Un modèle préclinique de co-culture autologue de cancer gastrique dérivé de l’homme et de cellules immunitaires pour prédire l’efficacité des thérapies ciblées

Les objectifs du protocole sont d’utiliser cette approche pour 1) comprendre le rôle du microenvironnement de la tumeur gastrique immunosuppressive et 2) prédire l’efficacité de la réponse des patients, augmentant ainsi le taux de survie des patients.

Les tumeurs exprimant le ligand de mort cellulaire programmée 1 (-L1) interagissent avec la protéine de mort cellulaire programmée 1 (-1) sur les lymphocytes T cytotoxiques (CTL) CD8+ pour échapper à la surveillance immunitaire, ce qui conduit à l’inhibition de la prolifération, de la survie et de la fonction effectrice des CTL, et par conséquent à la persistance du cancer. Environ 40 % des cancers gastriques expriment-L1, mais le taux de réponse à l’immunothérapie n’est que de 30 %. Nous présentons l’utilisation de la co-culture d’organoïdes et de cellules immunitaires autologues du cancer gastrique d’origine humaine comme modèle préclinique qui pourrait prédire l’efficacité des thérapies ciblées pour améliorer l’issue des patients atteints de cancer. Bien que des co-cultures d’organoïdes cancéreux avec des cellules immunitaires aient été signalées, cette approche de co-culture utilise l’antigène tumoral pour pulser les cellules dendritiques présentatrices d’antigène. Les cellules dendritiques (DC) sont ensuite cultivées avec les lymphocytes T CD8+ du patient afin d’augmenter l’activité cytolytique et la prolifération de ces lymphocytes T avant la co-culture. De plus, la différenciation et la fonction immunosuppressive des cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) en culture sont étudiées dans le cadre de ce système de co-culture. Cette approche organoïde peut être d’un grand intérêt et appropriée pour prédire l’efficacité du traitement et l’issue du patient dans d’autres cancers, y compris le cancer du pancréas.

Le cancer de l’estomac est le cinquième cancer le plus fréquent dans le monde ¹. Le diagnostic et le traitement efficaces d’Helicobacter pylori (H. pylori) ont entraîné une faible incidence de cancer gastrique aux États-Unis ². Cependant, le taux de survie à 5 ans des patients diagnostiqués avec cette tumeur maligne n’est que de 29 %, ce qui fait du cancer gastrique un défi médical important³. L’objectif des méthodes présentées ici est de développer une approche permettant de prédire avec précision les réponses d’immunothérapie chez les patients individuels. Les tumeurs solides sont constituées de cellules cancéreuses et de divers types de cellules stromales, endothéliales et hématopoïétiques, y compris les macrophages, les cellules suppressives dérivées de myéloïdes (MDSC) et les lymphocytes (examiné dans ^4,5). Les interactions entre les cellules souches cancéreuses et le microenvironnement tumoral (TME) ont un impact substantiel sur les caractéristiques de la tumeur et la réponse du patient au traitement. Cette approche vise à permettre aux chercheurs d’acquérir des connaissances pour le développement préclinique de médicaments et la découverte de biomarqueurs pour le traitement personnalisé du cancer gastrique.

La méthode présentée ici utilise des co-cultures autologues d’organoïdes et de cellules immunitaires dérivées de l’homme générées à partir de patients atteints d’un cancer gastrique pour comprendre le rôle immunosuppresseur des MDSC. Des co-cultures d’organoïdes cancéreux avec des cellules immunitaires ont été largement rapportées dans le domaine du cancer du pancréas 6,7,8,9,10. Cependant, de telles co-cultures n’ont pas été signalées pour étudier le cancer gastrique. Dans l’ensemble, cette méthode démontre la co-culture de cellules immunitaires autologues dérivées de l’homme dans le même environnement matriciel que les organoïdes cancéreux, permettant ainsi aux cellules immunitaires d’être en contact avec les organoïdes cibles.

