نموذج الزراعة المشتركة للعضيات العضوية/الخلايا المناعية لسرطان المعدة الذاتي قبل السريري المشتق من الإنسان للتنبؤ بفعالية العلاجات المستهدفة

تتمثل أهداف البروتوكول في استخدام هذا النهج من أجل 1) فهم دور البيئة المكروية لورم المعدة المثبط للمناعة و 2) التنبؤ بفعالية استجابة المريض ، وبالتالي زيادة معدل بقاء المرضى.

تتفاعل الأورام التي تعبر عن ترابط موت الخلايا المبرمج 1 (PD-L1) مع بروتين موت الخلايا المبرمج 1 (PD-1) على الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا CD8 + (CTLs) للتهرب من المراقبة المناعية مما يؤدي إلى تثبيط انتشار CTL ، والبقاء على قيد الحياة ، ووظيفة المستجيب ، وبالتالي استمرار السرطان. ما يقرب من 40٪ من سرطانات المعدة تعبر عن PD-L1 ، ومع ذلك فإن معدل الاستجابة للعلاج المناعي هو 30٪ فقط. نقدم استخدام الزراعة المشتركة للخلايا العضوية / المناعية لسرطان المعدة الذاتي المشتق من الإنسان كنموذج قبل سريري قد يتنبأ بفعالية العلاجات المستهدفة لتحسين نتائج مرضى السرطان. على الرغم من الإبلاغ عن الثقافات العضوية المشتركة للسرطان مع الخلايا المناعية ، إلا أن نهج الزراعة المشتركة هذا يستخدم مستضد الورم لنبض الخلايا المتغصنة العارضة للمستضد. ثم يتم زراعة الخلايا المتغصنة (DCs) بخلايا CD8 + T الخاصة بالمريض لتوسيع النشاط المحلل للخلايا وتكاثر هذه الخلايا الليمفاوية التائية قبل الزراعة المشتركة. بالإضافة إلى ذلك ، يتم التحقيق في التمايز والوظيفة المثبطة للمناعة للخلايا المثبطة المشتقة من النخاع (MDSCs) في الثقافة داخل نظام الزراعة المشتركة هذا. قد يكون هذا النهج العضوي ذا أهمية واسعة ومناسب للتنبؤ بفعالية العلاج ونتائج المريض في أنواع السرطان الأخرى ، بما في ذلك سرطان البنكرياس.

سرطان المعدة هو خامس أكثر أنواع السرطان شيوعا في جميع أنحاء ^{العالم 1}. أدى التشخيص والعلاج الفعالان لبكتيريا الملوية البوابية (H. pylori) إلى انخفاض معدل الإصابة بسرطان المعدة في الولايات المتحدة ². ومع ذلك ، فإن معدل البقاء على قيد الحياة لمدة 5 سنوات للمرضى الذين تم تشخيص إصابتهم بهذا الورم الخبيث هو 29٪ فقط ، مما يجعل سرطان المعدة تحديا طبيا مهما³. الغرض من الأساليب المعروضة هنا هو تطوير نهج للتنبؤ باستجابات العلاج المناعي لدى المرضى الفرديين بدقة. تتكون الأورام الصلبة من خلايا سرطانية وأنواع مختلفة من الخلايا اللحمية والبطانية والمكونة للدم ، بما في ذلك البلاعم والخلايا المثبطة المشتقة من النخاع (MDSCs) والخلايا الليمفاوية (تمت مراجعتها في ^4،5). تؤثر التفاعلات بين الخلايا الجذعية السرطانية والبيئة المكروية للورم (TME) بشكل كبير على خصائص الورم واستجابة المريض للعلاج. يسعى هذا النهج جاهدا للسماح للباحثين باكتساب المعرفة لتطوير الأدوية قبل السريرية واكتشاف المؤشرات الحيوية للعلاج الشخصي لسرطان المعدة.

تستخدم الطريقة المعروضة هنا الثقافات العضوية الذاتية / الخلايا المناعية المشتقة من الإنسان والتي تم إنشاؤها من مرضى سرطان المعدة لفهم الدور المثبط للمناعة ل MDSCs. يتم تقديم نموذج قبل السريري قد يتنبأ بفعالية العلاجات المستهدفة لتحسين بقاء المرضى. تم الإبلاغ على نطاق واسع عن الثقافات العضوية المشتركة للسرطان مع الخلايا المناعية في مجال سرطان البنكرياس^{6،7،8،9،10}. ومع ذلك ، لم يتم الإبلاغ عن مثل هذه الثقافات المشتركة لدراسة سرطان المعدة. بشكل عام ، توضح هذه الطريقة الزراعة المشتركة للخلايا المناعية المشتقة من الإنسان الذاتية داخل نفس بيئة المصفوفة مثل العضيات السرطانية ، مما يسمح للخلايا المناعية بالتلامس مع العضيات المستهدفة.

