Dado que la neurona nociceptora secreta varios neuropéptidos y que las células NK expresan el receptor para estos neuropéptidos, decidimos idear un método de cocultivo para estudiar la interacción entre la célula NK y las neuronas nociceptoras. Tal método reduccionista podría ser útil para estudiar cómo la neurona nociceptora controla la función antitumoral de las células NK, y también podría ser interesante estudiar cómo las células NK controlan la eliminación de las neuronas lesionadas. Demostrando el procedimiento estará Ali Ahmadi, un ex estudiante de maestría de mi laboratorio.
Para comenzar el aislamiento y cultivo de células asesinas naturales o NK, recolecte el bazo de ratón en un tubo de microcentrífuga de 1.5 mililitros que contenga 500 microlitros de PBS estéril, luego homogeneice el bazo usando un mortero. A continuación, diluya las células con un mililitro de PBS estéril y filtre la mezcla a través de un filtro de células de 50 micras en un tubo cónico de 50 mililitros. Rellene el volumen de homogeneización filtrada a 10 mililitros utilizando PBS estéril.
Cuente las células en 10 microlitros del homogeneizado diluido usando un hemocitómetro. Centrifugar las células restantes durante cinco minutos a 500 G y retirar el sobrenadante. Luego resuspenda las células de 10 a octavas células por mililitro en medio RPMI 1640 suplementado.
Purificar magnéticamente las células NK del bazo utilizando un kit de aislamiento de células NK de ratón y confirmar la pureza de las células NK mediante citometría de flujo. Contar las células con un hemocitómetro, seguido de centrifugación a los cinco minutos a 500 G, luego retirar el sobrenadante. Para estimular las células NK granuladas, resuspender estas células en medio de cultivo RPMI 1640 suplementado con IL-2 e IL-15.
Cultivo dos veces de 10 a la sexta células NK por mililitro en una placa de fondo en U de 96 pocillos durante 48 horas. 24 horas antes de la estimulación de las células NK, cubra la placa de 96 pocillos con 100 microlitros por pocillo de laminina e incube durante 45 minutos a 37 grados centígrados. Después de la incubación, retire la solución y deje que los pocillos se sequen al aire en el gabinete de bioseguridad.
A continuación, asegure el ratón sacrificado en el tablero en una posición prona. Levante la piel e incise la piel a lo largo de la columna dorsal. Cortar la articulación lumbosacra y separar el sacro de la columna lumbar con tijeras.
Luego separe la columna vertebral cortando los músculos y las costillas en ambos lados en la dirección craneal hasta que se alcance la base del cráneo. Use tijeras para cortar la columna vertebral en la articulación atlantooccipital. A continuación, retire el músculo y el tejido graso de la columna vertebral.
Fije y abra la columna vertebral para extirpar la médula espinal antes de obtener acceso al ganglio de la raíz dorsal o DRG en los agujeros intervertebrales conectados a la médula espinal a través de la raíz dorsal. A continuación, coseche los DRG en un tubo cónico de 15 mililitros lleno de 10 mililitros de DMEM suplementado con hielo frío. A continuación, centrifugar la preparación durante cinco minutos a 200 g a temperatura ambiente y retirar el sobrenadante.
Agregue 250 microlitros de PBS que contengan un miligramo por mililitro de colagenasa IV y 2.4 unidades por mililitro de dispasa II.Incubar este DRG con solución de colagenasa-dispasa durante 80 minutos con agitación suave. Para inactivar las enzimas, añadir cinco mililitros de medio DMEM suplementado y centrifugar la solución a 200 G.Después de cinco minutos, retire suavemente el sobrenadante con una pipeta y deje alrededor de 100 microlitros del sobrenadante para evitar la pérdida celular no deseada. A continuación, agregue un mililitro de medio DMEM suplementado a las celdas y use una pistola de pipetas y tres pipetas Pasteur de vidrio de tamaños decrecientes para triturar suavemente el DRG en una sola preparación de celda.
Mientras trabaja en un gabinete de bioseguridad, diluya la albúmina sérica bovina o BSA en PBS estéril a una concentración final del 15% y almacene alícuotas de un mililitro a menos 20 grados centígrados. Para crear un gradiente de BSA en un tubo cónico de 15 mililitros, agregue dos mililitros de PBS estéril y luego dispense lentamente un mililitro de solución de BSA al 15% en el fondo del tubo. Evite interrumpir el gradiente retirando suavemente la pipeta.
Con una pipeta P200, agregue la suspensión de ganglios triturados que contiene las neuronas en el lado del tubo en el gradiente. A continuación, ajuste la aceleración y la desaceleración como mínimo para centrifugar la neurona que contiene el gradiente BSA durante 12 minutos a 200 G.Después de la centrifugación, retire todo el sobrenadante con una pipeta y resuspenda las células en 500 microlitros de Neurobasal. Placa 10, 000 neuronas por pocillo en una placa de 96 pocillos de fondo plano recubierta de laminina.
Para permitir la unión de las neuronas, incubar la placa de 96 pocillos durante la noche a 37 grados centígrados. Para comenzar el co-cultivo, retire lentamente el Neurobasal del cultivo neuronal. Después de 48 horas de estimulación con IL-2 e IL-15, resuspender las células NK y agregar 10 a la quinta célula NK por pocillo al cultivo neuronal.
Co-cultivo de las células en MX neurobasal suplementado a 37 grados centígrados. Después de 48 horas, recolecte y lave las células tres veces con PBS y centrifugarlas durante cinco minutos a 500 G a cuatro grados centígrados. Deseche el sobrenadante antes de teñir las células con uno a 1, 000 colorante de viabilidad diluido eFluor 780 durante 15 minutos a cuatro grados centígrados.
Lave y centrifuga las células como se demuestra, seguido de tratamiento con CD 1632 durante 15 minutos a cuatro grados centígrados para bloquear sitios no específicos en las células, seguido de recoger y lavar las células con PBS tres veces. Después del siguiente ciclo de lavado y centrifugación, tiñe las células con BV421, anti-NK-1.1, isotiocianato de fluoresceína anti-NKp46 y ficoeritrina anti-GM-CSF durante 15 minutos. Una vez más, recolecte y lave las células tres veces con PBS, centrifugarlas y deseche el sobrenadante, luego resuspenda las células en 500 microlitros de tampón FACS e inmunofenotipe las células NK usando citometría de flujo.
Cuando se cultivaron solas, las células NK expresaron niveles basales de factor estimulante de colonias de granulocitos macrófagos o GM-CSF y NKp46. Cuando se co-cultivó con neuronas DRG cosechadas de ratones nociceptores intactos, la estimulación de capsaicina disminuyó la expresión de células NK de GM-CSF. La capsaicina no tuvo impacto en las activaciones de las células NK cuando se cocultivó con neuronas DRG cosechadas de ratones ablacionados con nociceptores.
El nivel de NKp46 no se vio afectado. Los pasos clave en este protocolo son la disociación y el aislamiento de DRG. La idea es mantener la máxima viabilidad neuronal evitando hacer burbujas y utilizando la pipeta del tamaño adecuado.
Después del protocolo, el investigador puede usar la secuenciación de ARN o qPCR para medir el cambio de transcripción en las células purificadas de FACS, o puede usar ELISA para medir la secreción de citoquinas o neuropéptidos. Tal interacción revela que la función de las células NK probablemente esté sintonizada por la neurona nociceptora. Y esta diafonía puede ser importante en procesos biológicos que van desde lesiones nerviosas, infecciones bacterianas y virales, hasta neoplasias malignas.