L’étude de Tiriac et ^al.10 a rapporté que les organoïdes du cancer du pancréas dérivés de patients, qui présentaient des réponses hétérogènes aux chimiothérapies standard, pouvaient être regroupés en signatures d’expression génique de chimiosensibilité basées sur les organoïdes qui pouvaient prédire l’amélioration des réponses des patients à la chimiothérapie. Les chercheurs ont proposé que le profilage moléculaire et thérapeutique combiné des organoïdes du cancer du pancréas puisse prédire la réponse clinique¹⁰. Les données d’essais cocliniques de Yao et ^al.11 ont également montré que les organoïdes dérivés du cancer du rectum représentent une physiopathologie similaire et des changements génétiques similaires aux tissus tumoraux du patient en réponse à la chimioradiothérapie. Ainsi, il est fondamental que les cultures d’organoïdes soient utilisées dans le contexte des cellules immunitaires du patient et du phénotype immunitaire tumoral lors de l’utilisation de ces cultures comme modèles prédictifs pour la thérapie.

Les tumeurs exprimant-L1 qui interagissent avec-1 inhibent la prolifération, la survie et la fonction effectrice des lymphocytes T cytotoxiques CD8+ 12,13,14. Alors qu’environ 40 % des cancers gastriques expriment-L1, seuls 30 % de ces patients répondent à l’immunothérapie 15,16,17. Les anticorps anti-PD1 sont utilisés dans les essais cliniques pour le traitement du cancer gastrique 18,19,20. Cependant, il n’existe actuellement aucun modèle préclinique permettant de tester l’efficacité thérapeutique pour chaque patient. L’optimisation de la culture d’organoïdes de manière à ce que les cellules immunitaires du patient soient incluses dans le système permettrait potentiellement d’identifier individualisément l’efficacité de l’immunothérapie.

L’approbation a été obtenue pour la collecte de tissus biopsiés par l’homme à partir de tumeurs de patients (1912208231R001, Programme de protection des sujets humains de l’Université de l’Arizona ; Numéro de protocole IRB : 1099985869R001 , Programme de protection des sujets humains de l’Université de l’Arizona TARGHETS).

1. Établir des organoïdes gastriques dérivés de patients à partir de biopsies

1. Prélever 1 à 2 mm de tissus humains biopsiés dans la région tumorale de patients atteints d’un cancer gastique subissant une gastro-duodénoscopie œsophagienne dans une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) 1x (Tableau 1).
   REMARQUE : Toutes les procédures doivent désormais être effectuées dans un environnement aseptique en utilisant des matériaux et des réactifs stériles.
2. Émincez les tissus biopsiés à l’aide de lames de scalpel sur une boîte de Pétri. Transférez les mouchoirs hachés dans un tube conique de 15 ml et ajoutez 5 à 10 ml de 1x PBS.
3. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min à température ambiante. Jetez le surnageant. Ajouter 1 à 2 ml de tampon de digestion préchauffé (tableau 1) aux tissus granulés.
4. Incuber à 37 °C pendant 15 à 30 min, selon la taille des tissus hachés. Surveillez l’état de la digestion en regardant au microscope pour détecter de petits amas de cellules toutes les 5 à 10 minutes.
5. Arrêtez la digestion en diluant 5 fois avec du médium froid Advanced Dulbecco’s Modified Eagle Medium/Ham’s F-12 medium (Advanced DMEM/F-12). Si des amas de matière non digérée sont visibles, filtrez les tissus à travers des filtres de 30 μm. Récupérez le flux continu.
6. Centrifuger le flux à 300 × g pendant 5 min à température ambiante pour granuler les cellules. Jetez le surnageant.
7. Remettre en suspension les cellules granulées (10 000 à 100 000) dans un volume approprié (2 à 4 ml) de matrice de membrane basale décongelée (voir le tableau des matériaux) sur de la glace. Les graines se déposent sous forme de matrice de membrane cellule-basale de 30 à 50 μL dans des plaques de culture à 24 puits.
8. Incuber les plaques à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre à la matrice de la membrane cellule-socle de se solidifier. Superposer les gouttes de la matrice de la membrane basale cellulaire avec un milieu de culture organoïde gastrique préchauffé (tableau 1).
9. Maintenir les cultures d’organoïdes à 37 °C dans 5 % de CO₂. Remplacez le milieu de culture par un milieu frais tous les 3-4 jours, en fonction de la croissance des organoïdes. Passez les organoïdes une fois tous les 7 à 10 jours dans un rapport de 1 : 3.