أفادت الدراسة التي أجراها Tiriac et ^al.10 أن عضيات سرطان البنكرياس المشتقة من المريض ، والتي أظهرت استجابات غير متجانسة للعلاج الكيميائي القياسي للرعاية ، يمكن تجميعها في توقيعات التعبير الجيني القائم على العضوية للحساسية الكيميائية التي يمكن أن تتنبأ بتحسن استجابات المريض للعلاج الكيميائي. اقترح الباحثون أن التنميط الجزيئي والعلاجي المشترك للعضيات لسرطان البنكرياس قد يتنبأ بالاستجابة السريرية¹⁰. أظهرت بيانات التجارب السريرية المشتركة من Yao et ^al.11 أيضا أن العضيات المشتقة من سرطان المستقيم تمثل فيزيولوجيا مرضية مماثلة وتغيرات جينية مشابهة لأنسجة ورم المريض استجابة للإشعاع الكيميائي. وبالتالي ، من الضروري استخدام الثقافات العضوية في سياق الخلايا المناعية للمريض والنمط الظاهري المناعي للورم عند استخدام هذه الثقافات كنماذج تنبؤية للعلاج.

تمنع الأورام التي تعبر عن PD-L1 والتي تتفاعل مع PD-1 تكاثر الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا CD8 + ، والبقاء على قيد الحياة ، ووظيفة المستجيب ^12،13،14. في حين أن ما يقرب من 40٪ من سرطانات المعدة تعبر عن PD-L1 ، فإن 30٪ فقط من هؤلاء المرضى يستجيبون للعلاج المناعي^15،16،17. تستخدم الأجسام المضادة ل PD1 في التجارب السريرية لعلاج سرطان المعدة^18،19،20. ومع ذلك ، لا توجد حاليا نماذج قبل السريرية تسمح باختبار الفعالية العلاجية لكل مريض. من المحتمل أن يسمح تحسين الثقافة العضوية بحيث يتم تضمين الخلايا المناعية للمريض في النظام بتحديد فردي لفعالية العلاج المناعي.

تم الحصول على الموافقة على جمع الأنسجة التي تم أخذ خزعة بشرية من أورام المرضى (1912208231R001 ، برنامج حماية الأشخاص بجامعة أريزونا. رقم بروتوكول IRB: 1099985869R001 ، برنامج حماية الأشخاص بجامعة أريزونا TARGHETS).

1. إنشاء عضيات المعدة المشتقة من المريض من الخزعات

1. اجمع 1-2 مم من الأنسجة البشرية المأخوذة من الخزعة من منطقة الورم لمرضى سرطان المعدة الذين يخضعون لتنظير المعدة والاثني عشر للمريء في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS) (الجدول 1).
   ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات من الآن فصاعدا في بيئة معقمة باستخدام مواد وكواشف معقمة.
2. افرم الأنسجة التي تم أخذ الخزعة باستخدام شفرات مشرط على طبق بتري. انقل الأنسجة المفرومة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل وأضف 5-10 مل من 1x PBS.
3. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. تخلص من المادة الطافية. أضف 1-2 مل من محلول الهضم الدافئ مسبقا (الجدول 1) إلى الأنسجة المحببة.
4. احتضن عند 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة ، اعتمادا على حجم المناديل المفرومة. راقب حالة الهضم من خلال البحث تحت المجهر بحثا عن مجموعات الخلايا الصغيرة كل 5-10 دقائق.
5. أوقف عملية الهضم عن طريق تخفيف 5 أضعاف باستخدام وسط النسر المعدل البارد من Advanced Dulbecco / وسط Ham's F-12 (Advanced DMEM / F-12). إذا كانت كتل من المواد غير المهضومة مرئية ، فقم بتصفية الأنسجة من خلال مرشحات 30 ميكرومتر. اجمع التدفق.
6. الطرد المركزي التدفق من خلال 300 × جم لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة لتكسير الخلايا. تخلص من المادة الطافية.
7. أعد تعليق الخلايا المحببة (10,000-100,000) في حجم مناسب (2-4 مل) من مصفوفة الغشاء القاعدي المذابة (انظر جدول المواد) على الجليد. تسقط البذور على شكل 30-50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الخلية القاعدية في ألواح استزراع 24 بئرا.
8. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لقطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بالتصلب. قم بتراكب قطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بوسط ثقافة العضوية المعدية الدافئ مسبقا (الجدول 1).
9. حافظ على المزارع العضوية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. استبدل وسط الثقافة بوسط طازج كل 3-4 أيام ، اعتمادا على نمو العضوية. قم بتمرير العضيات مرة كل 7-10 أيام بنسبة 1: 3.

