Ici, nous démontrons un essai de trafic de récepteurs à haute teneur qui est compatible avec la préparation de la culture neuronale primaire. Cette méthode marque séparément la surface d’une piscine de récepteurs inter cave de neurones fixes. Présentation habilitante des données en tant que rapport entre la densité normalisée de la surface ou des récepteurs intériorisés et la densité globale de ce récepteur.
L’analyse de trafic de contenu et de récepteurs à haute teneur fournit un moyen efficace de mesurer les changements en vrac dans les profils de trafic de récepteurs au sein d’un réseau neuronal en réponse à divers facteurs. Consommer beaucoup moins de temps et de matériaux que les méthodes alternatives. Les perturbations et le trafic de précepteurs ont été liés à de multiples troubles neurologiques et sont considérés comme des cibles attrayantes pour la pharmacothérapie.
Par exemple, des études ont montré que l’un des premiers signes de la maladie d’Alzheimer est la perte synaptique et la diminution des bassins synaptiques et précepteurs. Cette technique nécessite de nombreuses étapes différentes de difficulté variable. D’autant plus que la manipulation de la plaque de puits 96 et la manipulation des puits peuvent s’avérer difficiles pour quelqu’un sans expérience.
Et parce que les résultats de l’expérience sont très sensibles à une mauvaise manipulation, il est utile de visualiser les différentes étapes en cours d’effectuer. Instructeur Pour commencer, nourrissez les neurones dans la plaque de puits 96 en enlevant 100 microlitres des supports préexistants de chaque puits. Et le remplacer par 100 microlitres de médias préchauffés à 37 degrés Celsius.
Tous les trois à quatre jours. Une journée in vitro 14, utilisez un multi-pipet pour enlever 100 microlitres de médias de chaque puits et mettre en commun les médias. Ajoutez deux microlitres de la solution TTX Stock à un millilitre des supports conditionnés mis en commun pour créer une solution quatre micromolaires de TTX.
Traiter les neurones dans chaque puits avec 100 microlitres de quatre micromolaires TTX solution. S’il n’y a pas assez de supports d’état mis en commun, ajoutez certains des supports précédemment stockés. Incuber dans un incubateur de CO2 à 37 degrés Celsius pendant quatre heures.
Après cela, retirez le TTX existant contenant des supports et ajoutez 200 microlitres de supports neuronaux préchauffés, et incubez la micro plaque à température ambiante pendant quinze minutes. Retirez d’abord le média neuronal de la micro plaque. Ajouter cinquante microlitres de la solution anticorps anti gluA1 ou anti gluA2 aux puits correspondants de la micro plaque.
Ajouter cinquante microlitres de supports neuronaux aux puits de contrôle des anticorps secondaires. Incuber à température ambiante pendant vingt minutes pour permettre la liaison anticorps. Après cela, retirez les supports existants des puits.
Lavez la micro plaque trois fois avec 100 microlitres de médias neuronaux à température ambiante par puits pour éliminer les anticorps non liés. Ajoutez ensuite 100 microlitres 100 micromolaires de solution de stock DHPG à chaque puits. Incuber dans un incubateur de dioxyde de carbone à 37 degrés Celsius pendant dix minutes.
Ensuite, retirez la solution DHPG et ajoutez 100 microlitres de médias neuronaux à chaque puits. Répétez ce processus une deuxième fois. Puis incuber dans l’incubateur de dioxyde de carbone de 5% à 37 degrés Celsius pendant cinq minutes.
Le jour de l’expérience préparer une solution de 4% paraformaldéhyde et 4% saccharose NPBS. Retirez le média de chaque puits et remplacez-le par 100 microlitres de la solution de paraformaldéhyde et de saccharose. Répétez ce processus pour chaque point de temps d’ajout.
Incuber la micro plaque à 4 degrés Celsius pendant vingt minutes. Retirez ensuite le fixatif et ajoutez 100 microlitres de DPBS à chaque puits. Retirez le DPBS et ajoutez 150 microlitres de tampon de blocage à chaque puits.
Incuber à température ambiante pendant quatre-vingt-dix minutes. Retirez le tampon de blocage et ajoutez 50 microlitres de la solution d’anticorps secondaire à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant soixante minutes tout en gardant la plaque à l’abri de la lumière.
Retirez la solution anticorps et ajoutez 100 microlitres de SCT à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez ce processus, en enlevant le média des puits en ajoutant le SCT et en couveant à température ambiante quatre fois de plus.
Après cela, retirez le SCT de la micro plaque. Ajouter 100 microlitres d’une solution de 4% de paraformaldéhyde et 4% de saccharose en PBS à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant quinze minutes.
Retirer la solution de paraformaldéhyde et ajouter 100 microlitres de SCT dans chaque puits, et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez cette étape deux fois supplémentaires. Préparez d’abord une solution de SCT contenant 2% de saponine et vortex de la solution brièvement pour dissoudre complètement la poudre de saponine.