2. Établir des organoïdes gastriques dérivés de patients à partir d’échantillons chirurgicaux

1. Prélever des tissus de cancer gastrique humain à partir d’échantillons réséqués de patients atteints de cancer gastrique lors d’interventions chirurgicales dans 1 solution saline tamponnée au phosphate de Dulbecco (DPBS) complétée par des antibiotiques (tableau 1).
   REMARQUE : Toutes les procédures ci-après doivent être traitées dans une enceinte de biosécurité, en maintenant un environnement aseptique et en utilisant des matériaux et des réactifs stériles.
2. Émincez les tissus réséqués à l’aide de lames de scalpel chirurgicaux sur une boîte de Pétri. Lavez les mouchoirs hachés avec 5 à 10 ml de 1 DPBS contenant des antibiotiques.
3. Transférez le tissu dans un tube conique de 50 ml. Ajouter 10 ml de tampon de décapage préchauffé à l’acide éthylènediamine tétraacétique (EDTA) sur les tissus hachés. Surveillez l’état de la digestion toutes les 5 à 10 minutes. Incuber le tube dans un agitateur à 37 °C pendant 10 min.
4. Laissez les tissus se déposer au fond du tube, retirez le tampon EDTA sans déranger les tissus et ajoutez 10 ml de tampon EDTA frais. Incuber le tube dans un agitateur à 37 °C pendant 5 min.
5. Laissez les tissus se déposer au fond du tube. Retirer le tampon EDTA et laver les mouchoirs deux fois (suivre l’étape 2.4) avec 10 mL de DMEM/F-12 avancé complété par des antibiotiques (pas de centrifugeuse) (tableau 1).
6. Ajouter 5 à 10 ml de tampon de digestion préchauffé (tableau 1) dans les tissus, selon la taille des tissus. Incuber le tube à 37 °C pendant 15 à 30 minutes en agitant légèrement, en fonction de la taille et de la texture des tissus. Vérifiez l’apparence des amas de cellules au microscope toutes les 10 minutes.
7. Arrêtez la digestion en diluant deux fois avec du DMEM avancé / F-12 froid plus des antibiotiques. Filtrez les tissus non digérés à travers des filtres de 40 μm et collectez le flux.
8. Centrifuger le flux à 400 × g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules. Jetez le surnageant et lavez les cellules avec du DPBS froid 1x plus des antibiotiques à 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Jetez soigneusement le surnageant et conservez les cellules sur de la glace.
9. Remettre en suspension les cellules granulées dans un volume approprié de la matrice de la membrane basale sur de la glace. La matrice de membrane cellule-basale de 30 à 50 μL de semences est déposée dans des plaques traitées pour culture cellulaire à 24 ou 12 puits.
10. Incuber les plaques à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre aux gouttes de matrice de la membrane cellule-socle de se solidifier en forme de dôme. Recouvrir le dôme de la matrice de la membrane cellule-socle avec un milieu de culture organoïde gastrique préchauffé (tableau 1).
11. Maintenir les cultures d’organoïdes à 37 °C dans 5 % de CO₂. Remplacez le milieu de culture par un milieu frais tous les 3-4 jours, en fonction de la croissance des organoïdes. Passez les organoïdes une fois tous les 7 à 10 jours dans un rapport de 1:2 ou 1:3, en fonction de la densité des organoïdes.

3. Maintien et expansion des cultures d’organoïdes

REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement aseptique à l’aide de matériaux et de réactifs stériles.