2. إنشاء عضيات المعدة المشتقة من المريض من العينات الجراحية

1. اجمع أنسجة سرطان المعدة البشرية من العينات المقطوعة لمرضى سرطان المعدة أثناء العمليات الجراحية في 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات من Dulbecco (DPBS) مكمل بالمضادات الحيوية (الجدول 1).
   ملاحظة: يجب معالجة جميع الإجراءات فيما يلي في خزانة السلامة البيولوجية ، مع الحفاظ على بيئة معقمة واستخدام مواد وكواشف معقمة.
2. افرم الأنسجة المقطوعة باستخدام شفرات مشرط جراحية على طبق بتري. اغسل المناديل المفرومة ب 5-10 مل من 1x DPBS التي تحتوي على مضادات حيوية.
3. انقل الأنسجة إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مل. أضف 10 مل من المخزن المؤقت لتجريد حمض رباعي الأسيتيك الإيثيلين ديامين (EDTA) إلى الأنسجة المفرومة. راقب حالة الهضم كل 5-10 دقائق. احتضان الأنبوب في شاكر 37 درجة مئوية لمدة 10 دقائق.
4. دع الأنسجة تستقر في قاع الأنبوب ، وقم بإزالة المخزن المؤقت EDTA دون إزعاج الأنسجة ، وأضف 10 مل من محلول EDTA الجديد. احتضان الأنبوب في شاكر 37 درجة مئوية لمدة 5 دقائق.
5. دع الأنسجة تستقر في قاع الأنبوب. قم بإزالة المخزن المؤقت EDTA واغسل الأنسجة مرتين (اتبع الخطوة 2.4) ب 10 مل من DMEM / F-12 المتقدم المكمل بالمضادات الحيوية (بدون أجهزة الطرد المركزي) (الجدول 1).
6. أضف 5-10 مل من محلول الهضم الدافئ مسبقا (الجدول 1) إلى الأنسجة ، اعتمادا على حجم الأنسجة. احتضان الأنبوب عند 37 درجة مئوية لمدة 15-30 دقيقة مع تحريض خفيف ، اعتمادا على حجم وملمس الأنسجة. تحقق من ظهور مجموعات الخلايا تحت المجهر كل 10 دقائق.
7. أوقف عملية الهضم عن طريق التخفيف مرتين باستخدام المضادات الحيوية المتقدمة DMEM/F-12 الباردة. قم بتصفية الأنسجة غير المهضومة من خلال مرشحات 40 ميكرومتر واجمع التدفق.
8. الطرد المركزي التدفق من خلال 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا. تخلص من المادة الطافية ، واغسل الخلايا ب 1x DPBS بارد بالإضافة إلى المضادات الحيوية عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. تخلص من المادة الطافية بعناية ، وقم بتخزين الخلايا على الجليد.
9. أعد تعليق الخلايا المحببة في حجم مناسب من مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. تسقط مصفوفة غشاء الخلية القاعدية للبذور 30-50 ميكرولتر في ألواح معالجة بالخلايا المزروعة 24 أو 12 بئرا.
10. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لقطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بالتصلب كقبة. قم بتراكب قبة مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بوسط ثقافة عضوي معدي مسخن مسبقا (الجدول 1).
11. الحفاظ على المزارع العضوية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. استبدل وسط الثقافة بوسط طازج كل 3-4 أيام ، اعتمادا على نمو العضوية. قم بتمرير العضيات مرة كل 7-10 أيام بنسبة 1: 2 أو 1: 3 ، بناء على الكثافة العضوية.

3. صيانة وتوسيع الثقافات العضوية

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات في بيئة معقمة باستخدام مواد وكواشف معقمة.

