使用色谱旁在线监测优化用于 mRNA 生产的 体外 转录反应

我们开发了一种快速色谱方法，可分离 IVT 反应组分，可用于监测 NTP 消耗和 mRNA 产生。使用这种方法，我们可以优化 IVT 反应，最大限度地提高 mRNA 产量，同时最大限度地减少工艺杂质的形成和反应成本。我们的方法在 mRNA 领域是开创性的，展示了 IVT 反应的偶联分析数据如何导致更高的产量和更低的成本。

该领域目前正在探索其他在线过程分析工具，例如拉曼光谱，但由于其分离能力和高速，色谱法仍然保持着关键地位。我们展示了如何通过实验软件的设计捕获高通量分析工具，以全面优化 IVT 反应。这导致 IVT 反应的每次报告的最高产量为 25 克/升。

我们的方法可以同时监测 mRNA 和 NTP 浓度，读数时间短，因此适用于近乎实时的 IVT 监测。mRNA 领域现在正朝着 mRNA 的持续生产方向发展，我们当然正在开发下一代工具来支持这一转变。首先，将除酶外的所有试剂在 37 摄氏度下以每分钟 300 转的速度在热模块中预热 15 分钟。

用指定的体外转录或 IVT 编号和时间点标记每个试管。当试剂解冻时，将两微升 100 毫摩尔 EDTA 移液到 0.5 毫升无菌管中。现在从冰箱中取出酶并暂时存放在冷却器中。

用适当体积的 IVT 试剂制备 50 至 100 微升的反应混合物。当所有 IVT 试剂混合时，添加 T7 RNA 聚合酶作为最后试剂。立即取出两微升 IVT 混合物，并将其移液到先前制备的含有两微升 EDTA 的 0.5 毫升试管中。

将含有 IVT 混合物的反应管放入热块中，并在 37 摄氏度下孵育。在每个所需的时间点，从反应混合物中取出两微升 IVT 样品，然后移液到含有 EDTA 的试管中。在色谱分析确认 NTP 完全耗尽后，用 EDTA 淬灭本体 IVT 反应至终浓度为 50 毫摩尔。

对于补料分批 IVT 反应，混合每种 NTP 和氯化镁的储备液。设置反应后，当 NTP 浓度降至 10% 以下时，向本体 IVT 反应中加入适当体积的补料。一旦达到所需的 mRNA 生成，用 EDTA 灭活整个反应，使其终浓度为 50 毫摩尔。

对于色谱柱老化，在分析前，将 0.1 mL 分析柱在室温下平衡 12 小时。按照色谱柱外壳上指示的方向将色谱柱连接到色谱系统。然后用 50 个柱体积的双蒸水冲洗色谱柱，然后以每分钟 1 毫升的流速冲洗 50 个柱体积的 MPA。

然后，在分析前运行至少三个仅注入 MPA 的空白样品以建立基线。现在继续分析系统适用性测试样品和校准曲线样品。对于系统适用性测试，将加帽试剂 NTP、质粒 DNA 模板和 mRNA 混合。

现在使用已知浓度的稀释纯化 mRNA 样品和流动相 A 创建校准标准品，如果需要，创建最终 NTP 浓度为 0.5、2、5、10、15 和 20 μmol 的标准品，以生成所有 NTP 的校准曲线。使用公式确定 IVT 样品所需的最小稀释度。在稀释用于色谱分析之前，涡旋并离心淬灭的 IVT 样品。

将 MPA 和氯化钠移液到锥形玻璃瓶中，然后加入淬灭的 IVT 样品。涡旋制备的样品并将其加载到自动进样器中，设置为 4 摄氏度。将 25 μL 稀释样品注入分析柱上，并测量每个 IVT 样品在 260 和 280 nm 处的吸光度。

完成所有 IVT 样品的分析后，再次进样系统适用性测试标准品，以确认系统稳定性。快速在线分析允许监测 mRNA 随时间推移的产生。在本实验中，我们比较了 IVT 缓冲液组成对 IVT 动力学的影响。

使用缓冲液 A 进行 IVT 导致最高的 mRNA 产生率，其次是缓冲液 B 和缓冲液 C.IVT 反应也可以作为补料分批进行。监测 NTP 的消耗量允许通过向反应中加入 NTP 和氯化镁来调整浓度。由于补料添加会稀释 IVT 反应，因此 IVT 中的 mRNA 浓度在每个补料版本都会下降。