1. Maintenance et agrandissement
   1. Maintenez les cultures d’organoïdes pendant 7 à 10 jours jusqu’à ce qu’elles soient confluentes à 70-80 %. Récoltez les organoïdes dans du DMEM glacé. Transférez les organoïdes dans des tubes de polystyrène à fond rond de 5 ml.
   2. Centrifuger les organoïdes à 400 × g pendant 5 min à 4 °C pour les granuler les cellules. Retirer délicatement le surnageant et remettre la pastille en suspension dans 1 mL de solution de réactif de dissociation cellulaire préchauffée. Incuber les organoïdes à 37 °C pendant 6 min.
   3. Passez doucement les organoïdes à travers une aiguille de 26 G 4 fois. Ajouter 2 mL de DMEM pour arrêter l’action du réactif de dissociation cellulaire.
   4. Centrifuger les organoïdes à 400 × g pendant 5 min à 4 °C pour granuler les cellules. Jetez soigneusement le surnageant et conservez les cellules sur de la glace.
   5. Remettre en suspension les cellules granulées dans un volume approprié de matrice de membrane basale sur de la glace. Des graines de 30 à 50 μL de la matrice de la membrane basale cellulaire tombent dans des plaques traitées à 24 ou 12 puits traitées par culture cellulaire.
   6. Incuber les plaques à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre aux gouttes de matrice de la membrane cellule-socle de se solidifier en forme de dôme. Recouvrir le dôme de la matrice de la membrane cellule-basale avec un milieu de culture organoïde gastrique préchauffé (voir le tableau 1).
   7. Maintenir les cultures d’organoïdes à 37 °C dans 5 % de CO₂. Remplacez le milieu de culture par un milieu frais tous les 3-4 jours, en fonction de la croissance des organoïdes. Répétez le passage des organoïdes une fois tous les 7 à 10 jours dans un rapport de 1:2 ou 1:3, en fonction de la densité des organoïdes.
2. Expansion de lignées cellulaires dérivées d’organoïdes
   1. Récoltez les organoïdes lorsqu’ils sont confluents à 70-80 %. Nourrissez les cellules adhérentes aux plaques en plastique avec un milieu de culture organoïde gastrique et maintenez la culture en les nourrissant tous les 3-4 jours en fonction de la croissance cellulaire.
   2. Passez les cellules lorsqu’elles atteignent 80-90 % de confluence.
      1. Retirez le milieu de culture et lavez délicatement la plaque avec du DPBS préchauffé. Ajouter 1 mL de réactif de dissociation cellulaire préchauffé.
      2. Incuber les cellules pendant 5 min à 37 °C. Récoltez les cellules dans 2 mL de DMEM.
      3. Centrifuger les cellules à 400 × g pendant 5 min à 4 °C. Retirer le surnageant et remettre la pastille en suspension dans un milieu de culture d’organoïdes gastriques ou de cellules épithéliales gastriques humaines (tableau 1).
   3. Plaquez les cellules de 3.2.2.3 soit dans des plaques recouvertes d’une matrice à membrane basale, soit dans des plaques recouvertes de gélatine. Maintenir les cultures d’organoïdes à 37 °C dans 5 % de CO₂. Remplacez le milieu par un milieu frais tous les deux jours en fonction de la croissance cellulaire. Répétez le passage des cellules une fois tous les 7 à 10 jours dans un rapport de 1:2 ou 1:3, en fonction de la densité cellulaire.
      1. Pour recouvrir les plaques d’une matrice de membrane basale, diluez la matrice dans de l’eau glacée de qualité culture cellulaire dans un rapport de 1:10. Enduire uniformément la plaque avec 1 mL de solution matricielle diluée glacée à l’aide d’un épandeur de cellules et incuber la plaque revêtue à 37 °C pendant 2 h. Retirez la solution d’enrobage restante et laissez sécher la plaque sans le couvercle à l’intérieur du capot de biosécurité pendant 30 min, juste avant de plaquer les cellules.
      2. Pour enrober les plaques de gélatine, enduire uniformément 1 mL d’une solution d’enrobage à base de gélatine glacée. Incuber la plaque revêtue à température ambiante pendant 5 min. Retirez la solution de gélatine restante et plaquez les cellules remises en suspension.

4. Culture de cellules immunitaires à partir de cellules mononucléées du sang périphérique (PBMC)

REMARQUE : Toutes les procédures doivent être effectuées dans un environnement aseptique à l’aide de matériaux et de réactifs stériles.