1. الصيانة والتوسع
   1. حافظ على المزارع العضوية لمدة 7-10 أيام حتى تتماسك بنسبة 70-80٪. حصاد العضيات في DMEM المثلج. انقل العضيات إلى 5 مل أنابيب البوليسترين المستديرة القاع.
   2. الطرد المركزي للعضيات عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لخلايا الحبيبات. قم بإزالة المادة الطافية بعناية وأعد تعليق الحبيبات في 1 مل من محلول كاشف تفكك الخلايا الدافئ مسبقا. احتضان العضيات عند 37 درجة مئوية لمدة 6 دقائق.
   3. مرر العضيات برفق عبر إبرة 26 جم 4 مرات. أضف 2 مل من DMEM لإيقاف عمل كاشف تفكك الخلية.
   4. الطرد المركزي للعضيات عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية لحبيبات الخلايا. تخلص من المادة الطافية بعناية وقم بتخزين الخلايا على الجليد.
   5. أعد تعليق الخلايا المحببة في حجم مناسب من مصفوفة الغشاء القاعدي على الجليد. تسقط البذور 30-50 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الخلية القاعدية في 24 أو 12 بئرا من الصفائح المعالجة بزراعة الخلايا.
   6. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لقطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بالتصلب كقبة. قم بتراكب قبة مصفوفة غشاء الخلية - الخلية القاعدية بوسط ثقافة عضوية معدية مدفأة مسبقا (انظر الجدول 1).
   7. الحفاظ على المزارع العضوية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. استبدل وسط الثقافة بوسط طازج كل 3-4 أيام ، اعتمادا على نمو العضوية. كرر مرور العضيات مرة كل 7-10 أيام بنسبة 1: 2 أو 1: 3 ، بناء على الكثافة العضوية.
2. توسيع خطوط الخلايا المشتقة من العضوية
   1. احصد العضيات عندما تكون متقاربة بنسبة 70-80٪. قم بتغذية الخلايا الملتصقة بالصفائح البلاستيكية بوسط زراعة العضوية المعدية والحفاظ على المزرعة عن طريق إطعامها كل 3-4 أيام حسب نمو الخلية.
   2. قم بتمرير الخلايا عندما تصل إلى 80-90٪ التقاء.
      1. قم بإزالة وسط الثقافة واغسل الطبق برفق باستخدام DPBS مسخن مسبقا. أضف 1 مل من كاشف تفكك الخلايا الدافئ مسبقا.
      2. احتضان الخلايا لمدة 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. حصاد الخلايا في 2 مل من DMEM.
      3. الطرد المركزي للخلايا عند 400 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الحبيبات في وسط زراعة العضوية المعدية أو وسط زراعة الخلايا الظهارية في المعدة البشرية (الجدول 1).
   3. قم بلوحة الخلايا من 3.2.2.3 إما في ألواح مغلفة بمصفوفة غشاء القاعدي أو مغلفة بالجيلاتين. الحفاظ على المزارع العضوية عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. استبدل الوسط بوسط طازج كل يوم بديل حسب نمو الخلية. كرر مرور الخلايا مرة كل 7-10 أيام بنسبة 1: 2 أو 1: 3 ، بناء على كثافة الخلية.
      1. لطلاء الألواح بمصفوفة غشاء القاعدة ، قم بتخفيف المصفوفة في ماء درجة زراعة الخلايا المثلجة بنسبة 1:10. قم بتغطية اللوحة بشكل موحد ب 1 مل من محلول المصفوفة المخفف المثلج باستخدام موزع الخلايا ، واحتضان الصفيحة المطلية عند 37 درجة مئوية لمدة ساعتين. قم بإزالة محلول الطلاء المتبقي واترك اللوحة تجف بدون غطاء داخل غطاء السلامة الحيوية لمدة 30 دقيقة ، قبل طلاء الخلايا مباشرة.
      2. لطلاء الألواح بالجيلاتين ، قم بتغطية اللوحة بشكل موحد ب 1 مل من محلول طلاء قائم على الجيلاتين المثلج. احتضان اللوحة المطلية في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. قم بإزالة محلول الجيلاتين المتبقي وقم بلوحة الخلايا المعلقة.

4. زراعة الخلايا المناعية من خلايا الدم المحيطية أحادية النواة (PBMCs)

ملاحظة: يجب إجراء جميع الإجراءات في بيئة معقمة باستخدام مواد وكواشف معقمة.