À l’aide d’un filtre de 2 micromètres, filtrer la solution pour éliminer les particules qui pourraient causer l’autofluorescence. Ajouter 150 microlitres de cette solution de 2% de saponine à chaque puits, et incuber à température ambiante pendant quinze minutes. Retirez ensuite la solution saponine et ajoutez 150 microlitres de tampon de blocage à chaque puits.
Incuber à température ambiante pendant quatre-vingt-dix minutes. Après cela, retirez le tampon de blocage et ajoutez cinquante microlitres de la solution d’anticorps secondaire à chaque puits. Incuber à température ambiante pendant soixante minutes.
Ajouter ensuite 100 microlitres de SCT à chaque puits et incuber à température ambiante pendant cinq minutes. Répétez ce processus en ajoutant le SCT et en couveant à température ambiante quatre fois de plus. À l’aide d’un système d’imagerie laser infrarouge, imagez la micro plaque de puits 96 selon les instructions des fabricants.
Réglez la résolution d’analyse à 84 micromètres. La qualité de l’analyse à moyen et la mise au point offset en fonction de la hauteur de base de la plaque micro 96 puits utilisé. Cliquez sur le bouton menu Image Studio, exportez l’image pour les médias numériques et exportez les images avec une résolution de 300 dpi en format TIFF.
Ouvrez l’image dans ImageJ Fiji. Divisez les canaux de couleur en cliquant sur le menu de l’image, puis la couleur, diviser les canaux. Ensuite, ouvrez le gestionnaire de retour sur investissement à partir d’analyses, d’outils.
Cochez la case pour les étiquettes dans le gestionnaire de retour sur investissement, afin de classer les cercles avec des nombres. Dans le canal 6 80, ou rouge, sélectionnez la région d’intérêt en sélectionnant l’outil cercle et en dessinant un cercle qui s’adapte exactement au premier puits. Ensuite, appuyez sur Ctrl plus T, en faisant glisser le cercle vers le puits suivant.
Répétez ce processus jusqu’à ce que tous les puits soient encerclés. À partir de la mesure de clic de gestionnaire de roi. Sélectionnez les valeurs qui apparaissent et copiez-les sur une feuille de diffusion.
Cliquez ensuite sur le canal vert et transposez les ROM sélectionnés à l’image. À partir de la mesure de clic de gestionnaire de roi. Sélectionnez les valeurs qui apparaissent et copiez-les sur une feuille de diffusion.
Après cela calculer les changements de l’expression du récepteur de surface tel que décrit dans le protocole de texte. Dans cette procédure, la persistance de l’arc dans la régulation du trafic des récepteurs ampa est examinée à l’aide du trafic et de l’essai des récepteurs ampa à haute teneur. Les neurones sont traités avec le bloqueur de canal sodium-ion TTX qui inhibe les potentiels d’action et réduit les niveaux d’arc.
Suivi par DHPG qui induit la traduction d’arc et l’ubiquitination. Les sous-unités de récepteur de surface et d’internalisation de gluA1 et de gluA2 contenant des sous-unités de récepteur d’apa ont été mesurées à cinq et quinze minutes après le lavage de DHPG. Les neurones ArcKR montrent une endositose gluA1 accrue lorsqu’ils sont traités par DHPG, par rapport aux neurones de type.
Cet effet n’est pas vu lorsque les neurones sont traités avec TTX seulement. L’expression de surface du sous-unité gluA2 est augmentée de façon significative à des moments courts par rapport aux neurones de type flétrissement. Indiquant un remplacement sous-unit potentiel.
Assurez-vous que les cellules sont illiquides paraformaldéhyde fixe doit être préparé frais le jour de l’expérience. Les cellules doivent être réparées après l’étiquetage des récepteurs de surface. D’autres méthodes telles que la microscopie confocale seront en mesure de fournir une résolution unicellulaire pour caractériser davantage les modifiés connexes dans la structure neuronale et la localisation des récepteurs.
Perturber la dynamique temporelle de l’arc modifie le trafic des récepteurs ampa en réponse à MgluR médiatisé LTD. Les orientations futures seront de mesurer le trafic des récepteurs ampa en réponse à d’autres stimuli. Cet essai peut-être adaptable à d’autres types de cellules, traitements et récepteurs, à condition que la procédure soit soigneusement ajustée et validée de manière appropriée.
Il faut veiller à ce que les densités cellulaires, les temps de traitement, les étapes de fixation, les étapes de perméabilisation et les sélections de reagent soient optimisés pour votre système d’intérêt. Pour une réalisation réussie et efficace de l’analyse, il est important de préparer la solution DHPG et le paraformaldéhyde à 4 %, solution de saccharose à 4 % le jour de l’expérience. Contrôle bien traité avec vakeel ou TTX sont nécessaires pour s’assurer que les effets observés sont spécifiques au traitement.
Il est également essentiel d’inclure les puits traités avec seulement les anticorps secondaires à contrôler pour la fluorescence de fond produite par la liaison non spécifique.