1. Isolation PBMC
   1. Diluez le sang total avec un volume égal de 1x PBS.
   2. En fonction du volume total de l’échantillon de sang dilué, verser un volume approprié de milieu à gradient de densité (voir le tableau des matériaux) dans un tube de 15 ml.
      REMARQUE : Le rapport recommandé est de 3 mL du milieu à gradient de densité pour 4 mL de l’échantillon de sang dilué.
   3. Superposez soigneusement l’échantillon de sang dilué sur le milieu à gradient de densité. Centrifugeuse à 400 × g pendant 30 min-1 h sans frein.
   4. Après la centrifugation, transférez soigneusement les cellules mononucléées à l’interface dans un nouveau tube conique de 15 ml. Diluer les cellules mononucléées avec 3 volumes de 1x PBS.
   5. Centrifugeuse à 400 × g pendant 10 min. Jetez le surnageant. Répétez l’opération une fois.
   6. Remettre en suspension les cellules granulées dans un milieu approprié pour les applications en aval ou cryoconserver sous forme de stocks congelés.
   7. Au besoin, déterminer le rendement et la viabilité cellulaire des PBMC à l’aide de l’essai d’exclusion du colorant bleu de trypan.
2. Culture de cellules dendritiques humaines
   1. Remettre en suspension les PBMC isolés dans un milieu PBMC (voir le tableau des matériaux et le tableau 1) et les mettre en plaque dans une plaque de culture tissulaire à 24 puits pendant 1 à 2 h à 37 °C dans 5 % de CO₂.
   2. Tapotez fermement la plaque de culture et jetez le milieu de culture épuisé contenant des cellules non adhérentes.
   3. Ajouter le milieu de culture DC (Tableau 1) aux cellules adhérentes. Maintenir les cultures pendant 3 jours à 37 °C dans 5 % de CO₂. Remplacer le milieu surnageant par un milieu de culture frais un jour sur deux.
   4. Le jour 3, remplacez le milieu épuisé par un milieu de maturation DC frais (Tableau 1). Maintenir les cultures pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
3. Culture de lymphocytes T cytotoxiques humains (CTL)
   1. Transvasez 1 mL de PBMC dans un tube à fond rond en polystyrène de 5 mL.
   2. Ajouter 50 μL de Cocktail d’enrichissement (voir le Tableau des matières) dans les PBMC. Incuber pendant 10 min à température ambiante.
   3. Ajouter 150 μL de particules magnétiques (tableau des matériaux) à l’échantillon. Incuber 5 min à température ambiante.
   4. Augmentez le volume de l’échantillon à 2,5 mL avec le tampon de séparation des cellules (Table des matériaux). Placez le tube à fond rond en polystyrène dans un aimant de séparation de cellules (Table des matériaux) pendant 5 minutes pour permettre la séparation des cellules.
   5. Versez la suspension cellulaire enrichie dans un nouveau tube conique de 15 ml. Centrifuger à 300 × g pendant 5 min. Jetez le surnageant.
   6. Remettre en suspension les cellules granulées et la culture dans un milieu de culture CTL (tableau 1) pendant 24 h à 37 °C avec 5 % de CO₂.
4. Culture de cellules suppressives dérivées de myéloïdes humaines (MDSC)
   1. Cultiver des PBMC dans un milieu de culture MDSC (tableau 1) pendant 7 jours à 37 °C dans 5 % de CO₂ à enrichir pour les MDSC. Remplacer le milieu surnageant par un milieu de culture frais tous les deux jours.
5. Co-culture de DC et de CTL
   1. Prélever du milieu conditionné dans les cultures d’organoïdes.
   2. Retirez délicatement 50 % du milieu de la culture DC mature et remplacez-le par un milieu conditionné dérivé d’organoïdes.
   3. Incuber les DC avec le milieu conditionné dérivé d’organoïdes pendant 2 h à 37 °C dans 5 % de CO₂.
   4. Récoltez les DC faiblement adhérents et centrifugez-les à 300 × g pendant 5 min à 4 °C. Retirez le surnageant, remettez la pastille en suspension dans le milieu de co-culture RPMI et rajoutez cette suspension cellulaire dans le même puits.
   5. Récolter les CTL de la même lignée de patients et les transférer dans les DC matures. Poursuivre la co-culture DC-CTL (tableau 1) pendant 72 h à 37 °C avec 5 % de CO2.