1. عزل PBMC
   1. تمييع الدم الكامل بحجم متساو من 1x PBS.
   2. اعتمادا على الحجم الكلي لعينة الدم المخففة ، قم بتوزيع حجم مناسب من وسط تدرج الكثافة (انظر جدول المواد) في أنبوب سعة 15 مل.
      ملاحظة: النسبة الموصى بها هي 3 مل من وسط تدرج الكثافة إلى 4 مل من عينة الدم المخففة.
   3. ضع عينة الدم المخففة بعناية على وسط تدرج الكثافة. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 30 دقيقة - 1 ساعة بدون فرامل.
   4. بعد الطرد المركزي ، قم بنقل الخلايا أحادية النواة بعناية في الواجهة إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. تمييع الخلايا أحادية النواة ب 3 أحجام من 1x PBS.
   5. جهاز طرد مركزي عند 400 × جم لمدة 10 دقائق. تخلص من المادة الطافية. كرر مرة واحدة.
   6. قم بتعليق الخلايا المحببة في وسط مناسب للتطبيقات النهائية أو حفظها بالتبريد كمخزونات مجمدة.
   7. إذا لزم الأمر ، حدد العائد وصلاحية الخلية ل PBMCs باستخدام مقايسة استبعاد صبغة التريبان الزرقاء.
2. ثقافة الخلايا المتغصنة البشرية
   1. أعد تعليق PBMCs المعزولة في وسط PBMC (انظر جدول المواد والجدول 1) وقم بوضعها في صفيحة زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
   2. اضغط بقوة على لوحة الاستزراع وتخلص من وسط الاستزراع المستهلك الذي يحتوي على خلايا غير ملتصقة.
   3. أضف وسط ثقافة التيار المستمر (الجدول 1) إلى الخلايا الملتصقة. حافظ على المزارع لمدة 3 أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂. استبدل الوسط الطافي بوسط استزراع طازج في أيام بديلة.
   4. في اليوم 3 ، استبدل الوسط المستنفد بوسط نضج DC جديد (الجدول 1). الحفاظ على المزارع لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂.
3. مزرعة الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا البشرية (CTLs)
   1. انقل 1 مل من PBMCs إلى أنبوب دائري القاع من البوليسترين سعة 5 مل.
   2. أضف 50 ميكرولتر من كوكتيل التخصيب (انظر جدول المواد) إلى PBMCs. احتضن لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   3. أضف 150 ميكرولتر من الجسيمات المغناطيسية (جدول المواد) إلى العينة. احتضن لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
   4. قم بزيادة حجم العينة إلى 2.5 مل باستخدام المخزن المؤقت لفصل الخلايا (جدول المواد). ضع أنبوب البوليسترين ذو القاع الدائري في مغناطيس فصل الخلايا (جدول المواد) لمدة 5 دقائق لتمكين فصل الخلايا.
   5. صب معلق الخلية المخصب في أنبوب مخروطي جديد سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق. تخلص من المادة الطافية.
   6. أعد تعليق الخلايا المحببة والزراعة في وسط زراعة CTL (الجدول 1) لمدة 24 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂.
4. زراعة الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع البشري (MDSCs)
   1. استزراع PBMCs في وسط استزراع MDSC (الجدول 1) لمدة 7 أيام عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO₂ لإثراء MDSCs. استبدل الوسط الطافي بوسط استزراع طازج في أيام بديلة.
5. الثقافة المشتركة بين البلدان النامية وشبكات التبادل التجاري
   1. اجمع الوسط المكيف من الثقافات العضوية.
   2. قم بإزالة 50٪ من الوسط برفق من ثقافة التيار المستمر الناضجة واستبدله بوسط مكيف مشتق من العضوية.
   3. احتضان التيار المستمر مع الوسط المكيف المشتق من العضوية لمدة ساعتين عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}.
   4. احصد التيار المستمر غير الملتصق بشكل فضفاض وقم بطردها عند 300 × جم لمدة 5 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المادة الطافية ، وأعد تعليق الحبيبات في وسط الزراعة المشتركة RPMI ، وأضف تعليق الخلية هذا مرة أخرى إلى نفس البئر.
   5. قم بحصاد CTLs من نفس خط المريض ونقلها إلى DCs الناضجة. استمر في الاستزراع المشترك DC-CTL (الجدول 1) لمدة 72 ساعة عند 37 درجة مئوية في 5٪ CO2.

5. إنشاء الثقافات المشتركة للخلايا العضوية / المناعية

1. عزل CTLs عن الثقافات المشتركة للDCs و CTLs باستخدام مجموعة (انظر جدول المواد) كما هو موضح سابقا في القسم 4.3.
2. احتضان CTLs مع 5 ميكرومتر كربوكسي فلوريسين ثنائي أسيتات إستر السكسينيمديل (CFSE) عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة.
   ملاحظة: CFSE عبارة عن صبغة قابلة للإثارة بالليزر الأزرق تستخدم لمراقبة قياس التدفق الخلوي لانقسامات الخلايا.
3. احصد العضيات واخلطها مع CTLs المسمى CFSE. مع الحفاظ على نسبة CTL / العضويات عند 50,000 CTLs لكل 200 عضوية ، قم بتعليق العضيات في حجم مناسب من مصفوفة الغشاء القاعدي المذابة على الجليد. تسقط البذور على شكل 25 ميكرولتر من مصفوفة غشاء الخلية القاعدية في ألواح زراعة الأنسجة المكونة من 24 بئرا.
   ملاحظة: بالنسبة للظروف التجريبية التي تتطلب MDSCs ، امزج MDSCs مع العضيات و CTLs المسمى CFSE قبل البذر. يجب أن تكون نسبة MDSC / CTL 4: 1.
4. احتضان الألواح عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة للسماح لقطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بالتصلب.
5. قم بتراكب قطرات مصفوفة غشاء الخلية القاعدية بوسط ثقافة عضوي دافئ مسبقا.
6. حافظ على المزارع العضوية / المناعية المشتركة عند 37 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ حتى التحليل.

