retour sur investissement identifié dans le SBF-SEM sur la face du bloc. Déplacez et inclinez la scène pour amener le retour sur investissement sur l’échantillon dans le point de coïncidence des faisceaux FIB et SEM, à l’aide du faisceau FIB et du système d’injection de gaz. Déposez une couche protectrice d’un micromètre de platine sur la surface au-dessus du retour sur investissement.
Ensuite, à l’aide d’un faible courant de fraisage allant de 50 à 100 picoamps, les lignes fines de l’usine dans le dépôt de platine pour l’autofocusing et le suivi 3D pendant la course d’imagerie. Puis, à l’aide d’un courant de fraisage élevé de 30 nanoampes, moudre une tranchée de 30 micromètres devant le retour sur investissement créant la surface d’imagerie pour le faisceau SEM. Après avoir lissage de la surface de l’image, démarrez l’imagerie et surveillez la stabilité du processus pendant les 50 à 100 premières sections.
Une fois que le système fonctionne bien, quittez la pièce et assurez-vous qu’il y a le moins de perturbations possible dans la pièce. Les images du SBF-SEM donnent un aperçu du tissu donnant un aperçu de l’orientation spatiale des cellules et des connexions intracellulaires. L’imagerie FIB-SEM ultérieure sur une nouvelle région ajoute des détails à haute résolution de cellules et de structures spécifiques.
Les données du SBF-SEM montrent un rendu différent des voxels non isotropes des données isotropes voxel FIB-SEM. SBF-SEM présente un effet d’escalier sur la surface tandis que les données FIB-SEM ayant les cinq sections nanométriques assure que le rendu semble beaucoup plus lisse et les sections individuelles se fondent complètement dans la surface. Ce protocole décrit l’imagerie d’une région unique dans un seul échantillon et tout écart par rapport au flux de travail peut causer des dommages à l’échantillon, rendant impossible la relocalisation de la région d’intérêt.