5. Établir des co-cultures de cellules organoïdes/immunitaires

1. Isoler les CTL à partir de co-cultures de DC et de CTL à l’aide d’une trousse (voir le tableau des matériaux) comme décrit précédemment à la section 4.3.
2. Incuber les CTL avec 5 μM de diacétate de carboxyfluorescéine ester succinimidylique (CFSE) à 37 °C pendant 20 min.
   REMARQUE : Le CFSE est un colorant excitable au laser bleu utilisé pour la surveillance cytométrique en flux des divisions cellulaires.
3. Récoltez les organoïdes et mélangez-les avec des CTL marqués CFSE. En maintenant le rapport CTL/organoïde à 50 000 CTL pour 200 organoïdes, remettez les organoïdes en suspension dans un volume approprié de matrice de membrane basale décongelée sur de la glace. Les graines se présentent sous forme de matrice de membrane cellule-basale de 25 μL dans des plaques de culture tissulaire à 24 puits.
   REMARQUE : Pour les conditions expérimentales nécessitant des MDSC, mélanger les MDSC avec les organoïdes et les CTL marqués CFSE avant l’ensemencement. Le rapport MDSC/CTL doit être de 4:1.
4. Incuber les plaques à 37 °C pendant 15 minutes pour permettre à la matrice de la membrane cellule-socle de se solidifier.
5. Superposez les gouttes de matrice de la membrane cellule-socle avec un milieu de culture organoïde préchauffé.
6. Maintenir les co-cultures de cellules organoïdes/immunitaires à 37 °C dans 5 % de CO₂ jusqu’à l’analyse.

Une fois terminés, les organoïdes gastriques apparaissent sous forme de sphères dans le puits, généralement dans les 2 à 4 jours suivant l’intégration (Figure 1). La figure 1A montre une culture d’organoïdes gastriques florissante qui présente une membrane régulière. Les organoïdes tumoraux présentent souvent une morphologie divergente qui est unique à l’échantillon du patient. Les cultures infructueuses apparaîtront denses ou ne présenteront aucune croissance à partir de la digestion initiale des tissus (figure 1B). Les cultures robustes et en croissance active seront adoptées et étendues avec succès, comme détaillé dans le protocole. Nous avons souvent observé la migration et l’attachement d’une sous-population de cellules à la base de la plaque de culture (Figure 1C). Selon le protocole, ces cellules attachées peuvent être passées et développées sur des plaques de culture cellulaire recouvertes de gélatine (Figure 1D).

Figure 1 : Organoïdes gastriques issus de biopsies. Images représentatives (A) d’une culture d’organoïdes gastriques robustes et (B) d’une culture malsaine d’organoïdes mourants. (C) Les cellules gastriques migrent souvent et se fixent à la base de la boîte de culture. (D) Ces cellules gastriques peuvent être traversées. Barres d’échelle = 100 μm. Veuillez cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Ce protocole décrit une méthode de culture de DC, de MDSC et de CTL à partir de PBMC de patients. La figure 2 représente la morphologie des cultures de cellules immunitaires dérivées de PBMC. Les DC en culture présentaient une forme irrégulière avec des processus dendritiques étendus et allongés (Figure 2A). Les MDSC se présentent généralement sous la forme de grandes cellules mononucléées avec un cytoplasme granulaire basophile (Figure 2B). La morphologie des CTL en culture est illustrée à la figure 2C. Les MDSC granulocytaires peuvent être caractérisés par cytométrie en flux à l’aide d’une stratégie de contrôle identifiant les cellules HLA-DR/CD14^-, CD33/CD11b/CD15⁺ .

Figure 2 : Cellules immunitaires humaines cultivées à partir de PBMC. Micrographies optiques représentatives de (A) cellules dendritiques avant et après le protocole de maturation, (B) cellules suppressives dérivées de myéloïdes et (C) lymphocytes T cytotoxiques. Barres d’échelle = 100 μm. (D) Courbes de niveau cytométriques en flux représentatives montrant les marqueurs des cellules immunitaires. Abréviations : PBMC = cellules mononucléées du sang périphérique ; DC = cellules dendritiques ; MDSC = cellules suppressives dérivées de myéloïdes ; CTLs = lymphocytes T cytotoxiques ; APC = allophycocyanine ; CD = cluster de différenciation ; PE = phycoérythrine ; H = hauteur du pic ; W = largeur de la crête ; PerCP = Péridinine-chlorophylle-protéine ; DAPI = 4′,6-diamidino-2-phénylindole ; FITC = isothiocyanate de fluorescéine. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

L’immunofluorescence de la co-culture organoïde/cellule immunitaire met en évidence la présence de CTLs (CD8⁺, vert) avec des organoïdes tumoraux (-L1⁺, rouge) (Figure 3A-D). Une image rendue en trois dimensions est présentée dans la Vidéo 1. La microscopie time-lapse démontre la migration des MDSC et des CTL vers les organoïdes gastriques (vidéo 2) et la mort des organoïdes dans les cultures traitées avec un inhibiteur de point de contrôle (vidéo 3).