عند الانتهاء ، تظهر عضيات المعدة ككرات داخل البئر ، عادة في غضون 2-4 أيام بعد التضمين (الشكل 1). يوضح الشكل 1 أ ثقافة عضية معدية مزدهرة تظهر غشاءا منتظما. غالبا ما تظهر عضيات الورم مورفولوجيا متباينة فريدة من نوعها لعينة المريض. ستظهر الثقافات غير الناجحة كثيفة أو لا تظهر أي نمو من الهضم الأولي للأنسجة (الشكل 1 ب). سيتم تمرير الثقافات القوية والنمو بنشاط وتوسيعها بنجاح كما هو مفصل في البروتوكول. لقد لاحظنا في كثير من الأحيان هجرة وتعلق مجموعة سكانية فرعية من الخلايا بقاعدة لوحة الثقافة (الشكل 1 ج). باتباع البروتوكول ، يمكن تمرير هذه الخلايا المرفقة وتوسيعها إلى ألواح زراعة الخلايا المطلية بالجيلاتين (الشكل 1 د).

الشكل 1: عضيات المعدة المشتقة من الخزعات. صور تمثيلية ل (أ) ثقافة عضية قوية في المعدة و (ب) ثقافة غير صحية للعضيات المحتضرة. (ج) غالبا ما تهاجر خلايا المعدة وتلتصق بقاعدة طبق الثقافة. (د) قد يتم مرور خلايا المعدة هذه. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يصف هذا البروتوكول طريقة لزراعة DCs و MDSCs و CTLs من PBMCs للمريض. يمثل الشكل 2 مورفولوجيا مزارع الخلايا المناعية المشتقة من PBMCs. أظهرت DCs في الثقافة شكلا غير منتظم مع عمليات شجيرية واسعة النطاق وممدودة (الشكل 2 أ). تظهر MDSCs كخلايا أحادية النواة كبيرة عادة مع السيتوبلازم القاعدي الحبيبي (الشكل 2 ب). يظهر مورفولوجيا CTLs في الثقافة في الشكل 2 ج. يمكن تمييز MDSCs المحببة أيضا عن طريق قياس التدفق الخلوي باستخدام استراتيجية بوابات تحدد خلايا HLA-DR / CD14^- و CD33 / CD11b / CD15 ⁺ .

الشكل 2: الخلايا المناعية البشرية المزروعة من PBMCs. صور مجهرية ضوئية تمثيلية ل (أ) الخلايا المتغصنة قبل وبعد بروتوكول النضج ، (ب) الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع ، و (ج) الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا. أشرطة المقياس = 100 ميكرومتر. (د) مخططات كفاف التدفق الخلوي التمثيلية التي توضح علامات الخلايا المناعية. الاختصارات: PBMCs = خلايا الدم المحيطية أحادية النواة. DCs = الخلايا المتغصنة. MDSCs = الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع ؛ CTLs = الخلايا الليمفاوية التائية السامة للخلايا. APC = allophycocyanin. CD = عنقود التمايز; PE = phycoerythrin. H = ارتفاع الذروة. W = عرض الذروة. PerCP = بروتين بيريدين-كلوروفيل. DAPI = 4′,6-diamidino-2-phenylindole; FITC = فلورسين إيزوثيوسيانات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

يوضح التألق المناعي للثقافة المشتركة للخلايا العضوية / المناعية وجود CTLs (CD8 ⁺ ، أخضر) مع عضيات الورم (PD-L1 ⁺ ، أحمر) (الشكل 3A-D). يتم عرض صورة ثلاثية الأبعاد في الفيديو 1. يوضح الفحص المجهري بفاصل زمني هجرة MDSCs و CTLs نحو عضيات المعدة (فيديو 2) والموت العضوي في الثقافات المعالجة بمثبط نقطة التفتيش (فيديو 3).

