Desarrollamos un método cromatográfico rápido que separa los componentes de la reacción IVT y se puede utilizar para monitorear el consumo de NTP y la producción de ARNm. Con este método podemos optimizar la reacción IVT, maximizar el rendimiento del ARNm y minimizar la formación de impurezas del proceso y el costo de la reacción. Nuestra metodología fue pionera en el campo del ARNm, mostrando cómo el acoplamiento de los datos analíticos de la reacción IVT puede conducir a mayores rendimientos y menores costos.
El campo ahora está explorando otras herramientas analíticas de procesos en línea, como la espectroscopia Raman, pero la cromatografía aún conserva un lugar fundamental debido a su poder de resolución y alta velocidad. Mostramos cómo capturar herramientas analíticas de alto rendimiento con el diseño de software de experimentos para realizar una optimización integral de la reacción IVT. Esto condujo a un rendimiento más alto de cada informe de la reacción IVT de 25 gramos por litro.
Nuestro método permite monitorear las concentraciones de ARNm y NTP simultáneamente con tiempos de lectura cortos, por lo tanto, es adecuado para el monitoreo de IVT casi en tiempo real. El campo del ARNm se está moviendo hacia la fabricación continua de ARNm y, por supuesto, estamos desarrollando herramientas de próxima generación para respaldar esta transición. Para empezar, descongele y precaliente todos los reactivos, excepto las enzimas, a 37 grados centígrados durante 15 minutos en un termobloque ajustado a 300 revoluciones por minuto.
Marque cada tubo con un número y un punto de tiempo designados para la transcripción in vitro o IVT. Mientras se descongelan los reactivos, pipetee dos microlitros de EDTA de 100 milimolares en tubos estériles de 0,5 mililitros. Ahora retire las enzimas del congelador y guárdelas temporalmente en una hielera.
Prepare de 50 a 100 microlitros de la mezcla de reacción con volúmenes apropiados de reactivos IVT. Agregue la ARN polimerasa T7 como último reactivo cuando se mezclen todos los reactivos IVT. Retire inmediatamente dos microlitros de la mezcla IVT y pipetee en tubos de 0,5 mililitros previamente preparados que contengan dos microlitros de EDTA.
Coloque los tubos de reacción que contienen mezclas de IVT en el bloque térmico e incube a 37 grados centígrados. En cada punto de tiempo deseado, extraiga dos microlitros de la muestra de IVT de la mezcla de reacción y pipetee en tubos que contengan EDTA. Después de que el análisis cromatográfico confirme el agotamiento completo de los NTP, enfríe las reacciones de IVT a granel con EDTA hasta una concentración final de 50 milimolares.
Para la reacción IVT Fed-Batch, mezcle las existencias de cada NTP y cloruro de magnesio. Después de configurar la reacción, cuando la concentración de NTP caiga por debajo del 10%, agregue un volumen apropiado del alimento a la reacción IVT a granel. Una vez que se logra la producción de ARNm deseada, inactive toda la reacción con EDTA hasta una concentración final de 50 milimolares.
Para el acondicionamiento de la columna, equilibre una columna analítica de 0,1 mililitros a temperatura ambiente durante 12 horas antes del análisis. Fije la columna al sistema cromatográfico, siguiendo las instrucciones indicadas en la carcasa de la columna. A continuación, enjuague la columna con 50 volúmenes de columna de agua destilada doble seguidos de 50 volúmenes de columna de MPA a un caudal de un mililitro por minuto.
A continuación, ejecute al menos tres muestras en blanco inyectando solo MPA antes del análisis para establecer la línea de base. Ahora proceda a analizar la muestra de prueba de idoneidad del sistema y las muestras de la curva de calibración. Para la prueba de idoneidad del sistema, combine los NTP del reactivo de taponamiento, la plantilla de ADN plasmídico y el ARNm.
Ahora cree el estándar de calibración utilizando la muestra de ARNm purificada diluida de concentración conocida con fase A móvil. Si es necesario, cree patrones con concentraciones finales de NTP de 0,5, dos, cinco, 10, 15 y 20 micromolares para generar la curva de calibración para todos los NTP. Determine la dilución mínima necesaria para las muestras de IVT utilizando la fórmula. Antes de diluir para el análisis cromatográfico, agite y centrifuga la muestra de IVT templada.
Pipetee el MPA y el cloruro de sodio en un vial de vidrio cónico, luego agregue la muestra de IVT apagada. Agite la muestra preparada y cárguela en el muestreador automático, ajustado a cuatro grados centígrados. Inyecte 25 microlitros de la muestra diluida en la columna analítica y mida la absorbancia a 260 y 280 nanómetros para cada muestra IVT.
Después de completar el análisis de todas las muestras de IVT, vuelva a inyectar el estándar de prueba de idoneidad del sistema para confirmar la estabilidad del sistema. La analítica rápida en línea permite controlar la producción de ARNm a lo largo del tiempo. En este experimento, comparamos la influencia de la composición del tampón IVT en la cinética del IVT.
La IVT realizada con el tampón A resultó en la tasa más alta de producción de ARNm, seguida del tampón B y el tampón C. La reacción de IVT también se puede realizar como un lote alimentado. El monitoreo del consumo de NTP permite ajustar la concentración mediante la alimentación de NTP y cloruro de magnesio a la reacción. Debido a que las adiciones de alimento diluyen la reacción de IVT, la concentración de ARNm en IVT disminuye en cada edición de alimento.