Figure 3 : Co-cultures d’organoïdes et de cellules immunitaires du cancer gastrique. Coloration par immunofluorescence d’une co-culture représentative de cellules organoïdes/immunitaires montrant l’expression de cellules (A) CD8⁺ (vertes), (B)-L1 (rouges) et (C) Hoechst (bleues). Une image fusionnée est illustrée en (D). (E) Coloration par immunofluorescence d’une co-culture représentative de cellules organoïdes/immunitaires montrant l’expression des MDSC (CD11b, vert) et de la cadhérine E (rouge). Barres d’échelle = 50 μm. Abréviations : CD = groupe de différenciation ; -L1 = mort cellulaire programmée-ligand 1 ; MDSC = cellules suppressives dérivées de myéloïdes ; Hoechst = Hoechst 33258. Veuillez cliquer ici pour voir une version agrandie de cette figure.

Vidéo 1 : Une image tridimensionnelle rendue de la co-culture d’organoïdes/cellules immunitaires du cancer gastrique contenant des cellules tumorales-L1⁺ (rouge) et des lymphocytes CD8⁺ (vert). Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 2 : Microscopie time-lapse d’une co-culture de cellules organoïdes/immunitaires résistantes au traitement par inhibiteur de point de contrôle. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Vidéo 3 : Microscopie time-lapse d’une co-culture de cellules organoïdes/immunitaires sensibles au traitement par inhibiteur de point de contrôle. Veuillez cliquer ici pour télécharger cette vidéo.

Tableau 1 : Composition des milieux et des solutions. Veuillez cliquer ici pour télécharger ce tableau.

Nous présentons l’utilisation de la co-culture d’organoïdes et de cellules immunitaires autologues du cancer gastrique d’origine humaine qui peut être utilisée comme modèle préclinique pour prédire l’efficacité des thérapies ciblées afin d’améliorer les résultats du traitement et le pronostic du patient. Bien que des co-cultures d’organoïdes cancéreux avec des cellules immunitaires aient été rapportées, il s’agit du premier rapport d’un tel système de co-culture pour l’étude du cancer gastrique. De nombreux autres efforts de profilage des patients basés sur les organoïdes sont bien développés dans plusieurs institutions, y compris des modèles de co-culture. À notre connaissance, trois grands systèmes de co-culture ont été développés, qui présentent les caractéristiques suivantes : 1) Organoïdes du cancer du pancréas co-cultivés avec des cellules immunitaires à l’extérieur du dôme matriciel de la membrane basale⁶. L’adhésion des cellules immunitaires/tumorales serait importante dans un système étudiant l’interaction entre-L1 et-1. 2) Co-cultures autologues de poumons non à petites cellules et de cancer colorectal, organoïdes/lymphocytes du sang périphérique²¹.

Toutes les expériences réalisées dans cette étude ont été menées à l’aide de plaques recouvertes d’anti-CD28 pour activer les lymphocytes T, et des co-cultures ont été réalisées en présence d’interleukine (IL)-2 pour maintenir la prolifération des lymphocytes T. Bien que toutes les cultures in vitro aient des limites et ne représentent pas entièrement des conditions physiologiques, les lymphocytes T CD8⁺ de ces cultures sont activés à l’aide de l’antigène tumoral du patient et des cellules présentatrices d’antigène dendritique pour activer les lymphocytes T. Cette approche peut être considérée comme plus proche de ce qui se passe au sein de l’EUT. 3) La méthode d’interface air-liquide (ALI) pour propager des organoïdes dérivés de patients²². Les chercheurs affirment que les organoïdes ont été passés tous les 14 à 30 jours et, dans certains cas, le milieu a été complété par de l’IL-2 humaine recombinante. Tout d’abord, le maintien et l’expansion des lymphocytes T CD8⁺ cytotoxiques nécessitent plus que le simple ajout d’IL-2 au milieu ex vivo. Deuxièmement, pour la culture à long terme de lymphocytes T CD8⁺ , un CD3/CD28 initial suivi d’un maintien dans l’IL-2 pendant 2 à 3 semaines est nécessaire. Cela peut être considéré comme une approche artificielle de l’activation des lymphocytes T et non pertinent dans le cadre de l’EUT.