الشكل 3: الثقافات المشتركة للخلايا العضوية / المناعية لسرطان المعدة. تلطيخ التألق المناعي للثقافة المشتركة العضوية / الخلية المناعية التمثيلية تظهر التعبير عن (A) CD8 ⁺ (أخضر) ، (B) PD-L1 (أحمر) ، و (C) Hoechst (الأزرق) الملطخة بالخلايا. تظهر صورة مدمجة في (D). (ه) تلطيخ التألق المناعي للثقافة المشتركة العضوية / المناعية التمثيلية التي تظهر التعبير عن MDSCs (CD11b ، أخضر) و E cadherin (أحمر). أشرطة المقياس = 50 ميكرومتر. الاختصارات: CD = مجموعة التمايز. PD-L1 = موطن موت الخلية المبرمج 1 ؛ MDSCs = الخلايا المثبطة المشتقة من النخاع ؛ Hoechst = Hoechst 33258. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

فيديو 1: صورة ثلاثية الأبعاد للزراعة المشتركة للخلايا العضوية / المناعية لسرطان المعدة تحتوي على خلايا سرطانية PD-L1 ⁺ (أحمر) والخلايا الليمفاوية CD8 + (أخضر). الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 2: الفحص المجهري بفاصل زمني للزراعة المشتركة للخلايا العضوية / المناعية المقاومة للعلاج بمثبطات نقاط التفتيش. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

فيديو 3: الفحص المجهري بفاصل زمني للزراعة المشتركة للخلايا العضوية / المناعية الحساسة للعلاج بمثبطات نقاط التفتيش. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الفيديو.

الجدول 1: تكوين الوسائط والحلول. الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الجدول.

نقدم استخدام الزراعة المشتركة للخلايا العضوية / المناعية لسرطان المعدة الذاتي المشتق من الإنسان والتي يمكن استخدامها كنموذج قبل السريري للتنبؤ بفعالية العلاجات المستهدفة لتحسين نتائج العلاج وتشخيص المريض في النهاية. على الرغم من الإبلاغ عن الثقافات العضوية المشتركة للسرطان مع الخلايا المناعية ، إلا أن هذا هو التقرير الأول لمثل هذا النظام المشترك لدراسة سرطان المعدة. تم تطوير العديد من جهود توصيف المرضى الأخرى القائمة على الأعضاء بشكل جيد في مؤسسات متعددة ، بما في ذلك نماذج الثقافة المشتركة. هناك ثلاثة أنظمة رئيسية للزراعة المشتركة ، على حد علمنا ، تم تطويرها ، والتي لها الميزات التالية: 1) عضيات سرطان البنكرياس المزروعة بشكل مشترك مع الخلايا المناعية خارج قبة مصفوفة الغشاء القاعدي⁶. سيكون التصاق الخلايا المناعية / السرطانية مهما في نظام يدرس التفاعل بين PD-L1 و PD-1. 2) الثقافات المشتركة للخلايا الذاتية غير الصغيرة في الرئة والقولون والمستقيم للخلايا الليمفاوية العضوية / المحيطية²¹.

أجريت جميع التجارب التي أجريت في هذه الدراسة باستخدام صفائح مطلية بمضاد ل CD28 لتنشيط الخلايا التائية ، وتم إجراء الثقافات المشتركة في وجود إنترلوكين (IL) -2 للحفاظ على تكاثر الخلايا التائية. على الرغم من أن جميع الثقافات المختبرية لها قيود ولا تمثل تماما الظروف الفسيولوجية ، إلا أن خلايا CD8 ⁺ T في هذه الثقافات يتم تنشيطها باستخدام مستضد الورم للمريض والخلايا العارضة للمستضد المتغصني لتنشيط الخلايا التائية. يمكن اعتبار هذا النهج أقرب إلى ما يحدث داخل TME. 3) طريقة واجهة الهواء والسائل (ALI) لنشر العضيات المشتقة من المريض²². يذكر الباحثون أن العضيات كانت تمر كل 14-30 يوما ، وفي بعض الحالات ، تم استكمال الوسيط ب IL-2 البشري المؤتلف. أولا ، تتطلب صيانة الخلايا الليمفاوية CD8 ⁺ T السامة للخلايا وتوسعها أكثر من مجرد إضافة IL-2 إلى الوسائط خارج الجسم الحي. ثانيا ، بالنسبة للثقافة طويلة الأمد للخلايا التائية CD8 ⁺ ، يلزم إجراء CD3 / CD28 أولي متبوعا بصيانة في IL-2 لمدة 2-3 أسابيع. يمكن اعتبار هذا نهجا اصطناعيا لتنشيط الخلايا التائية وليس ذا صلة ب TME.