Les limites actuelles des cultures d’organoïdes dérivées de tissus tumoraux justifiaient le raffinement de ces cultures avec des cellules immunitaires. Par exemple, la probabilité d’invasion tumorale est considérablement augmentée chez les patients présentant un compartiment stromal dense, comme celui observé dans le cancer gastrique invasif²³. Ainsi, il peut être difficile pour l’isolement et la culture d’organoïdes de cellules immunitaires à partir de tissu tumoral natif du patient avec un compartiment stromal dense, en particulier chez les patients de mauvais pronostic. Il est important de noter que les données publiées de séquençage de l’ARN ont montré que, bien qu’il existe une similitude phénotypique entre les organoïdes et le tissu tumoral du patient, le compartiment immunitaire est essentiellement manquant^{de 24}. Ainsi, l’une des limites des cultures actuelles d’organoïdes et de lignées cellulaires est l’absence de la composante immunitaire présente dans l’EUT du patient.

Les étapes critiques du protocole comprennent la génération d’une culture d’organoïdes robuste et de cellules immunitaires. Le problème le plus courant observé avec les cultures d’organoïdes dérivées de patients est la contamination bactérienne ou fongique. Ainsi, il est également essentiel d’inclure des agents antifongiques et des antibiotiques lors du lavage des tissus avant la digestion. Il y a aussi des limites de la culture qui seront abordées dans les expériences futures. Tout d’abord, l’hétérogénéité des cultures d’organoïdes peut être considérée comme une limitation lors de l’étude de la population cellulaire spécifique ciblée par les immunothérapies et les chimiothérapies. Il est souvent difficile de déterminer, à partir de ces cultures, si un seul organoïde est clonal et dérivé d’une seule cellule. Une approche future pourrait consister à utiliser une approche analytique sur cellule unique pour compléter les expériences in vitro qui testent des thérapies ciblées. Deuxièmement, l’hétérogénéité des cellules au sein de la culture peut ne pas refléter le microenvironnement tumoral exact du patient. La complexité de ces cultures peut être accrue en incorporant des cellules fondamentales supplémentaires, notamment des macrophages et des fibroblastes associés au cancer. Cependant, la co-culture de cellules organoïdes/immunitaires a été utilisée ici pour étudier une question de recherche ciblée concernant les interactions fondamentales entre les tumeurs et les cellules immunitaires pertinentes pour le rôle des MDSC en tant que cellules immunosuppressives. Troisièmement, des échantillons sont prélevés sur le site de la tumeur primaire. Le tissu est prélevé sur la décision du pathologiste. Les recherches futures se concentreront sur les organoïdes dérivés de sites métastatiques, ce qui pourrait nous permettre de déchiffrer les différences entre les organoïdes cancéreux en fonction de l’endroit où le tissu a été prélevé. Dans l’ensemble, ce système de culture peut être d’un grand intérêt et approprié pour prédire l’efficacité du traitement et l’issue du patient dans d’autres cancers gastro-intestinaux, y compris le côlon et le pancréas.

Les auteurs n’ont rien à divulguer.

Ce travail a été soutenu par la subvention NIH (NIAID) 5U19AI11649105 (PIs : Weiss and Wells, Project Leader 1 : Zavros) et NIH (NIDDK) 2 R01 DK083402-06A1 (PI : Zavros). Ce projet a été soutenu en partie par la subvention PHS P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) du Digestive Diseases Research Core Center à Cincinnati et 5P30CA023074 UNIVERSITY OF ARIZONA CANCER CENTER – CANCER CENTER SUPPORT GRANT (PI : Sweasy). Nous tenons à remercier Chet Closson (Live Microscopy Core, Université de Cincinnati) et les anciens membres du laboratoire Zavros, les Drs Nina Steele et Loryn Holokai, pour leur contribution au développement du système de culture d’organoïdes. Nous remercions sincèrement les patients qui ont consenti au don de tissus et de sang pour le développement des co-cultures d’organoïdes gastriques et de cellules immunitaires. Sans leur volonté de participer à l’étude, ce travail ne serait pas possible.