تستدعي القيود الحالية للثقافات العضوية المشتقة من أنسجة الورم صقل هذه الثقافات بالخلايا المناعية. على سبيل المثال ، تزداد احتمالية غزو الورم بشكل كبير في المرضى الذين يظهرون حجرة لحمية كثيفة ، مثل تلك التي لوحظت في سرطان المعدة^{الغازي 23}. وبالتالي ، قد يكون من الصعب عزل الخلايا المناعية وثقافتها العضوية من أنسجة ورم المريض الأصلي ذات الحيز اللحمي الكثيف ، خاصة في المرضى الذين يعانون من سوء التشخيص. الأهم من ذلك ، أظهرت بيانات تسلسل الحمض النووي الريبي المنشورة أنه على الرغم من وجود تشابه ظاهري بين العضيات وأنسجة ورم المريض ، إلا أن حجرة المناعة تفتقد^{بشكل أساسي إلى 24}. وبالتالي ، فإن أحد قيود الثقافات العضوية وخط الخلايا الحالية هو نقص المكون المناعي الموجود داخل TME الخاص بالمريض.

تشمل الخطوات الحاسمة في البروتوكول توليد مزرعة عضية قوية وخلايا مناعية. المشكلة الأكثر شيوعا التي لوحظت مع الثقافات العضوية المشتقة من المريض هي التلوث البكتيري أو الفطري. وبالتالي ، من الأهمية بمكان أيضا تضمين العوامل المضادة للفطريات والمضادات الحيوية عند غسل الأنسجة قبل الهضم. هناك أيضا قيود على الثقافة التي سيتم تناولها في التجارب المستقبلية. أولا ، يمكن اعتبار عدم تجانس الثقافات العضوية قيدا عند التحقيق في مجموعة الخلايا المحددة التي تستهدفها العلاجات المناعية والعلاجات الكيميائية. غالبا ما يكون من الصعب تحديد ما إذا كانت عضوية واحدة نسيلة ومشتقة من خلية واحدة. قد يكون النهج المستقبلي هو استخدام نهج تحليلي أحادي الخلية لاستكمال التجارب المختبرية التي تختبر العلاجات المستهدفة. ثانيا ، قد لا يعكس عدم تجانس الخلايا داخل المزرعة البيئة الدقيقة للورم للمريض. يمكن زيادة تعقيد هذه الثقافات من خلال دمج خلايا أساسية إضافية ، بما في ذلك الضامة والخلايا الليفية المرتبطة بالسرطان. ومع ذلك ، فقد تم استخدام الزراعة المشتركة للخلايا العضوية / المناعية هنا للتحقيق في سؤال بحثي مركز فيما يتعلق بالورم الأساسي وتفاعلات الخلايا المناعية ذات الصلة بدور MDSCs كخلايا مثبطة للمناعة. ثالثا ، يتم جمع العينات من موقع الورم الأساسي. يتم جمع الأنسجة بناء على قرار أخصائي علم الأمراض. ستركز الأبحاث المستقبلية على العضيات المشتقة من المواقع النقيلية ، والتي قد تسمح لنا بفك تشفير الاختلافات في عضيات السرطان بناء على الموقع الذي تم جمع الأنسجة منه. بشكل عام ، قد يكون نظام الثقافة هذا ذا أهمية واسعة ومناسب للتنبؤ بفعالية العلاج ونتائج المريض في سرطانات الجهاز الهضمي الأخرى ، بما في ذلك القولون والبنكرياس.

المؤلفون ليس لديهم ما يكشفون عنه.

تم دعم هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIAID) 5U19AI11649105 (PIs: Weiss and Wells ، قائد المشروع 1: Zavros) و NIH (NIDDK) 2 R01 DK083402-06A1 (PI: Zavros). تم دعم هذا المشروع جزئيا من قبل PHS Grant P30 DK078392 (Integrative Morphology Core) للمركز الأساسي لأبحاث أمراض الجهاز الهضمي في سينسيناتي و 5P30CA023074 مركز السرطان بجامعة أريزونا - منحة دعم مركز السرطان (PI: Sweasy). نود أن نتوجه بالمساعدة التي قدمها Chet Closson (Live Microscopy Core ، جامعة سينسيناتي) والأعضاء السابقين في مختبر Zavros ، الدكتورة نينا ستيل ولورن هولوكاي ، لمساهمتهم في تطوير نظام الاستزراع العضوي. نشكر بصدق المرضى الذين وافقوا على التبرع بالأنسجة والدم لتطوير المزارع المشتركة للخلايا العضوية / المناعية في المعدة. بدون استعدادهم للمشاركة في الدراسة ، لن يكون هذا العمل ممكنا.